動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)

第四章動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁(yè)!

動(dòng)物細(xì)胞雖可像微生物細(xì)胞一樣，在人工控制條件的生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，但其細(xì)胞結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性與微生物細(xì)胞相比，有顯著差別：①動(dòng)物細(xì)胞比微生物細(xì)胞大得多，無(wú)細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，對(duì)剪切力敏感，適應(yīng)環(huán)境能力差②倍增時(shí)間長(zhǎng)，生長(zhǎng)緩慢，易受微生物污染，培養(yǎng)時(shí)須用抗生素③培養(yǎng)過(guò)程需氧量少(氧傳質(zhì)系數(shù)KLa大于10h-1即可滿足每毫升107個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng))④培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞相互粘連以集群形式存在⑤原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖50代即退化死亡⑥代謝產(chǎn)物具有生物活性，生產(chǎn)成本高，但附加值也高。

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的一般特點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁(yè)!動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)存在的困難1、動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)速率慢，產(chǎn)物的生產(chǎn)率也低，從而造成產(chǎn)物濃度也低。2、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基成分復(fù)雜，價(jià)格昂貴。3、動(dòng)物細(xì)胞沒有細(xì)胞壁，易受機(jī)械攪拌所引起的剪切力的影響。4、常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)方法也不太適用于大規(guī)模培養(yǎng)。上述這些限制造成了大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)所需費(fèi)用高，技術(shù)難度大（規(guī)模越大、影響也越大）。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁(yè)!隨著生物工程的發(fā)展，使得很多原先只有動(dòng)物體產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可由重組微生物生產(chǎn)，如重組大腸桿菌表達(dá)和生產(chǎn)人胰島素和人生長(zhǎng)激素。然而，由于微生物細(xì)胞缺乏蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄后修飾機(jī)制，由重組微生物產(chǎn)生的不少蛋白質(zhì)分子不具有所期待的生物學(xué)功能和活力。動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模的培養(yǎng)確有不小的困難，但它的優(yōu)點(diǎn)也是很明顯的、誘人的，關(guān)鍵是如何提高細(xì)胞在反應(yīng)器內(nèi)的密度，提高細(xì)胞的穩(wěn)定性以及生產(chǎn)率。動(dòng)物細(xì)胞的固定化以及培養(yǎng)是解決問(wèn)題的有效途徑。優(yōu)缺點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁(yè)!微囊（Microcapsules）技術(shù)是一種利用天然的或合成的高分子成膜材料（囊材）把液體或固體（囊心物）包嵌形成直徑1~5000μm（通常為5~250μm）微小膠囊的技術(shù)。

微囊的制備技術(shù)起源于20世紀(jì)50年代，在70年代中期得到迅猛發(fā)展，并且出現(xiàn)了許多微囊化產(chǎn)品和工藝。微囊技術(shù)可廣泛用于醫(yī)藥、食品、農(nóng)藥、飼料、化妝品、染料等領(lǐng)域。

動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁(yè)!2、定位聚合反應(yīng)

在定位聚合反應(yīng)中，高分子單體和預(yù)聚物置于油相中，通過(guò)提高溫度或者使用具有表面活性的酸性催化劑來(lái)引發(fā)界面聚合反應(yīng)。如果活性成分為固體，在單體或預(yù)聚物加入之前先將固體活性成分溶解在與水不互溶的有機(jī)溶劑中。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁(yè)!4、微囊懸浮液噴霧干燥法微囊的懸浮液可用噴霧干燥制成微囊粒劑，一般需要另外的分散劑來(lái)滿足在水中再分散的需要。含有活性物質(zhì)和高分子的料漿也可進(jìn)行噴霧干燥，使高分子在固體囊芯顆粒周圍形成膜或囊壁?；钚晕镔|(zhì)的料漿必須在合適的分散劑作用下先預(yù)磨成較細(xì)的顆粒。一旦噴霧干燥除去水分，就能得到粉粒狀產(chǎn)品，平均粒徑在100-300μm之間。粒徑大小取決于噴霧干燥器的尺寸、干燥室的噴嘴種類、料漿流量、干燥溫度等因素。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁(yè)!6、溶劑蒸發(fā)法

