第三章-環(huán)境毒理學(xué)的基本研究方法

第三章

環(huán)境毒理學(xué)的基本探討方法毒理學(xué)試驗(yàn)調(diào)查探討毒理學(xué)

試驗(yàn)基礎(chǔ)

探討方法流行病學(xué)探討受控的臨床探討毒理學(xué)體內(nèi)試驗(yàn)毒理學(xué)體外試驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)·真實(shí)的暴露條件·規(guī)定的限定暴露條·易于限制暴露條件·影響因素少，易于控·在各化學(xué)物之間發(fā)生相·在人群中測(cè)定反應(yīng)·能測(cè)定多種效應(yīng)制互作用·對(duì)某組人群(如哮喘)·能評(píng)價(jià)宿主特征的作用·可進(jìn)行某些深化的研·測(cè)定在人群的作用的探討是有力的(如：性別、年齡、遺究(如：機(jī)制，代謝)·表示全部的人敏感性·能測(cè)定效應(yīng)的強(qiáng)度傳特征等和其他調(diào)控因·人力物力花費(fèi)較少素飲食等)·能評(píng)價(jià)機(jī)制缺點(diǎn)·耗資、耗時(shí)多·耗資多·動(dòng)物暴露與人暴露相關(guān)·不能全面反映毒作用·多為回顧性，無(wú)健康·較低濃度和較短時(shí)的不確定性不能作為毒性評(píng)價(jià)和愛護(hù)間的暴露·受控的飼養(yǎng)條件與人的危急性評(píng)價(jià)的最終依·難以確定暴露，有混雜·限于較少量的人群實(shí)際狀況不一樣據(jù)暴露問(wèn)題(一般<50)·暴露的濃度和時(shí)間的?！るy以視察慢性毒作用·可檢測(cè)的危急性增加必·限于短暫、微小、式顯著地不同于人群的需達(dá)到2倍以上可逆的效應(yīng)暴露·測(cè)定指標(biāo)較粗(發(fā)病率，·一般不適于探討最死亡率)敏感的人群毒理學(xué)探討方法的優(yōu)缺點(diǎn)1試驗(yàn)動(dòng)物和人對(duì)外源化學(xué)物的反應(yīng)敏感性不同，有時(shí)甚至存在著質(zhì)的差別2高劑量向低劑量外推的不確定性3小數(shù)量試驗(yàn)動(dòng)物到大量人群外推的不確定性4成年健康動(dòng)物向年老體弱及患病個(gè)體外推的不確定性試驗(yàn)動(dòng)物的毒理學(xué)試驗(yàn)資料外推到人群接觸的平安性時(shí)的不確定性1化學(xué)物在試驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生的作用，可以外推于人?；炯僭O(shè)①人是最敏感的動(dòng)物物種；②人和試驗(yàn)動(dòng)物的生物學(xué)過(guò)程與體重(或體表面積)相關(guān)。2試驗(yàn)動(dòng)物必需暴露于高劑量，這是發(fā)覺(jué)對(duì)人潛在危害的必需的和牢靠的方法。

3成年的健康(雄性和雌性未孕)試驗(yàn)動(dòng)物和人可能的暴露途徑是基本的選擇。描述毒理學(xué)試驗(yàn)的基本原則1受試物毒作用的表現(xiàn)和性質(zhì)

2劑量—反應(yīng)(效應(yīng))探討

3確定毒作用的靶器官

4確定損害的可逆性毒理學(xué)毒性評(píng)價(jià)試驗(yàn)的基本目的試驗(yàn)動(dòng)物（laboratoryanimal）指經(jīng)人工培育，對(duì)其攜帶微生物實(shí)行限制，遺傳背景明確，來(lái)源清晰，可用于科學(xué)探討的動(dòng)物。試驗(yàn)動(dòng)物的選擇試驗(yàn)動(dòng)物的選擇物種選擇

選擇對(duì)外液化學(xué)物的毒性反應(yīng)及代謝特點(diǎn)與人類接近的物種；選擇自然壽命不太長(zhǎng)的物種；選擇易于飼養(yǎng)和試驗(yàn)操作的物種；選擇經(jīng)濟(jì)并易于獲得的物種。

