基因克隆的酶學(xué)基礎(chǔ)

關(guān)于基因克隆的酶學(xué)基礎(chǔ)第1頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第四章分子克隆的酶學(xué)基礎(chǔ)

基因的重組與分離，涉及到一系列相互關(guān)聯(lián)的酶促反應(yīng)。特別是核酸限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，使DNA分子的體外連接與切割成為可能。核酸限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶是重組DNA技術(shù)賴以創(chuàng)立的重要酶學(xué)基礎(chǔ)。第2頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三重組DNA實(shí)驗(yàn)中常使用的酶II型核酸內(nèi)切限制酶DNA連接酶大腸桿菌DNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄酶多核苷酸激酶末端轉(zhuǎn)移酶核酸外切酶IIIλ核酸外切酶堿性磷酸酶S1核酸酶Bal31核酸酶TaqDNA聚合酶第3頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)DNA的二維結(jié)構(gòu)第4頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三核酸酶通過(guò)切割相鄰的兩個(gè)核苷酸殘基之間的磷酸二酯鍵，導(dǎo)致核酸分子多核苷酸鏈發(fā)生水解斷裂的蛋白酶叫做核酸酶。專門水解斷裂RNA分子的叫做核糖核酸酶（RNase)

；特異水解斷裂DNA分子的則叫做脫氧核糖核酸酶（DNase）。從核酸分子末端開(kāi)始,一個(gè)核苷酸一個(gè)核苷酸地消化降解多核苷酸鏈,稱為核酸外切酶（exonuclease）；從核酸內(nèi)部切割磷酸二酯鍵使之?dāng)嗔褳樾∑蔚臑楹怂醿?nèi)切酶（endonuclease）。

第5頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第6頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第一節(jié)、核酸內(nèi)切限制酶與DNA分子的體外切割寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象(R/M)修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶核酸內(nèi)切限制酶EcoBEcoK（Restrictionandmodification）

第7頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三E.coli菌株λ噬菌體感染率

KBCE.coliK110-410-4E.coliB10-4110-4E.coliC111說(shuō)明K和B菌株中存在一種限制系統(tǒng)可排除外來(lái)的DNA第8頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三GAATTCCTTAAGEcoRIMEcoRI限制作用修飾作用G3’5’AATTCCTTAA5’3’GGAATTCCTTAAGMeMeMeEcoRI核酸內(nèi)切限制酶EcoRI及其修飾的甲基化酶MEcoR的限制與修飾作用第9頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第10頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第11頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三寄主的限制與修飾的作用保護(hù)自身的DNA不受限制;破壞外源DNA,使之迅速降解第12頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2.限制酶的發(fā)現(xiàn)60年代提出了限制性內(nèi)切酶和限制酶的概念1968年，首次從E.coliK中分離到限制酶

有特定的識(shí)別位點(diǎn)但沒(méi)有特定的切割位點(diǎn)，切割位點(diǎn)離識(shí)別位點(diǎn)達(dá)1000bp以上。1970年，美國(guó)約翰·霍布金斯大學(xué)的H.Smith找到HindⅡ限制性內(nèi)切酶。2006年2月為止共發(fā)現(xiàn)3773種限制酶,810種甲基化酶第13頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三核酸內(nèi)切限制酶

(restrictionendonuclease)是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列（4-8bp），并由此處切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶第14頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三3.核酸內(nèi)切限制酶的類型特性I型酶II型酶III型酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)3種亞基單一成分2種不同亞基輔助因子ATP,Mg2+,S-MetMg2+ATP,Mg2+,S-Met序列特異切割不是是是切割位點(diǎn)距識(shí)別序列1kb處隨機(jī)切割識(shí)別序列內(nèi)或附近距識(shí)別距離下游24-26bp處克隆中的作用無(wú)用十分有用用處不大第15頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三4.II型核酸內(nèi)切限制酶的基本特性在特異識(shí)別序列切割DNA分子；兩個(gè)單鏈切割部位在DNA分子上的分布,通常不直接相對(duì)；斷片往往具有互補(bǔ)的單鏈延伸末端。(1)基本特性第16頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三識(shí)別序列4-8個(gè)核苷酸序列①大部分呈旋轉(zhuǎn)對(duì)稱、反向重復(fù)結(jié)構(gòu)—回文結(jié)構(gòu)C-C-G-C-G-GG-G-C-G-C-C對(duì)稱軸切割位點(diǎn)切割位點(diǎn)第17頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

ABCC?B?A?ABB?A?