需要微囊化的活性物質(zhì)和形成囊壁材料的高分子同時(shí)溶解在具有揮發(fā)性、與水不互溶的有機(jī)溶劑中，活性物質(zhì)和高分子也必須互不相溶。高分子和活性成分的溶液在表面活性劑的作用下預(yù)先乳化。然后通過(guò)加熱或減壓蒸餾除去溶劑，溶劑蒸發(fā)后，高分子被分離出來(lái)并在乳液粒子表面形成連續(xù)的膜。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁(yè)!2）微載體

微載體細(xì)胞培養(yǎng)法是一種用于培養(yǎng)貼壁依賴性細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)。這種培養(yǎng)技術(shù)是在生物反應(yīng)器內(nèi)加入培養(yǎng)液和一種對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害作用的材料支撐的顆粒(微載體)，使細(xì)胞在微載體表面附著和生長(zhǎng)，并通過(guò)不斷攪拌使微載體保持懸浮狀態(tài)。培養(yǎng)液中大量的微載體為細(xì)胞提供了極大的附著表面，1g微載體其比表面積可達(dá)6000cm2，從而可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的高密度培養(yǎng)。

動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁(yè)!采用微載體培養(yǎng)具有以下優(yōu)點(diǎn)：

①比表面積大，單位體積培養(yǎng)液的細(xì)胞產(chǎn)率高；②采用均勻懸浮培養(yǎng)，無(wú)營(yíng)養(yǎng)物或產(chǎn)物梯度；③可用簡(jiǎn)單顯微鏡觀察微載體表面的生長(zhǎng)情況；④細(xì)胞收獲過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，勞動(dòng)強(qiáng)度??；⑤培養(yǎng)基利用率高，占地面積??；⑥放大容易，國(guó)外已有公司以1000L規(guī)模培養(yǎng)人的二倍體細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)β-干擾素。但其缺點(diǎn)：是攪拌槳及微珠間的碰撞易損傷細(xì)胞；接種密度高；微載體吸附力弱，不適合培養(yǎng)懸浮型細(xì)胞。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁(yè)!①比表面積大，是實(shí)心微載體的幾倍甚至幾十倍；②細(xì)胞在孔內(nèi)生長(zhǎng)，受到保護(hù)，剪切損傷?。虎叟c包埋法相比，傳質(zhì)尤其是傳氧效果好；④兩種類型細(xì)胞都適用；⑤細(xì)胞三維生長(zhǎng)，細(xì)胞密度是實(shí)心微載體10倍以上，有的可108個(gè)/mL；⑥適用于長(zhǎng)期維持培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)情況依然良好；⑦微載體濃度高，實(shí)心載體在培養(yǎng)液中濃度增大到一定時(shí)，細(xì)胞密度反而下降；而大孔微載體在濃度較高時(shí)，表面碰撞增加，能促使細(xì)胞在孔內(nèi)生長(zhǎng)；⑧最適合于蛋白質(zhì)生產(chǎn)和產(chǎn)物分泌。因此有人預(yù)言，大孔微載體技術(shù)將成為動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的一種常用方式。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁(yè)!1）海藻酸鈣凝膠

海藻酸鈣凝膠包埋法是將動(dòng)物細(xì)胞與一定量的海藻酸鈉溶液混合均勻，然后滴到一定濃度的氯化鈣溶液中形成直徑約1mm內(nèi)含動(dòng)物細(xì)胞的海藻酸鈣膠珠，分離洗滌后即可用于培養(yǎng)。此法操作時(shí)條件溫和，對(duì)活細(xì)胞損傷小。但固定后機(jī)械強(qiáng)度不高。為了大量制備海藻酸鈣凝膠包埋的固定化細(xì)胞，國(guó)外已有專門的振動(dòng)噴嘴設(shè)備可供使用。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁(yè)!3）血纖維蛋白