近交系動(dòng)物連續(xù)20代以上兄妹交配或親子交配培育突變系動(dòng)物突變的基因可世代相傳并保持遺傳基因特性雜交群動(dòng)物兩個(gè)不同近交系之間有目的進(jìn)行交配，所產(chǎn)生的第一代動(dòng)物，亦稱雜交一代動(dòng)物。封閉群動(dòng)物5年以上不從外部引進(jìn)新血緣，僅由同一品系的動(dòng)物在固定場(chǎng)所保存繁殖的動(dòng)物群

試驗(yàn)動(dòng)物的選擇品系選擇無(wú)菌動(dòng)物體內(nèi)外均無(wú)任何微生物和寄生蟲無(wú)特定病原體動(dòng)物（SPF）體內(nèi)無(wú)特定微生物和寄生蟲存在的動(dòng)物(無(wú)傳染病)。飼養(yǎng)于封閉的系統(tǒng)。清潔動(dòng)物與SPF的不同：抗體檢查常有腦脊髓炎病毒、鼠肝炎病毒等抗體滴度，但不應(yīng)有臨床癥狀、病理變更及自然死亡。飼養(yǎng)在半屏蔽系統(tǒng)。微生物限制的選擇試驗(yàn)動(dòng)物的選擇個(gè)體選擇

1年齡2性別3生理狀態(tài)4健康狀況

試驗(yàn)動(dòng)物的選擇

品系周齡 Wistar SD 雌性 雄性 雌性 雄性 3 54 56 50 52 4 91 97 86 101 5 134 134 130 150 6 166 187 172 206 7 209 233 210 262 8 214 297 240 318 9 232 325 258 365 10 246 370 272 399 大鼠體重與周齡的關(guān)系

小鼠體重與周齡的關(guān)系

品系周齡 昆明 BALB/c C57BL/6 615 雌性 雄性 雌性 雄性 雌性 雄性 雌性 雄性

0 1.95 2.10 1.40 1.46 1.40 1.44 1.58 1.58 1 5.54 5.82 3.35 3.50 3.42 3.50 4.64 4.64 2 7.90 8.35 5.50 5.60 5.55 5.60 7.96 7.96 3 13.55 14.80 7.32 7.40 6.40 6.90 9.83 9.83 4 21.35 22.60 11.60 12.45 12.20 12.57 15.75 19.00 5 27.90 33.25 14.75 16.10 16.90 18.10 20.75 22.58 6 32.80 39.25 15.60 17.40 18.40 20.50 21.88 25.96 7 34.70 39.90 16.10 18.65 19.00 21.60 23.12 27.96 8 34.80 40.05 18.16 20.25 20.25 22.40 24.16 28.83 1未處理比照組(空白比照組)：本底值，質(zhì)量限制2陰性(溶劑／賦形劑)比照：與染毒組比較的基礎(chǔ)3陽(yáng)性比照：檢測(cè)試驗(yàn)體系的有效性4歷史性比照：檢查試驗(yàn)體系的穩(wěn)定性，即進(jìn)行試驗(yàn)室質(zhì)量限制和保證

毒理學(xué)試驗(yàn)常用比照對(duì)各個(gè)毒理學(xué)試驗(yàn)應(yīng)當(dāng)用同一種、同一批號(hào)受試物受試物成分和配方必需固定

如是異構(gòu)體混合物，異構(gòu)體比例必需固定

活性成分的百分含量和可檢測(cè)的雜質(zhì)的濃度也應(yīng)固定

受試物在貯存期內(nèi)穩(wěn)定性和在飼料中的穩(wěn)定性必需進(jìn)行探討并報(bào)告

受試物應(yīng)一次備齊全部試驗(yàn)的用量受試樣品毒理學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)要求隨機(jī)、重復(fù)、比照原則對(duì)常規(guī)毒理學(xué)試驗(yàn)資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料：一般用t檢驗(yàn)或ANOVA記數(shù)資料：卡方檢驗(yàn)毒理學(xué)試驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)1處理組與比照組比較差別有無(wú)顯著性2有無(wú)劑量-反應(yīng)關(guān)系3是否伴有其他相關(guān)參數(shù)的變更4是否在“正常”值范圍試驗(yàn)結(jié)果的推斷第一節(jié)急性毒性試驗(yàn)一、急性毒性試驗(yàn)的目的：1、確定供試化學(xué)物急性毒性的劑量—反應(yīng)關(guān)系和中毒特征；2、求LD50或LC50,為急性毒性評(píng)價(jià)供應(yīng)依據(jù)。3、探討毒物的毒動(dòng)學(xué)和毒效學(xué)過(guò)程。表示急性毒性大?。?/p>