A?B?C?CBAA?B?AB②

部分識(shí)別序列不對(duì)稱:AccBSⅠ:CCG↓CTC

GGC↑GAGBssSⅠ:C↓TCGTG

GAGCA↑C③有一些限制酶可識(shí)別多種序列AccIGTMKAC(M:A或C)HindIIGTYRAC(Y:C或R:A或G)第18頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三識(shí)別位點(diǎn)在DNA分子中的頻率假定核苷酸隨機(jī)排列的情況下進(jìn)行

實(shí)踐中:如λDNA長(zhǎng)49kb，對(duì)于六堿基的酶應(yīng)該有12個(gè)切割位點(diǎn)，實(shí)際上要少一些，如BglII只有6個(gè)，BamHI只有5個(gè)，而SalI只有2個(gè)。44=25646=4096第19頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三基因組中堿基對(duì)的排列是非均勻的，盡管有的酶切序列中GC含量相同，但在基因組中出現(xiàn)的機(jī)率還是不一樣。

在

E.coli中AsoⅠ（GGCGCGCC）20kbNotⅠ（GCGGCCGC）200kb（常利用它出現(xiàn)的機(jī)會(huì)少來(lái)構(gòu)建圖譜）

EcoRⅠ和HindⅢ5kbSpeⅠ（ACTAGT）60kb第20頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三細(xì)菌基因組（Bacteriagenome)大多數(shù)富含A+T的細(xì)菌中，CCC和CGG的排列是最少見(jiàn)的，所以含有這兩種序列的識(shí)別序列出現(xiàn)的幾率就非常少。酵母基因組（Yeastgenome)G+C含量38%，在重復(fù)序列之外，富含G+C的識(shí)別序列就特別少。哺乳動(dòng)物中含CG序列的酶切位點(diǎn)稀少，大多CG序列是甲基化的第21頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三(2)、限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的末端粘性末端Cohesiveends(Machedends)

5‘粘性末端,3’突出末端平末端Bluntends非對(duì)稱突出端第22頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三①粘性末端Cohesiveends(Machedends)

DNA分子在限制性內(nèi)切酶的作用下形成具有互補(bǔ)堿基的單鏈延伸末端結(jié)構(gòu),能夠通過(guò)互補(bǔ)堿基的配對(duì)而重新連接起來(lái).EcoRI切割位點(diǎn)5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’a.在對(duì)稱軸的5’一側(cè)切割底物，

DNA雙鏈交錯(cuò)斷開(kāi)，形成5‘突出末端第23頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三EcoRI等產(chǎn)生的5‘粘性末端5‘…

G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…

C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘

…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘

…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5‘

…G-C-T-GA-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘

…C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C…5’OHPPOH第24頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三b.3’一側(cè)切割形成3’突出末端5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’PstI切割位點(diǎn)第25頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三PstI等產(chǎn)生的3‘粘性末端5‘

G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G3’3‘

C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C5’PstI37

℃5‘…

G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…

C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C

…5’

5‘…

G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G

…3’3‘…

C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C

…5’OHPOHP第26頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三5’突出端易于通過(guò)DNA激酶和32pATP進(jìn)行同位素標(biāo)記3’突出端是末端轉(zhuǎn)移酶的理想作用底物,在酶的作用下,容易使DNA片段帶上多核苷酸尾第27頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三在對(duì)稱軸上同時(shí)切割DNA的兩條鏈5’-GC↓GGCCGC-3’3’-CG↓CCGGCG-5’平末端Bluntends第28頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三PvuII等產(chǎn)生的平頭末端5‘

…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘

…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’5‘

…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘

…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’

PvuII37℃第29頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第30頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

同裂酶（Isoschizomer):識(shí)別位點(diǎn)的序列相同的限制性內(nèi)切酶

完全同裂酶:識(shí)別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同：如MobI和Sau3AI識(shí)別序列切割位點(diǎn)為GATC

不完全同裂酶:識(shí)別位點(diǎn)相同，但切點(diǎn)不同如AatII(GACGT↓

C)ZraI(GAC↓

GTC)同尾酶(Isocaudiners):識(shí)別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如

BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等EcoRⅠ

G↓AATTCMfeⅠ

C↓AATTCApoⅠR↓AATTYR:AorG;Y:CorT第31頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三具粘性末端的DNA片段結(jié)合方式

限制性片段末端連接作用a.具有EcoRI粘性末端的2條DNA片斷之間的連接b.具有粘性末端的同一條片斷的自我連接第32頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三屬名頭一個(gè)字母+種名頭兩個(gè)字母菌株名不同修飾體系系統(tǒng)名

Haemophilusinfluenzaed

嗜血流感桿菌d株

HindIII6.核酸內(nèi)切限制酶的命名法第33頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三DNA片段（線性載體）檢測(cè)末端長(zhǎng)度對(duì)切割的影響時(shí)，同樣發(fā)現(xiàn)識(shí)別序列的末端長(zhǎng)度對(duì)酶切效率有明顯影響，不同的酶對(duì)末端長(zhǎng)度的要求是不同。因此設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)，引入酶切位點(diǎn)時(shí)，在位點(diǎn)之外加上能夠滿足要求的堿基數(shù)目。雙酶切多克隆位點(diǎn)時(shí)選擇合適的酶切秩序第34頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三7、位點(diǎn)偏愛(ài)(sitepreference)某些限制酶對(duì)同一介質(zhì)中的有些位點(diǎn)表現(xiàn)出偏愛(ài)性切割，即對(duì)不同位置的同一個(gè)識(shí)別序列表現(xiàn)出不同的切割效率的現(xiàn)象稱作位點(diǎn)偏愛(ài)(1)現(xiàn)象：EcoRⅠ酶切割噬菌體中的5個(gè)位點(diǎn)時(shí)并不是隨機(jī)的，靠近右端的位點(diǎn)比分子中間的位點(diǎn)切割快10倍；EcoRⅠ對(duì)腺病毒2（adenvirus-2）DNA不同位置切點(diǎn)的切割速率也不同。EcoRⅠ和HindⅢ在噬菌體DNA中的切割速率分別有10倍和14倍的差異噬菌體DNA有4個(gè)SacⅡ位點(diǎn)，三個(gè)在中央，一個(gè)在右臂，對(duì)中央三個(gè)位點(diǎn)的酶切速度快50倍第35頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三8.II型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：對(duì)鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時(shí)酶切，對(duì)鹽濃度要求不同的酶，可采取下列方法：使用較貴的酶的鹽濃度，加大便宜酶的用量，同時(shí)酶解低鹽酶先切，然后補(bǔ)加鹽，高鹽酶再切一種酶先切，然后更換緩沖液，另一種酶再切酶切溫度要求不同時(shí),先低溫切,后高溫切第36頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三注意事項(xiàng)取少量酶最后加酶減少反應(yīng)體積反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)分裝（對(duì)于多個(gè)反應(yīng)）第37頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第38頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三9、影響酶活性的因素

(1)DNA的純度:蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA,SDS、NaCl等提高對(duì)低純度DNA酶切效率的方法:增加核酸內(nèi)切酶的用量,1ugDNA/10u;擴(kuò)大反應(yīng)體積,稀釋抑制因素延長(zhǎng)酶切保溫時(shí)間

第39頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三(2)甲基化程度:大腸桿菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基

(3)緩沖液

pH,Mg2+,DTT,BSA,10(X)(4)酶切消化反應(yīng)的溫度大多數(shù)為37℃,少數(shù)25-30℃smalI(25℃);ApaI(30℃)(5)DNA的分子構(gòu)型與切割DNA相比，EcoRⅠ、PstⅠ、SalⅠ需要至少2.5-10倍的酶來(lái)切割pBR322的超螺旋DNA。第40頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三(6)、酶的星星活性（staractivity)在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下，限制酶能切割與識(shí)別序列相似的序列，這個(gè)改變的特殊性稱星星活性星星活性是限制性內(nèi)切酶的一般性質(zhì)，任何一種限制酶在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下都能切割非典型位點(diǎn)

ApoⅠ、AseⅠ、BamHⅠ、BssH11、EcoRⅠ、EcoRV、HindⅢ、HinfⅠ、KpnⅠ、PstⅠ、PvuⅡ、SalⅠ、ScaⅠ、TaqⅠ和XmnⅠ等酶皆可表現(xiàn)出星星活性。第41頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端pH等會(huì)使一核酸內(nèi)切酶的識(shí)別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的Staractivity現(xiàn)象甘油濃度高（>5%）酶過(guò)量（>100U/l）離子強(qiáng)度低（<25mM）

pH值過(guò)高（>8.0）有機(jī)溶劑如PMSD（二甲基亞砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethbylformamide）、sulphalane等等.