將動(dòng)物細(xì)胞與血纖維蛋白原混合，然后加入凝血酶。凝血酶將血纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為不溶性的血纖維蛋白，將動(dòng)物細(xì)胞固定在其中。血纖維蛋白可以促進(jìn)細(xì)胞貼壁，因此兩種類型的細(xì)胞都適于培養(yǎng)。而且基質(zhì)高度多孔，允許大分子物質(zhì)的自由擴(kuò)散。但機(jī)械強(qiáng)度差，對(duì)剪切力很敏感。

動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁(yè)!四、微囊化

微囊化培養(yǎng)技術(shù)其要點(diǎn)是：在無(wú)菌條件下將擬培養(yǎng)的細(xì)胞、生物活性物質(zhì)及生長(zhǎng)介質(zhì)共同包裹在薄的半透膜中形成微囊，再將微囊放入培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。生長(zhǎng)介質(zhì)為1.4%海藻酸鈉溶液，半透膜由多聚賴氨酸形成。培養(yǎng)系統(tǒng)可采用攪拌式或氣升式反應(yīng)器系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，采用批式和連續(xù)灌注式培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體，在7-27d微囊內(nèi)抗體濃度可達(dá)1250-5300mg/L。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁(yè)!固定化方法的選擇一、培養(yǎng)規(guī)模

由于各種固定化系統(tǒng)可以獲得相同的細(xì)胞密度，且細(xì)胞的產(chǎn)率主要取決于細(xì)胞的擴(kuò)散，因此反應(yīng)器的體積是培養(yǎng)規(guī)模放大的主要決定因素。雖然微載體系統(tǒng)可以提供最大的單元操作，但其他系統(tǒng)也可以通過(guò)增加單元套數(shù)而獲得放大。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁(yè)!三、所培養(yǎng)的細(xì)胞類型

大多數(shù)固定化系統(tǒng)都適用于貼壁型細(xì)胞的培養(yǎng)。而在吸附非貼壁型細(xì)胞時(shí)，由于吸附力弱，易出現(xiàn)細(xì)胞泄露。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁(yè)!固定化培養(yǎng)存在的問(wèn)題固定化細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞密度較一般懸浮培養(yǎng)高10-100倍，但同時(shí)也帶來(lái)了如何保證足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧的傳遞問(wèn)題。(2)細(xì)胞群體在大規(guī)模、長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)過(guò)程中分泌產(chǎn)物能力的丟失或產(chǎn)物活性的降低依然是細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域深感棘手的問(wèn)題。包埋在凝膠或微囊中死亡的細(xì)胞會(huì)對(duì)其他細(xì)胞產(chǎn)生污染和毒害作用。(3)培養(yǎng)基及固定化基質(zhì)價(jià)格昂貴，生產(chǎn)成本高居不下。尤其是高效的微載體細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)，銷售價(jià)格一直呈上漲趨勢(shì)。(4)目前對(duì)細(xì)胞代謝和生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的研究以及在線監(jiān)測(cè)水平還遠(yuǎn)不足以設(shè)計(jì)出確定的優(yōu)化培養(yǎng)系統(tǒng)，從而導(dǎo)致昂貴培養(yǎng)基的浪費(fèi)。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁(yè)!節(jié)動(dòng)物細(xì)胞的微囊化微囊化是固定化技術(shù)中的一種，是用一層親水性的半透膜將酶、輔酶、蛋白質(zhì)等生物大分子或動(dòng)植物細(xì)胞包圍在珠狀的微囊里，從而使得酶等生物大分子和細(xì)胞不能從微囊里逸出，而小分子的物質(zhì)、培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以自由出入半透膜，達(dá)到催化或培養(yǎng)的目的。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁(yè)!動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁(yè)!微囊化細(xì)胞的模式圖動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第20頁(yè)!二、動(dòng)物細(xì)胞微囊化方法需滿足條件：1、微囊化的過(guò)程要溫和，快速，不損傷細(xì)胞，盡可能在液體狀態(tài)和生理?xiàng)l件下制備。2、微囊化所用的試劑和膜材料必須對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害作用。3、微囊化所形成的膜必須能夠使?fàn)I養(yǎng)物和代謝產(chǎn)物自由通過(guò)，膜的孔徑可以控制。4、膜應(yīng)具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度以抵抗培養(yǎng)過(guò)程中的攪拌，不至于使微囊破裂動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第21頁(yè)!動(dòng)物細(xì)胞與海藻酸溶液混合，經(jīng)過(guò)微囊化發(fā)生器滴入CaCl2溶液中，形成凝膠微珠，然后用聚賴氨酸溶液處理微球表面，最后再用檸檬酸去除微珠的鈣離子，這樣，微珠內(nèi)部的海藻酸成液態(tài)，動(dòng)物細(xì)胞懸浮其中，而微珠表面由于受到聚賴氨酸的處理而不再溶解，形成一層薄膜，動(dòng)物細(xì)胞就被這層膜包在微囊里了，形成細(xì)胞微囊。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第22頁(yè)!動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第23頁(yè)!制備微囊化動(dòng)物細(xì)胞要經(jīng)過(guò)以下幾步（海藻酸-聚賴氨酸-海藻酸微囊）