LD50(對(duì)受試物的個(gè)體感受性影響較小，有更高的重現(xiàn)性)二、試驗(yàn)程序與評(píng)價(jià)1．動(dòng)物選擇：首選受試物在體內(nèi)代謝狀況與人體內(nèi)相近的或?qū)κ茉囄镒蠲舾械钠废?。一般：以哺乳?dòng)物為主，常用大鼠、小鼠；經(jīng)皮：兔、豚鼠、豬應(yīng)對(duì)兩種性別、成年和幼年動(dòng)物進(jìn)行測(cè)定。選擇兩種以上的試驗(yàn)動(dòng)物，最好一為嚙齒類，一為非嚙齒類。(目的：核對(duì)種間差異)2．染毒途徑與方式：一般與人的接觸途徑相同。(1)經(jīng)口染毒：常用灌胃法，也可將受試物放在飲水中由動(dòng)物自由攝取。(2)經(jīng)呼吸道染毒：將試驗(yàn)動(dòng)物放在有毒氣或粉塵的染毒柜內(nèi)進(jìn)行染毒。急性吸入染毒接受靜式染毒瓶(柜)，染毒2—4h。(3)經(jīng)皮膚染毒：主要用于化學(xué)物經(jīng)皮(或粘膜)吸取所引起的急性毒性。正式給藥前24h，背部脫毛，勿傷皮膚。將受試物勻整涂布于皮膚表面，用紗布覆蓋，共敷24h。3．試驗(yàn)程序：（1）劑量與分組①預(yù)試驗(yàn)：找出受試物大致致死量范圍(死亡率為10%~90%)；例：欲做化合物A的經(jīng)口預(yù)試驗(yàn)?；衔顱的化學(xué)結(jié)構(gòu)與A相像，已知B的=LD50=40(預(yù)期毒性中值)。則預(yù)試驗(yàn)取2.5、10、40、160、640(上下各推1~2組，組距應(yīng)較大，初始4倍差)

③求LD50正式試驗(yàn)：在LD100與LD0之間設(shè)5—7個(gè)劑量組。

組距(對(duì)數(shù))

或式中：n------設(shè)計(jì)的劑量組數(shù)（2）癥狀視察時(shí)間：24h或兩周內(nèi)的反應(yīng)三、LD50的計(jì)算與結(jié)果評(píng)價(jià)

計(jì)算方法：概率單位法和寇氏法。LD50值愈小，毒性愈大。概率單位法存在正態(tài)曲線關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)差d=(x-μ)/δ式中：x——?jiǎng)┝繉?duì)數(shù)；μ——?jiǎng)┝繉?duì)數(shù)均數(shù)δ——標(biāo)準(zhǔn)差d=0，左邊面積(死亡率)為50％，右邊面積(存活率)50％d=1，死亡率為84.13％，d=2，死亡率為97.73％,d＞2，死亡率接近100％。d=一1，死亡率為15.87％。d=一2，死亡率為2.27％。d＜一3，死亡率接近0。從上表，可以任一死亡率換算為相應(yīng)的概率單位。A：劑量對(duì)數(shù)~死亡百分率B：劑量對(duì)數(shù)~概率單位LC50計(jì)算步驟如下：a.依據(jù)死亡率查概率單位(死亡率為100％或0％不計(jì))b.繪圖求回來(lái)方程。c.求y=5的濃度對(duì)數(shù)（m），其反對(duì)數(shù)即為L(zhǎng)C50y=2.78x-2.76同理可得LC5、LC10、……d.求LC50的可信限先求LC50的標(biāo)準(zhǔn)誤差(Sm)：S(校準(zhǔn)差)=1/k本例中：S=1/2.78