用其它二價(jià)陽(yáng)離子如Mn++

、Cu++、Co++

或Zn++

代替了Mg++

。第42頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三10、酶切位點(diǎn)的引入（1）產(chǎn)生的5‘

突出端補(bǔ)平后，再連接可產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)（2）同尾末端的連接

不同的同尾酶切割DNA產(chǎn)生的末端再相互連接時(shí)，可產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)，同時(shí)原來(lái)的酶切位點(diǎn)消失

BamHⅠ（G↓GATCC）+BclⅠ（T↓GATCA）

AlwⅠ（GGATC4/5）第43頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（3）平末端的限制酶切割的DNA在連接后也可產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)PvuⅡ（CAGCTG）+EcoRV（GATATC）→

MobⅠ（GATC）第44頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)的終止65℃或80℃溫浴20分鐘加入EDTA（10mM)終止第45頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)、DNA連接酶

催化雙鏈DNA片段靠在一起的3’羥基與5’磷酸之間形成磷酸二酯鍵，使兩末端連接起來(lái)的酶。兩種DNA連接酶大腸桿菌連接酶:是一種相對(duì)分子量為74000的蛋白質(zhì),催化時(shí)需NAD+做能量,只能連接粘性末端T4噬菌體連接酶:相對(duì)分子質(zhì)量60000,需ATP做為能量來(lái)源,可連接粘性末端和平末端連接的條件:DNA3’端有游離的-OH,5’端有P;需要能量;必須是兩條雙鏈DNA.只封閉雙螺旋DNA骨架上的缺口第46頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三1．T4DNA連接酶（T4DNAligase）

T4噬菌體感染大腸桿菌產(chǎn)生底物：粘端、切口、平端的RNA（但效率低）或DNA影響因素：低濃度的聚乙二醇PEG（一般為10%）和單價(jià)陽(yáng)離子（150-200mMNaCl）可以提高平端連接速率。第47頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2．E.coliDNA連接酶（E.coliDNAligase）與T4DNAligase活性相似，但需煙酰胺-腺嘌呤二核苷酸（NAD+）參與。平端連接效率低，常用于置換合成法合成cDNA不能將RNA連接到DNA，不連接RNA。

第48頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三3．TaqDNA連接酶在兩個(gè)寡核苷酸之間進(jìn)行連接反應(yīng)，同時(shí)必須與另一DNA鏈形成雜交體，相當(dāng)于連接dsDNA中的缺口作用在45℃～65℃需NAD+?？捎糜跈z測(cè)等位基因的變化在PCR擴(kuò)增中引入寡核苷酸。它不可替代T4DNAligase。

第49頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三二、連接反應(yīng)的機(jī)理ATP（NAD+)提供激活的AMPATP與連接酶形成共價(jià)“連接酶-AMP”復(fù)合物，并釋放出焦磷酸PPi。AMP與連接酶的賴氨酸-氨基相連AMP隨后從連接酶的賴氨酸-氨基轉(zhuǎn)移到DNA一條鏈的5‘端P上,形成“DNA-腺苷酸”復(fù)合物

3‘-OH對(duì)磷原子作親核攻擊，形成磷酸二脂鍵，釋放出AMP第50頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第51頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三DNA連接酶第52頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第53頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三四、影響連接反應(yīng)的因素1反應(yīng)溫度

16℃反應(yīng)，4小時(shí)；4℃反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)夜2連接酶的濃度Weiss單位在37℃下20分鐘催化1nmol32p從焦磷酸根置換到[，

32P]ATP所需的酶量，定義為1個(gè)Weiss單位。NEB單位在20μl反應(yīng)體系中于16℃，使

HindⅢ切過(guò)的

DNA（300μg/ml，0.12μM5‘

末端）在30分鐘內(nèi)連接50%所需的酶量為1個(gè)NEB單位。

1NEB=0.015Weiss1Weiss=67NEB

平末端連接反應(yīng)的酶量大約是1-2個(gè)單位,粘性末端僅為0.1個(gè)單位,3ATP濃度4DNA片斷末端自身環(huán)化的單體，線性二聚體或多聚體，分子間連接，重組質(zhì)粒第54頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三插入片段與載體的濃度比例3-10：1；堿性磷酸酶處理載體目的片段的量的計(jì)算提高連接效率的方法第55頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)、