1、無(wú)菌收集動(dòng)物細(xì)胞，離心后再生理鹽水洗滌。2、離心收集細(xì)胞，并加入海藻酸溶液混合均勻，使成懸浮液。3、將懸浮液裝入微囊發(fā)生器中制成微滴。4、微滴加到CaCl2溶液中形成微膠珠。5、凝膠珠用生理鹽水洗去殘留的CaCl2.6、凝膠珠懸浮于聚賴氨酸溶液中，使之形成膜。7、凝膠珠再用CaCl2溶液洗，用CHES緩沖液固化。8、凝膠珠用生理鹽水洗滌以后，再用ALG溶液處理。9、生理鹽水洗滌后的凝膠珠加0.05mg/l檸檬酸溶液處理，使半透膜內(nèi)的ALG成液態(tài)，然后用生理鹽水沖洗。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第24頁(yè)!微囊半透膜的孔徑是培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分、代謝物進(jìn)行膜內(nèi)外交換、截留一定分子量蛋白在囊內(nèi)的關(guān)鍵，如何選擇是一重要問(wèn)題。微囊的膜是多陰離子的海藻酸與多陽(yáng)離子的聚賴氨酸相互作用而形成的。研究表明，此半透膜的孔徑主要由聚賴氨酸的分子量決定，一般來(lái)說(shuō)用高分子量的聚賴氨酸(PLL)覆膜孔徑大，PLL分子量低、孔徑小，通常使用相對(duì)分子量為40000-80000的PLL。研究還表明，PLL溶液的濃度及處理時(shí)間、溶液的PH及使用溫度也都會(huì)影響膜的孔徑。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第25頁(yè)!細(xì)胞的活性在進(jìn)行微囊化時(shí)要注意到保持動(dòng)物細(xì)胞的存活率，這與微囊化時(shí)間的長(zhǎng)短、溫度、溶液的pH、保持溶液等滲等都有著密切的關(guān)系，需特別注意。微囊化時(shí)動(dòng)物細(xì)胞在海藻酸溶液中的初始濃度也與存活率有關(guān)，不同的細(xì)胞，所用濃度不同，一般在104～106個(gè)/ml動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第26頁(yè)!（2）脫乙酰幾丁質(zhì)/海藻酸鈉微囊用1g/L的脫乙酰幾丁質(zhì)（pH6.5)代替PLL/ALG法中的PLL，在脫乙酰幾丁質(zhì)與海藻酸鈉反應(yīng)20min后，再用0.05mol/L檸檬酸鈉處理，使微囊內(nèi)重新液化。膜的孔徑受脫乙酰幾丁質(zhì)溶液的離子強(qiáng)度的影響，此法同樣也存在強(qiáng)度不夠的問(wèn)題。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第27頁(yè)!（4）脫乙酰幾丁質(zhì)/羧甲基纖維素（CMC）微囊利用脫乙酰幾丁質(zhì)與CMC的靜電作用形成半透膜使細(xì)胞微囊化的方法。將含有細(xì)胞的羥甲基纖維素鈉鹽（CMC）溶液經(jīng)微囊發(fā)射器噴射入脫乙酰幾丁質(zhì)溶液中，反應(yīng)2-5min，然后倒入磷酸緩沖液中以減少幾丁質(zhì)的粘度，用離心的方法收集微囊、培養(yǎng)。