平均致死量法（又名寇氏法）

試驗(yàn)要求：①每個(gè)試驗(yàn)組動(dòng)物數(shù)相同；②各組劑量按等比級(jí)數(shù)分組；③最大劑量的死亡率最好為100％或與之接近，最小劑量的死亡率最好為0％或與之接近。式中：Xm——最大劑量的對(duì)數(shù)值；i—相鄰劑量比值的對(duì)數(shù)；——各組死亡率的總和（以小數(shù)表示）。例小鼠腹腔注射致百蟲急性毒性試驗(yàn)結(jié)果如下表所示，求LD50式中：p——一個(gè)組死亡率；q——一個(gè)組存活率；i——相鄰劑量比值的對(duì)數(shù)；h——各組動(dòng)物數(shù)。其次節(jié)亞慢性和慢性毒性試驗(yàn)一、蓄積試驗(yàn)及其方法：（一）蓄積作用：某些物質(zhì)以較小劑量反復(fù)作用于機(jī)體，可使機(jī)體對(duì)該物質(zhì)的反應(yīng)性增加，即一次染毒不引起明顯中毒反應(yīng)或死亡的劑量，經(jīng)分次重復(fù)染毒后，可引起明顯中毒或死亡，此種現(xiàn)象稱為蓄積作用(accumulation)?？煞謨煞N：物質(zhì)蓄積：毒物在體內(nèi)的排出量小于進(jìn)入量，以致毒物在體內(nèi)的貯留量增多為物質(zhì)蓄積；功能蓄積：毒物進(jìn)入機(jī)體后，并未發(fā)覺(jué)在體內(nèi)明顯貯留，但可引起機(jī)體功能變更的漸漸累積，導(dǎo)致對(duì)該毒物的反應(yīng)性增加。耐受性(tolerance)：機(jī)體多次接觸化學(xué)物質(zhì)后．對(duì)該物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)性減弱的現(xiàn)象，顯示不易發(fā)生慢性中毒。