DNA聚合酶（DNApolymeraseⅠ）和反轉(zhuǎn)錄酶

作用：在有模板，引物存在下，把脫氧核糖單核苷酸（dNTP）連續(xù)加到雙鏈DNA分子引物鏈的3’-OH端，催化核苷酸的聚合作用。一基因工程中常用的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶，

KlenowfragmentT7DNA聚合酶

T4DNA聚合酶修飾過(guò)的T7DNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄酶第56頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三二、

DNA聚合酶的作用DNA聚合酶I與核酸雜交探針的置備；大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段與DNA末端標(biāo)記；T4DNA聚合酶和取代合成法標(biāo)記DNA片段；依賴于RNA的DNA聚合酶與互補(bǔ)DNA的合成；第57頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（一）、

E.coliDNA聚合酶Ⅰ

1.基本活性①5‘--3’DNA聚合酶活性。底物：為單鏈DNA，引物（帶3‘-OH基）或5‘

突出的雙鏈DNA

。②5‘--3’外切核酸酶活性底物：雙鏈DNA或DNA:RNA雜交體活性：從5‘

端降解雙鏈DNA，也降解RNA:DNA中的RNA（RNaseH活性）

第58頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三③3‘--5’外切酶活性底物：帶3'-OH的雙鏈DNA或單鏈DNA活性：3‘-OH端降解DNA，可被5’--3‘

聚合活性封閉，也可被帶5’

磷酸的dNMP所抑制。

在沒(méi)有dNTP的情況下，外切活性占主導(dǎo)地位，而當(dāng)存在足夠的dNTP時(shí)，外切活性和合成活性將處在動(dòng)態(tài)平衡中，結(jié)果使得雙鏈DNA成為平末端。

第59頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三DNA聚合酶I聚合活性第60頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三DNA聚合酶I的5’-3’核酸外切酶活性第61頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2．E.coliDNA聚合酶Ⅰ的用途切口平移法（nicktranslation）標(biāo)記DNA所有DNA聚合酶中只有此酶有此反應(yīng)

5’3’Mg2+,DNaseIdNTP,DNApolyI切口平移第62頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三探針標(biāo)記雙鏈DNA分子由DNaseI產(chǎn)生的單鏈缺口,帶有3’OH末端大腸桿菌DNA聚合酶I的5’3’外切酶活性從缺口5’-P一側(cè)移去一到數(shù)個(gè)核苷酸大腸桿菌DNA聚合酶I將32P標(biāo)記的核苷酸摻入取代原先被刪除的核苷酸重復(fù)進(jìn)行?和(d),使缺口沿著5’3’方向移動(dòng).第63頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（二）、KlenowDNA聚合酶

E.coliDNApolymeraseⅠlargefragment（Klenowfragment）

大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)蛋白酶（枯草桿菌蛋白酶）裂解而從全酶中除去5‘--3’

外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和3‘--5’

外切活性不受影響，分子量為76kDa。

第64頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三活性：與

E.coliDNA聚合酶Ⅰ的活性是一致的。但沒(méi)有5‘--3’

外切活性作用：①補(bǔ)平3'凹端DNA。要加足夠的dNTP②抹平DNA3'凸端。必須加足量dNTP③在cDNA克隆中合成第二鏈。④隨機(jī)引物標(biāo)記。

⑤應(yīng)用于Sanger雙脫氧鏈末端終止法的DNA測(cè)序（已經(jīng)被T7DNA聚合酶取代）

第65頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三DNA分子末端標(biāo)記第66頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（三）、T4噬菌體DNA聚合酶（T4phageDNApolymerase）

來(lái)源于T4噬菌體感染的E.coli，分子量為114kDa活性：

與Klenow酶相似，但3‘--5’外切活性強(qiáng)200倍

5’—3’聚合活性第67頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三用途①用于補(bǔ)平或標(biāo)記3‘凹端②取代合成（需高濃度dNTP一種)-末端標(biāo)記③標(biāo)記DNA片段