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第28頁(yè)!第二節(jié)微囊化細(xì)胞的培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第29頁(yè)!在微囊內(nèi)，很多動(dòng)物細(xì)胞，不管是懸浮細(xì)胞還是貼壁細(xì)胞都能良好地生長(zhǎng)。據(jù)報(bào)道，僅雜交瘤細(xì)胞就有100多種已被微囊化培養(yǎng)。重組成纖細(xì)胞HBS-1在貼壁生長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞呈棱形單層生長(zhǎng)，而微囊化后形態(tài)發(fā)生了很大的變化，由棱形變成了球形，并且呈三向?qū)嶓w生長(zhǎng)，逐漸成團(tuán)，與動(dòng)物體內(nèi)的組織形態(tài)很相識(shí)，這可能反應(yīng)了微囊的微環(huán)境比較接近動(dòng)物體內(nèi)的環(huán)境。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第30頁(yè)!4、微囊的體積和工作總體積之比：通常在（1：10）～（1：2）的范圍內(nèi)。他們間的比值大則生產(chǎn)等量產(chǎn)品可減少生物反應(yīng)器的體積。對(duì)大規(guī)模生產(chǎn)是非常有利的。5、可以加大攪拌速度和通氣量，但要注意不破壞微囊。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第31頁(yè)!一、生產(chǎn)藥物上的應(yīng)用1、單克隆抗體的生產(chǎn)動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第32頁(yè)!3、干擾素的生產(chǎn)Jarvis和Grdina通過(guò)試劑和病毒方法誘導(dǎo)微囊化FS-1和Namalwa細(xì)胞生產(chǎn)干擾素，這兩種細(xì)胞在微囊中生產(chǎn)比懸浮培養(yǎng)或單層培養(yǎng)更旺盛，兩細(xì)胞在微囊中生產(chǎn)的干擾素與懸浮培養(yǎng)或單層培養(yǎng)的總產(chǎn)量相同。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第33頁(yè)!2、抗癌藥物的篩選微囊化的腫瘤細(xì)胞用于估價(jià)抗癌藥物對(duì)活體的作用。人的腫瘤細(xì)胞經(jīng)微囊化后注入小鼠腹腔中，服用受檢的抗癌藥，檢測(cè)微囊化的腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗癌藥能穿透微囊的膜作用與微囊中的腫瘤細(xì)胞，抑制或殺滅的水平與其他體外或體內(nèi)測(cè)定的藥效一致。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第34頁(yè)!優(yōu)點(diǎn)：

