ET-1對體外培養(yǎng)的大鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞增殖與分泌的作用,生理學(xué)論文

ET-1對體外培養(yǎng)的大鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞增殖與分泌的作用,生理學(xué)論文腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞移植對治療各種原因引起的腎上腺皮質(zhì)功能不全具有廣闊的應(yīng)用前景，但研究中發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)細(xì)胞再生不完全，產(chǎn)生的皮質(zhì)激素也不能完全知足生理需要。內(nèi)皮素(ET)-1是最強(qiáng)的縮血管物質(zhì)之一，具有促進(jìn)多種組織細(xì)胞增殖與分泌的作用，在體內(nèi)可增加大鼠腎上腺自體移植物的增殖和分泌。本文通過研究ET-1對體外培養(yǎng)的大鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞增殖與分泌的影響，進(jìn)一步討論大鼠腎上腺細(xì)胞體外培養(yǎng)時的生長特性，以期優(yōu)化腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)方案，為腎上腺細(xì)胞移植提供最適宜的條件。

1、材料與方式方法

1.1材料

2周齡SD大鼠(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)30只，膠原酶I型(Sigma公司，美國)，DNA酶I型(LABEST公司，北京)，DMEM∕F-12培養(yǎng)基、胎牛血清，原代消化液(DMEMF-12培養(yǎng)基配制，內(nèi)含1mg/mL膠原酶I型、5g/mLDNA酶I型)，培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、手術(shù)器械，ET-1(Enzo公司，美國)，鼠抗人PCNA單克隆抗體(武漢博士德生物技術(shù)有限公司，中國)，SP-9002免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋公司，中國)，皮質(zhì)酮放免法試劑盒(中國原子能研究院同位素研究所，中國)。

1.2原代培養(yǎng)大鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞

取大鼠腎上腺，剪碎后置于消化液(1g/L膠原酶I型，5mg/LDNA酶I型)中消化，并接種于培養(yǎng)皿中原代培養(yǎng)，12d后傳代。取傳代培養(yǎng)對數(shù)生長期大鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，等濃度接種于96、12孔板，分別進(jìn)行MTT法及免疫組化實驗。

1.3ET-1對細(xì)胞增殖與分泌的影響

MTT法：取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5104/mL，每孔100L接種于96孔板中，共接種88孔，分11組(10個實驗組，1個對照組〕，每組8孔。過夜后棄上清液，10個實驗組分別參加含10倍濃度(10-6~-15mol/L)梯度的ET-1培養(yǎng)基，對照組8孔換不含ET-1培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)36h后以MTT法檢測各孔吸光度值。

實驗重復(fù)5次，計算各組平均吸光度值。免疫組化及放射免疫法：等細(xì)胞濃度傳代培養(yǎng)于12孔板中，培養(yǎng)板各孔預(yù)先放置無菌玻片。一次接種2個培養(yǎng)板，共24孔，分6組(5個實驗組，1個對照組〕，每組4孔。培養(yǎng)箱中過夜后棄上清液，5個實驗組分別參加含10倍濃度(10-8~-12mol/L)梯度ET-1培養(yǎng)基，對照組4孔換不含ET-1培養(yǎng)基。完成后天天顯微鏡觀察各孔細(xì)胞生長狀況，或有無明顯生長速度差異不同。于第5d終止培養(yǎng)，汲取各孔培養(yǎng)液留EP管，以放射免疫法檢測各孔皮質(zhì)酮濃度，計算各組均值。吸出培養(yǎng)液后取出各孔玻片，以細(xì)胞爬片免疫組化檢測細(xì)胞增殖因子(PCNA)的表示出，圖像軟件分析染色的陽性細(xì)胞個數(shù)，以平均光密度值來表示細(xì)胞染色的陽性率。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，實驗數(shù)據(jù)以xs表示。各組間吸光度值以及皮質(zhì)酮濃度比擬采用方差分析及兩兩比擬的SNK檢驗，細(xì)胞PCNA陽性率采用卡方檢驗。

2、結(jié)果

2.1大鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)

兩組腎上腺細(xì)胞原代培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)類似，胞體呈圓形或多角形，胞體大，細(xì)胞質(zhì)透亮，內(nèi)有很多大小較為規(guī)則的顆粒。實驗觀察在同批次等細(xì)胞濃度接種條件下，ET-1濃度10-10~-12mol/L組比對照組增殖速度更快，傳代時間更短(圖1，封1)。