（二）蓄積作用的測(cè)定方法有多種，常用蓄積系數(shù)法。蓄積系數(shù)(accumulationcoefficient)K：

ED50(n)——多次染毒使半數(shù)動(dòng)物出現(xiàn)某種效應(yīng)的總劑量;ED50(1)——一次染毒引起同一效應(yīng)半數(shù)效量。若以死亡為毒效應(yīng)指標(biāo)，上式為K越小，受試化合物的蓄積毒性越大。K蓄積作用強(qiáng)度＜1高度蓄積1~3明顯蓄積3~5中度蓄積＞5輕度蓄積1．固定劑量法：固定每天染毒劑量為1/20—1/5LD50，連續(xù)染毒，直至試驗(yàn)動(dòng)物半數(shù)死亡。假如染毒劑量累計(jì)已達(dá)5個(gè)LD50動(dòng)物死亡仍末達(dá)半數(shù)，試驗(yàn)均可告結(jié)束，計(jì)算蓄積系數(shù)，作出評(píng)價(jià)。2．遞增劑量法：先測(cè)定LD50（1），然后對(duì)另一組動(dòng)物每天染毒，以4天為一期，起先賜予0.1LD50。以后每期按1.5倍遞增劑量，直至動(dòng)物半數(shù)死亡，或試驗(yàn)已達(dá)28天，可結(jié)束試驗(yàn)，計(jì)算系數(shù)。3.二十天試驗(yàn)法：選用大鼠或小鼠每個(gè)劑量組雌雄各10只，以1/2、l/5、1/10、1/20LD50分別對(duì)每組進(jìn)行染毒，每日1次，共20天。如l/20LD50組動(dòng)物有死亡，且有劑量—反應(yīng)關(guān)系，則有較強(qiáng)蓄積作用；如1/20LD50組無(wú)死亡，則為弱蓄積。蓄積系數(shù)的測(cè)定二、亞慢性毒性作用及其試驗(yàn)方法：1、目的：確定化學(xué)物亞慢性毒性的閾劑量和NOEL。2、試驗(yàn)期限：3-6月；呼吸道吸?。?0-90天；皮膚毒性：30天。3、試驗(yàn)動(dòng)物的選擇、飼養(yǎng)環(huán)境及染毒途徑：試驗(yàn)動(dòng)物選擇：對(duì)受試化學(xué)物敏感的物種或品系；環(huán)境：養(yǎng)分合理，飲水清潔、足夠、溫、光、濕適宜；染毒途徑：盡量模擬人類在環(huán)境中接觸受試化學(xué)物的途徑，與急性毒性試驗(yàn)相像。4、劑量選擇與分組劑量：1／80—I／50LD50，對(duì)于在體內(nèi)不產(chǎn)生蓄積作用而排泄又快的物質(zhì)可適當(dāng)加大劑量，反之則可削減劑量。設(shè)3—4個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)比照組。試驗(yàn)組要求：在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)最低劑量組不產(chǎn)生可視察到的毒性反應(yīng)；最高劑量組能引起明顯毒性反應(yīng)，但不引起死亡；中間劑量組產(chǎn)生稍微毒性反應(yīng)。5、癥狀視察一般性指標(biāo)(非特異)①一般綜合性指標(biāo)：動(dòng)物體重增長(zhǎng)率、食物消耗率、活動(dòng)實(shí)力等。②一般化驗(yàn)性指標(biāo)：主要指血和肝、腎功能的檢測(cè)。(2)特異指標(biāo)：測(cè)定特異性反應(yīng)。更準(zhǔn)確闡明該物質(zhì)的閾劑量(濃度)及無(wú)作用劑量(濃度)。(3)病理組織學(xué)檢查：試驗(yàn)中死亡動(dòng)物的病理檢查及試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的尸檢。三、慢性毒性作用及其試驗(yàn)方法1、目的：評(píng)價(jià)化學(xué)物在長(zhǎng)期小劑量作用的條件下對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的損害及其特點(diǎn)．確定閾劑量和最大無(wú)作用劑量。2、試驗(yàn)方法：（1）動(dòng)物選擇、染毒方法、視察指標(biāo)等與亞慢性毒性試驗(yàn)相像；（2）染毒期限：1-2年或終身染毒，也有人提出6月。（3）劑量分組：3個(gè)染毒組和一個(gè)比照組。高劑量組：1/5—1/2亞慢性試驗(yàn)閾值；中間劑量：1/50—1/10；低劑量組：1/100。第四節(jié)致突變?cè)囼?yàn)一、目的確定外源化學(xué)物對(duì)生物體是否具有致突變作用?；螯c(diǎn)突變?cè)囼?yàn)、染色體畸變?cè)囼?yàn)、DNA損傷試驗(yàn)。二、供試生物：微生物、動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲、動(dòng)物或植物三、試驗(yàn)方法體外基因突變?cè)囼?yàn)、細(xì)胞遺傳學(xué)試驗(yàn)、體內(nèi)基因突變?cè)囼?yàn)、DNA損傷試驗(yàn)（一）體外基因突變?cè)囼?yàn)1、Ames試驗(yàn)（鼠傷寒沙門氏菌/動(dòng)物肝細(xì)胞微粒體試驗(yàn)）

（1）原理：利用一種突變微生物菌株與被檢測(cè)化學(xué)物接觸，使突變型微生物回復(fù)突變，重新成為野生型微生物。突變型微生物不具備合成組氨酸的實(shí)力，不能在不含（或低濃度）組氨酸培育基上生長(zhǎng)。（2）方法：將突變型沙氏菌在不含（或低濃度）組氨酸培育基上培育,以其生長(zhǎng)狀況作為指標(biāo)。在培育基中加入哺乳動(dòng)物的肝細(xì)胞微粒體：提高靈敏度。（3）特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、靈敏、快速（48h）、費(fèi)用低；檢測(cè)結(jié)果與對(duì)動(dòng)物的致癌性的相符率達(dá)約90%。

缺點(diǎn)：利用微生物作為供試物，不能全面反映哺乳動(dòng)物的遺傳信息，僅1/6；微生物的DNA修復(fù)系統(tǒng)與動(dòng)物有差異；微生物無(wú)免疫功能。