利用外切活性產(chǎn)生3‘凹端再補(bǔ)平第68頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（四）、T7噬菌體DNA聚合酶（T7phageDNApolymerase）

來(lái)源于T7噬菌體感染的

E.coli，為兩種緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合體，一種是噬菌體基因5蛋白，另一個(gè)是宿主蛋白的硫氧還蛋白。

聚合能力最強(qiáng)的DNA聚合酶；聚合過(guò)程中不形成二級(jí)結(jié)構(gòu)；可進(jìn)行單純的延伸或取代合成的途徑；在從5‘到3’方向的聚合過(guò)程中也有一定程度的3’5’核酸外切酶活性；將雙鏈DNA5’或3’突出末端轉(zhuǎn)變成平末端的結(jié)構(gòu)。第69頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三活性：與T4噬菌體DNA聚合酶和KlenowDNA聚合酶類似，但3‘--5’

外切活性為Klenow的1000倍。用途：

T7噬菌體DNA聚合酶可替代T4的功能并可用于長(zhǎng)模板的引物延伸。

第70頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三修飾的T7DNA聚合酶切除了99%以上的3‘--5’

外切活性（V1）完全除去V2用于測(cè)序反應(yīng)第71頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（五）、耐熱DNA聚合酶

在高溫下有DNA聚合活性，來(lái)自噬高溫的細(xì)菌，主要用于PCR反應(yīng)，如TaqDNA聚合酶、VentDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶、

PwoDNA聚合酶和

TthDNA聚合酶等第72頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（六）、反轉(zhuǎn)錄酶（Reversetranscriptase）

依賴于RNA的DNA聚合酶，也叫做RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶或反轉(zhuǎn)錄酶?；钚裕河?‘--3’

合成DNA活性來(lái)自AMV（禽成髓細(xì)胞瘤病毒）或

Mo-MLV（鼠白血病病毒，又稱M-MuLV）第73頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

AMV反轉(zhuǎn)錄酶包含兩條多肽鏈；

具5‘--3’DNA聚合活性很強(qiáng)的RNA酶H活性（降解與DNA雜交的RNA）在cDNA合成開(kāi)始時(shí)，引物和mRNA模板雜交體可成為RNaseH的底物，此時(shí)，模板的降解和cDNA的合成相競(jìng)爭(zhēng)；反應(yīng)終止時(shí)，RNaseH可在正在增長(zhǎng)的DNA鏈近3'端切割模板，趨向于抑制cDNA的產(chǎn)量并限制其長(zhǎng)度。在42℃（雞的正常體溫）能有效發(fā)揮作用，能有效地拷貝較復(fù)雜的mRNA，但提純過(guò)程中易被內(nèi)切酶污染。

第74頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶是單鏈多肽，84kDa，其RNaseH活性弱，有利于合成較長(zhǎng)cDNA。其基因工程產(chǎn)品純度高。第75頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2用途cDNA（complememtaryDNA)克隆5’突出DNA的補(bǔ)平和標(biāo)記測(cè)序反應(yīng)第76頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三3活性5’3’DNA聚合活性

RNAorDNA為模板及帶3‘-OH的RNA或DNA引物RNaseH活性第77頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三反轉(zhuǎn)錄酶的5’-3’方向的DNA聚合酶I活性第78頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三反轉(zhuǎn)錄酶的5’-3’方向和3’-5’方向的核糖核酸外切酶活性（RnaseH)雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈第79頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第四節(jié)、

DNA及RNA的修飾酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶與同聚物加尾T4多核苷酸激酶與DNA分子5’末端的標(biāo)記堿性磷酸酶與DNA脫磷酸作用第80頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三一、末端轉(zhuǎn)移酶（terminaltransferase）來(lái)源于小牛胸腺，是一種不依賴于模板的DNA聚合酶。在二價(jià)陽(yáng)離子存在下，末端轉(zhuǎn)移酶催化dNTP加于DNA分子的3‘

羥基端。

T或C首選CO2+

；

A或G首選Mg2+

第81頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三TdT的基本特性5‘p3‘HOOH3‘

p5‘

TdTCo2+

dATP5‘p3‘HO

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

OH3‘

p5‘

第82頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三末端轉(zhuǎn)移酶terminaltransferase（TdT)第83頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三1底物DNA可短至3個(gè)核苷酸，對(duì)3‘