①可防止細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中受到物理?yè)p傷.②活性蛋白不能從囊中自由出入半透膜，從而提高細(xì)胞密度和產(chǎn)物含量，并方便分離純化處理.缺點(diǎn)：①微囊制作復(fù)雜，成功率不高.②微囊內(nèi)死亡的細(xì)胞會(huì)污染正常產(chǎn)物.③收集產(chǎn)物必須破壁，不能實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)連續(xù)化.

微囊化培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第35頁(yè)!微囊制備方法1、人工界面聚合法

此方法是將芯材物乳化或分散在一個(gè)有壁材的連續(xù)相中，然后在芯材物的表面通過(guò)單體聚合反應(yīng)而形成微囊。參加聚合反應(yīng)的單體，一種是水溶性的，另一種是油溶性的，它們分別位于囊心液滴的內(nèi)部和外部，并在囊心液滴的表面上反應(yīng)形成聚合物薄膜。利用界面聚合法可以使疏水性材料的溶液或分散液微膠囊化，也可以使親水性材料的水溶液或分散液微膠囊化。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第36頁(yè)!3、凝聚法

在此工藝中，含有預(yù)分散活性物質(zhì)的陽(yáng)離子高分子溶液與另一相反電荷的高分子溶液反應(yīng)。一般使用明膠（陽(yáng)離子）和阿拉伯膠（陰離子）。首先，在熱的明膠溶液中制備好囊芯物質(zhì)的懸浮液或乳液，接著加人稀釋的阿拉伯膠溶液，將pH值降至4.5以下，它促進(jìn)了作為核芯的分散顆粒周圍明膠的凝固，當(dāng)降低溫度時(shí)，明膠出現(xiàn)并形成軟的膠囊，接著加人醛類交聯(lián)劑（如戊二醛）使軟膠囊硬化，提高pH值至9并加熱。硬的膠囊可通過(guò)離心、過(guò)濾、噴霧干燥或其他方式分離出來(lái)。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第37頁(yè)!5、融解冷卻的分散液制微囊法

在此工藝中，囊芯材料分散在融解的石蠟中，低溫條件下在水中形成乳液，石蠟固化形成微膠囊壁。冷卻速度和攪拌條件決定了膠囊的形狀和大小。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第38頁(yè)!細(xì)胞的固定化培養(yǎng)方法

一、吸附

1）多孔陶瓷

美國(guó)某公司開發(fā)了一種完全自動(dòng)化的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)的核心是陶質(zhì)矩形蜂窩狀生物反應(yīng)器。反應(yīng)器構(gòu)型是一圓筒內(nèi)裝置有許多陶質(zhì)矩形通道的蜂窩狀圓柱體，可提供一定的生長(zhǎng)表面積，既可用于培養(yǎng)懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，又可用于培養(yǎng)貼壁依靠性細(xì)胞。該系統(tǒng)可以連續(xù)化生產(chǎn)蛋白質(zhì)。由于產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)基中，給分離純化帶來(lái)方便。而且細(xì)胞不用從培養(yǎng)基中分離，所以不必考慮梯度問(wèn)題；當(dāng)培養(yǎng)基高速循環(huán)時(shí)，可以保持相對(duì)恒定的營(yíng)養(yǎng)物和氧濃度。增加套數(shù)即可實(shí)現(xiàn)放大。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第39頁(yè)!

微載體的直徑在60-250μm，由天然葡聚糖、凝膠或各種合成的聚合物組成，如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。由這些材料及其改良型制成的微載體主要參考了細(xì)胞的粘附特性，在其表面帶有大量電荷及其他生長(zhǎng)基質(zhì)物質(zhì)，因而有利于細(xì)胞的粘附、鋪展和增殖。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第40頁(yè)!3）大孔微載體

人們?yōu)榱私鉀Q微載體培養(yǎng)系統(tǒng)中細(xì)胞易受機(jī)械損傷的缺陷以及能最大限度地?cái)U(kuò)大比表面積，開發(fā)了具有完全連通溝回的大孔微載體。大孔微載體將細(xì)胞固定在孔內(nèi)生長(zhǎng)，因而與其他方法相比具有一系列優(yōu)點(diǎn)：