2.2MTT法檢測ET-1對細(xì)胞增殖的影響

隨著培養(yǎng)液中ET-1濃度的升高，接種于96孔板中的10組細(xì)胞，吸光度值呈一單峰波形。在第6組(10-10mol/LET-1)處獲得最高值，單因素方差分析結(jié)果顯示各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。采用SPSS軟件行SNK各組均數(shù)間的多重比擬，發(fā)現(xiàn)處于波峰的6、7組(10-10~-11mol/L組)吸光度值與1~4，8~10組比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)(圖2)。

2.3PCNA的表示出及培養(yǎng)液中皮質(zhì)酮濃度

接種于24孔板的6組細(xì)胞，免疫組化檢測的PCNA表示出率與放射免疫法檢測的皮質(zhì)酮濃度呈大體一致的升降趨勢(表1)，在10-10~-11處獲得最高峰值，單因素方差分析結(jié)果顯示各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。采用SPSS軟件行SNK各組均數(shù)間的多重比擬，發(fā)現(xiàn)10-10~-11組與各組比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。細(xì)胞免疫組化圖像見圖3(封1)。

3、討論

腎上腺細(xì)胞體外培養(yǎng)是研究腎上腺細(xì)胞移植的第一步。在體外培養(yǎng)條件下可觀察細(xì)胞生長、增殖及分泌的特性。本實驗對大鼠腎上腺細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，培養(yǎng)經(jīng)過中觀察到加或不加ET-1，細(xì)胞增殖及生長速度呈一定差異。進(jìn)一步研究不同濃度ET-1對細(xì)胞的影響，分組檢測細(xì)胞增殖因子PCNA的表示出，及培養(yǎng)液中皮質(zhì)激素的濃度，發(fā)如今10-10~-11mol/L時，細(xì)胞增殖與分泌最旺盛，而且僅在這里適宜濃度下才具刺激細(xì)胞增殖的作用，在較高或較低濃度下均對細(xì)胞增殖無明顯影響。

在體外培養(yǎng)條件下，ET-1能促進(jìn)在正常情況下分裂增殖能力極弱的黑素細(xì)胞的增殖?？梢源龠M(jìn)大鼠骨髓內(nèi)皮前體細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞向s期和G期轉(zhuǎn)化。在體內(nèi)試驗中，VENDEIRA等發(fā)現(xiàn)ET-1可使腎上腺自體移植大鼠的血漿醛固酮和皮質(zhì)酮濃度在短時間內(nèi)顯著增加，結(jié)締組織被膜下分泌醛固酮的細(xì)胞顯著增生，提示其可能具有促進(jìn)皮質(zhì)細(xì)胞增生的作用。ROSSI等研究發(fā)現(xiàn)，人體腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞表示出ET-1的兩種受體(ETA、B)。ET-1通過作用于這兩種受體，可明顯促進(jìn)糖、鹽皮質(zhì)激素的分泌，通過ETA受體可促進(jìn)球狀帶細(xì)胞的增殖。而人體腎上腺能以自、旁分泌的形式產(chǎn)生少量ET-1，對腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞的功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。在體外培養(yǎng)條件下，ET-1只要在接近皮質(zhì)細(xì)胞體內(nèi)正常生理濃度時，才能發(fā)揮作用。

這與其他多肽類激素在受體飽和前濃度越高效果越顯著的特點不一樣。這也解釋了這次實驗為什么ET-1只要在適宜濃度(10-10~-12mol/L)時才具促進(jìn)皮質(zhì)細(xì)胞增殖與分泌的作用。因而，能夠以為ET-1是腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞生長代謝的重要調(diào)節(jié)激素，參加接近體內(nèi)條件下的ET-1，可有效促進(jìn)體外培養(yǎng)時皮質(zhì)細(xì)胞的增殖及分泌功能，增加皮質(zhì)細(xì)胞的活力，更有利于后期腎上腺細(xì)胞移植的進(jìn)行。同時其促進(jìn)球狀帶細(xì)胞增殖的作用，有望改善移植后球狀帶細(xì)胞缺乏、鹽皮質(zhì)激素水平低下的情況。

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