2、哺乳動(dòng)物體細(xì)胞突變?cè)囼?yàn)（1）方法原理與微生物突變類似。

常用的細(xì)胞株：中國(guó)地鼠肺細(xì)胞V79中國(guó)地鼠肺卵巢細(xì)胞(CHO）小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞株。V79、CHO細(xì)胞株正常細(xì)胞：缺乏利用嘌呤堿的酶HGPRT，不能在加入類嘌呤堿類物質(zhì)的培育基上生長(zhǎng)；突變細(xì)胞：可在加入類嘌呤堿類物質(zhì)的培育基上生長(zhǎng)。L5178Y突變細(xì)胞株正常細(xì)胞：缺乏胸苷激酶（TK），不行在含有細(xì)胞毒物5-溴脫氧尿苷的培育基上生長(zhǎng)。突變細(xì)胞：可在此種培育基上生長(zhǎng)。（二）細(xì)胞遺傳學(xué)試驗(yàn)染色體畸變?cè)囼?yàn)：干脆在顯微鏡下視察染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的變更狀況。生殖細(xì)胞或體細(xì)胞、體外或體內(nèi)試驗(yàn)。體外：CHO細(xì)胞:分裂快、數(shù)目適中、形態(tài)清晰；人類外周血淋巴細(xì)胞體內(nèi)：受試動(dòng)物骨髓細(xì)胞或其他（胸腺、脾、精原細(xì)胞）染色體畸變率的變更。（1）試驗(yàn)方法：a.體外培育：CHO細(xì)胞或人類外周血淋巴細(xì)胞與化學(xué)物，在細(xì)胞培育液（DMEM,RPM,1640或1999）中，370C下培育24h(CHO)或72h(人類細(xì)胞）。視察前2h加入秋水仙堿（中期分裂阻斷劑），制片，鏡檢視察。b.體內(nèi)染色體畸變分析：大鼠、小鼠，染毒飼養(yǎng)，視察骨髓細(xì)胞染色體畸變狀況。第四節(jié)環(huán)境流行病學(xué)方法一、概念和特點(diǎn)：流行病學(xué)：探討特定人群中有關(guān)健康的狀態(tài)和事務(wù)的分布以及影響這些分布的確定因素；環(huán)境流行病學(xué)：應(yīng)用流行病學(xué)的原理和方法，重點(diǎn)探討人們?cè)谏詈凸ぷ鳝h(huán)境中各種因素與人群健康的關(guān)系。一般流行病學(xué)探討的內(nèi)容是疾病在人群中的分布，它要回答三個(gè)問(wèn)題：(1)疾病在時(shí)間、地點(diǎn)、不同人群中是怎樣分布的?(2)什么因素是該病的主要確定因素?(3)怎樣限制該病的流行?環(huán)境流行病學(xué)除了上述一般內(nèi)容，還有它本身的特點(diǎn)。(1)它不僅探討疾病的分布規(guī)律，而且更常常地探討疾病前的狀態(tài)，即包括無(wú)異樣〔健康)、微弱的功能變更、疾病的前期(亞臨床狀態(tài))等各種健康狀況，揭示環(huán)境污染或某些微量元素的健康效應(yīng)。(2)環(huán)境流行病學(xué)探討的暴露因素主要是理化因素。①已知暴露因素，探討其對(duì)健康的影響；環(huán)境毒理學(xué)工作者所進(jìn)行的大量工作就屬于這種。例如金屬冶煉廠鉛污染大氣對(duì)居民健康影響，磷肥廠氟污染大氣對(duì)居民健康影響的調(diào)查等。②出現(xiàn)健康異樣，追究引起異樣的暴露因素，這屬于探討病因的探討。例如，近年來(lái)我國(guó)學(xué)者對(duì)于鼻咽癌、食道癌病因的探討，對(duì)克山病、大骨節(jié)病病因的探討，均屬于此種類型。日本的水誤病和痛痛病的病因是重金屬污染造成的公害病領(lǐng)域里的探討成果，影響深遠(yuǎn)。(3)環(huán)境流行病學(xué)探討的最終日的是為消退污染、改造環(huán)境、愛護(hù)居民健康服務(wù)。(4)干脆以人群為探討對(duì)象，探討結(jié)果最具有勸服