動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第41頁(yè)!二、包埋

將動(dòng)物細(xì)胞包埋在各種多聚物多孔載體中而制成固定化動(dòng)物細(xì)胞的方法稱為包埋法。

優(yōu)點(diǎn)：此法步驟簡(jiǎn)便，條件溫和，負(fù)荷量大，細(xì)胞泄露少。因細(xì)胞嵌入在高聚物網(wǎng)格中而受到保護(hù)，細(xì)胞能抗機(jī)械剪切。但該法也有一定缺點(diǎn)，如擴(kuò)散限制，并非所有細(xì)胞都處于最佳營(yíng)養(yǎng)物濃度。

包埋法一般適用于非貼壁依賴型細(xì)胞的固定化。多孔凝膠是最常用的載體，用于動(dòng)物細(xì)胞固定化的凝膠主要有海藻酸鈣、瓊脂糖、血纖維蛋白等。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第42頁(yè)!2）瓊脂糖凝膠

瓊脂糖凝膠可用二相法制得。將含有細(xì)胞的瓊脂糖溶液分散到一個(gè)水不溶相中(如石蠟油)，形成直徑0.2mm凝膠微珠，移去石蠟油后，細(xì)胞即可進(jìn)行培養(yǎng)。同海藻鈣一樣，瓊脂糖更適于培養(yǎng)懸浮細(xì)胞。盡管凝膠珠形成過(guò)程很復(fù)雜，目前放大體積不超過(guò)20L。但瓊脂糖凝膠無(wú)毒性，具有較大的空隙，可以允許大分子物質(zhì)自由擴(kuò)散，因此該法非常適用于蛋白產(chǎn)物的連續(xù)生產(chǎn)。有人曾用瓊脂糖包埋雜交瘤細(xì)胞和淋巴細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體和白細(xì)胞介素。

動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第43頁(yè)!三、中空纖維

中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)的三維狀態(tài)，利用一種人工的“毛細(xì)管”即中空纖維給培養(yǎng)的細(xì)胞提供物質(zhì)代謝條件而建立的一種體外培養(yǎng)系統(tǒng)。中空纖維培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是無(wú)剪切、高傳質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)成分的選擇性滲入，使培養(yǎng)細(xì)胞和產(chǎn)物密度都可達(dá)到比較高的水平。缺點(diǎn)是膜的污染和堵塞，觀察困難，細(xì)胞生長(zhǎng)或過(guò)量氣體產(chǎn)生會(huì)破壞纖維。中空纖維培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)是讓細(xì)胞在管束外空間生長(zhǎng)，以達(dá)到更高的細(xì)胞培養(yǎng)密度。目前中空纖維反應(yīng)器已進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)，主要用于培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)單克隆抗體。

動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第44頁(yè)!利用微囊包裹具有特定功能的組織細(xì)胞，形成免疫隔離的人工細(xì)胞，以此植入疾病動(dòng)物或病人體內(nèi)。1980年報(bào)道了微囊化胰島移植治療糖尿病。他們將同種大鼠胰島用海藻酸-聚賴氨酸-聚乙烯亞胺包埋后植入鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠體內(nèi)，在未用免疫抑制劑的情況下，控制大鼠血糖正常達(dá)一年左右。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第45頁(yè)!二、培養(yǎng)方式

除了海藻酸鈣包埋法外，其他固定化基質(zhì)都是多孔型的，能允許大分子物質(zhì)自由出入，因此可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的連續(xù)生產(chǎn)。在凝膠珠和微囊中可使蛋白產(chǎn)物積聚到很高的濃度，給后續(xù)的分離純化處理帶來(lái)方便，并大大降低了生產(chǎn)成本。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第46頁(yè)!四、制備方法的難易和成本由于固定化基質(zhì)類型比較復(fù)雜，因此各種固定化方法的成本很難比較。海藻酸鹽和瓊脂糖是以化學(xué)試劑形式出售；膠原珠是以無(wú)菌形式提供給使用者，以便于接種。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第47頁(yè)!固定化動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的展望