羥基突出末端的底物作用效率最高低離子強(qiáng)度時(shí)，5‘

突出端或平端的DNA也可作為底物2用途在cDNA或載體3‘

末端加同聚尾用于克隆末端標(biāo)記第84頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三同聚物加尾法再生HindIII識(shí)別位點(diǎn)第85頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三二、T4多核苷酸激酶（T4polynucleotidekinase）

是一種磷酸化酶，可將ATP的-磷酸基轉(zhuǎn)移至DNA或RNA的5‘

末端。分子克隆應(yīng)用中呈現(xiàn)兩種反應(yīng)：正反應(yīng)：將ATP的-磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到無(wú)磷酸的DNA5‘

端。

用于對(duì)缺乏5‘-磷酸的DNA進(jìn)行磷酸化,催化5‘突出末端磷酸化速度比平末端或5’末端磷酸化速度快得多。交換反應(yīng)：在過(guò)量ADP和-32PATP存在的情況下，該激酶可將磷酸化的5‘

端磷酸轉(zhuǎn)移給ADP，然后DNA從ATP中-磷酸而重新磷酸化。

使用的ATP均為放射性同位素標(biāo)記[-

-32p]ATP，那么反應(yīng)的產(chǎn)物都變成末端獲得放射性標(biāo)記的DNA。

第86頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第87頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三T4多核苷酸激酶的交換活性第88頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三三、堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）

主要來(lái)源于:牛小腸堿性磷酸酶（Calfintestinalalkalinephosphatase），簡(jiǎn)稱CIP或CIAP細(xì)菌的堿性磷酸酶（Bacterialalkalinephosphatase,BAP）第89頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三作用催化除去DNA或RNA5‘

磷酸的反應(yīng)用于防止DNA片段自身連接，或標(biāo)記（5‘端）前除DNA或RNA5'磷酸第90頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第91頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第92頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第四節(jié)

其它酶一、依賴于DNA的RNA聚合酶（DNAdependentRNApolymerase）

SP6噬菌體RNA聚合酶（來(lái)源于感染鼠傷寒沙門氏菌LT2菌株）

T4或T7噬菌體RNA聚合酶（來(lái)源于噬菌體感染的大腸桿菌）。第93頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三1．活性

這些RNA聚合酶實(shí)際上為轉(zhuǎn)錄中的RNA合成酶，識(shí)別DNA中各自特異的啟動(dòng)子序列，并沿此dsDNA模板起始RNA的合成。它與DNA聚合酶不同，無(wú)需引物，但需識(shí)別特異性位點(diǎn)。2．用途

①體外合成RNA分子。

②用于表達(dá)外源基因。

第94頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三二、核酸外切酶

（nuclease）

單鏈外切核酸酶大腸桿菌外切核酸酶I和VII：兩頭降解，產(chǎn)生2-25bp寡核苷酸片段雙鏈外切核酸酶大腸桿菌外切核酸酶III:雙鏈DNA從3‘OH末端開(kāi)始降解，釋放5’單核苷酸從dsDNA3‘-OH逐一去除單核苷酸的反應(yīng)，底物為dsDNA或線狀和帶切口或缺口的環(huán)狀DNA，反應(yīng)結(jié)果是在dsDNA上產(chǎn)生長(zhǎng)長(zhǎng)的單鏈區(qū)。該酶還有對(duì)無(wú)嘌呤DNA特異性內(nèi)切核酸酶活性、RNaseH活性和3‘-磷酸酶活性（去磷酸）。不降解核酸內(nèi)的磷酸二酯鍵，也不降解單鏈DNA及帶3‘

突出的dsDNA。持續(xù)作用能力不強(qiáng)，產(chǎn)物為切割程度不相上下的群體，有利于分離長(zhǎng)短不等的DNA。

第95頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第96頁(yè)，共107頁(yè)，2023年，2月20日，星期三三單鏈核酸內(nèi)切酶1．BAL31核酸酶（BAL31nuclease）

來(lái)源于交替單胞菌（Alteromonasespejiana）BAL31主要活性為單鏈特異的核酸內(nèi)切酶活性,從3’羥基末端迅速降解DNA

依賴Ca++,而且EGTA(乙二醇-雙-(2-氨基乙基)四乙酸）可抑制其活性。

雙鏈的核酸外切酶活性：可從線性DNA兩條鏈的兩端迅速去除單核苷酸第97頁(yè)，共10