固定化動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工程發(fā)展的總方向是大型化、自動(dòng)化、精巧化、低成本、高細(xì)胞密度、高目的產(chǎn)品產(chǎn)量。從國(guó)際上的發(fā)展趨勢(shì)看，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)主要有：（1）開發(fā)細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器和培養(yǎng)系統(tǒng)；（2)開發(fā)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞的載體；（3)開發(fā)微囊技術(shù)；（4)開發(fā)雜交、重組技術(shù)；（5)開發(fā)無(wú)血清和化學(xué)合成的培養(yǎng)基；（6)蛋白質(zhì)濃縮和提純技術(shù)。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第48頁(yè)!微囊化的神經(jīng)組織細(xì)胞

動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第49頁(yè)!一、微囊化概述人工細(xì)胞的概念由加拿大馬吉爾（McGill）大學(xué)T.M.S.Chang教授于1957年首次提出并應(yīng)用具有半滲透性薄膜的微膠囊固定活體細(xì)胞或組織取得成功。由于微膠囊膜起到了類似細(xì)胞膜的作用,且固定后體系的形態(tài)和功能酷似活性細(xì)胞,所以稱之為“人工細(xì)胞”。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第50頁(yè)!

80年代初,Lim等人將微囊化技術(shù)與組織細(xì)胞移植相結(jié)合,制備了具有良好生物相容性的海藻酸鈉/聚賴氨酸(APA)微膠囊作為免疫隔離工具,包埋豬胰島細(xì)胞形成人工細(xì)胞,并移植入糖尿病大鼠體內(nèi),結(jié)果表明該人工細(xì)胞成功地調(diào)節(jié)了血糖水平,代行了大鼠胰腺功能,因而被稱為人工胰腺.這一研究成果較好地解決了組織細(xì)胞移植過(guò)程的免疫排斥問(wèn)題,避免或減少了昂貴的免疫抑制劑的使用,為組織細(xì)胞移植治療神經(jīng)/內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病提供了新思路.動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第51頁(yè)!1、聚賴氨酸/海藻酸(PLL/ALG)微囊化（1）原理

海藻酸是以1，4鍵連接的聚醛酸，其主要成分是甘露糖醛酸和古羅糖醛酸。當(dāng)它的水溶液以鈣鹽的形式存在時(shí)，則成凝膠狀態(tài)。用螯合劑將鈣離子去除后，海藻酸又回復(fù)到溶液狀態(tài)。海藻酸鈣凝膠用聚賴氨酸處理后，其接觸部分不再被螯合劑去鈣而溶解動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第52頁(yè)!（2）微囊化裝置及步驟動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第53頁(yè)!動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第54頁(yè)!(3)影響微囊化的一些因素微囊半透明孔徑影響因素微囊的質(zhì)量影響因素細(xì)胞的活性影響因素動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第55頁(yè)!微囊的質(zhì)量海藻酸的純度、黏度及甘露糖醛酸和古羅糖醛酸的比例都會(huì)影響微囊的形成及機(jī)械性能。純度高、黏度高容易成囊。含古羅糖醛酸多的海藻酸容易成囊，機(jī)械性能好，不易破碎。因此在使用海藻酸時(shí)必須慎重地選擇。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第56頁(yè)!2、其它的微囊化方法（1）海藻酸鈣微囊以甲基纖維素代替海藻酸（PLL）的方法，將動(dòng)物細(xì)胞與1.1%甲基纖維素的CaCL2溶液（1.3%）以1：3的比例混合，然后將混合物滴入0.75%的海藻酸鈉溶液中，反應(yīng)15min后在液滴四周就形成了一層海藻酸鈣的膜，包圍動(dòng)物細(xì)胞在囊內(nèi)，一般微囊直徑達(dá)2.5mm。此方法簡(jiǎn)單，但強(qiáng)度不夠，容易破碎。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)共65頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第57頁(yè)!（3）PLL/脫乙酰幾丁質(zhì)/海藻酸鈉雙層膜微囊包有細(xì)胞的海藻酸鈉凝膠珠與脫乙酰幾丁