NG2與少突狀膠質(zhì)細胞

在(Zai)EAE中，NG2與神經(jīng)炎癥、血腦屏障改變、OPCs反應(yīng)及DCs激活有關(guān)影響因子：12.213Accepted:15March2016

第一頁，共五十二頁。

Moransard等人(Ren)研究EAE在NG2KOmice的作用，發(fā)現(xiàn)與WTmice并沒有發(fā)現(xiàn)任何差異

而本作者采用通過樣的方法，發(fā)現(xiàn)NG2在EAE中發(fā)揮著重要的作用第二頁，共五十二頁。實驗方(Fang)法工具1.ELISA---酶聯(lián)免疫吸附試驗2.EAE建模方法3.工具鼠4.bonemarrowchimeramouse5.血管內(nèi)皮通透性試驗第三頁，共五十二頁。1.ELISA---酶聯(lián)免疫吸附(Fu)試驗第四頁，共五十二頁。OD第五頁，共五十二頁。2.EAE建模(Mo)方法EAE模型是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)小血管周圍出現(xiàn)單核細胞浸潤及髓鞘脫失為特征的自身免疫性疾病，是人類多發(fā)性硬化（MS）的理想動物模型。

雌鼠步驟：①

MOG35-55(200ug)+PBS水溶液100ul

②

H37RA(結(jié)核分枝桿菌300ug)+然后300ul不完全弗氏佐劑超聲乳化③尾靜脈一次每只0.1ml+百日咳病毒（原液400ng/ul)用PBS稀釋使用,每只老鼠腹腔注射0.1ml，第2天注射。皮下兩側(cè)尾靜脈第六頁，共五十二頁。利用同源重組技術(shù)WTC57Bl/6Jmice×F1NG2+/-MiceF2NG2-/-Mice&NG2+/+Mice

WTMice

純合(He)的NG2KOmice3.工具鼠theinsertionofa1100-bpneomycin-resistance×第七頁，共五十二頁。F1第八頁，共五十二頁。WT第九頁，共五十二頁。4.bonemarrowchimeramouse

骨髓嵌合體小鼠=淋巴造血系統(tǒng)嵌合體=放射性嵌合體①徹底破壞受者機體骨髓的造血系統(tǒng)，最大程度的殺滅腫瘤細胞②骨髓含造血干細胞，血液也有③白血?、芡?Tong)基因型第十頁，共五十二頁。5.FITC-dextran血管內(nèi)皮通透性試驗

腦微血管內(nèi)皮細胞（BMEC）擁有豐富的酶系統(tǒng)，但缺乏收縮蛋白，故正常生理狀態(tài)下組胺、5-羥色胺、白三烯C4等血管活性物質(zhì)較少影響血腦屏(Ping)障而病理狀態(tài)下因BMEC酶系統(tǒng)活性改變，活性物質(zhì)將影響B(tài)MEC，從而進一步影響血腦屏障的通透性。開放的血腦屏障能讓大分子如右旋糖酐通過第十一頁，共五十二頁。

在(Zai)EAE中，NG2與神經(jīng)炎癥、血腦屏障改變、OPCs反應(yīng)及DCs激活有關(guān)第十二頁，共五十二頁。Introduction1.NG2-硫酸軟骨(Gu)素蛋白多糖，OPCs和激活的周細胞表達，NG2、PDGFRα是OPCs（

NG2cell）的marker，當其分化成少突狀膠質(zhì)細胞時，這兩個marker不表達①CNS損傷時，OPCs反應(yīng)性增殖，表達NG2的細胞在炎癥部位聚集

②EAEandMS，急性期，OPC的數(shù)量顯著增加，在慢性后期中，顯著減少③OPCs分化為少突狀膠質(zhì)細胞，促進髓鞘的生成

④CNS微血管中，周細胞促進血管生成，促進緊密連接的形成，從而保護BBB通透性和維持內(nèi)皮細胞屏障的功能；CNS損傷時，充當炎癥傳感器，免疫監(jiān)視，執(zhí)行中性粒細胞

巨噬細胞的功能

第十三頁，共五十二頁。2.表明NG2與CNS損(Sun)傷的炎癥息息相關(guān)

膠質(zhì)瘢痕 :①由于缺氧、低血糖、感染、中毒等均能引起腦組織的損傷而導(dǎo)致星形膠質(zhì)細胞增生。反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞增生是腦組織損傷的修補反應(yīng)②減弱星形膠質(zhì)細胞增生，有利于改善腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)

膠質(zhì)瘢痕形成是一個極其復(fù)雜的病理生理過程，包括組織水腫、炎癥反應(yīng)、局部缺血、谷氨酸受體高反應(yīng)性、脂質(zhì)過氧化作用、鈣離子超負荷、自由基損傷、反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞增生

第十四頁，共五十二頁。EAEBBB滲透性改變的疾病

3.NG2炎癥浸(Jin)潤CNS損傷有關(guān)第十五頁，共五十二頁。4.NG2KOmice，EAE的臨床表現(xiàn)型更輕微Unexpectedly，NG2有助于EAE的發(fā)病機(Ji)制

OPCs及周細胞表達NG2原因免疫細胞也表達NG2第十六頁，共五十二頁。Abstract在成年人的CNS中，OPCs表達NG2在病理情況下，NG2是周細(Xi)胞激活的markerEAEBBB滲透性改變的疾病

NG2炎癥浸潤CNS損傷有關(guān)第十七頁，共五十二頁。1.在NG2KOmice中誘導(dǎo)EAE的發(fā)生①相比WT,NG2KOmiceEAE臨床評分更輕微②OPCs的數(shù)量在EAE誘導(dǎo)后無改變2.發(fā)現(xiàn)NG2在免疫細胞中表達，如T細胞、巨噬細胞樹突狀細胞3.評估了T細胞致腦炎性物質(zhì)①WTNG2KOmice增殖的致腦炎物質(zhì)MOG35-55水平相同

②However，NG2KOmiceT細胞反應(yīng)偏向于Th2型反應(yīng)4.是否分泌了炎性因子(Zi)，聯(lián)想到DCs，測定IL-12表達情況

①NG2KOmice中，IL-12-expressingCD11c+細胞顯著減少②更重要的是，在WTmice中，IL-12的表達在CD11c+NG2-cell比CD11c+NG2+cell要更少5.是否NG2與免疫系統(tǒng)和CNS水平有關(guān)-----骨髓嵌合體老鼠①相比接受WT骨髓的mice，接受NG2KOmice骨髓的，EAE癥狀更輕微

？研究思路第十八頁，共五十二頁。Results1.NG2KOmice的EAE表現(xiàn)型更輕微2.NG2KOmice骨髓中，EAE相關(guān)的炎癥更輕微3.EAE

inducedNG2KOmice，OPCs的數(shù)量無改變4.

EAE

inducedNG2KOmice，緊密蛋白的連續(xù)性分布與(Yu)BBB功能有關(guān)5.免疫細胞表達NG26.NG2KOmice,T細胞對MOG反應(yīng)，炎癥較少7.NG2KOmice，IL-12表達較少&NG2參與DC的激活8.NG2不參與巨噬細胞的極化

9.NG2KOmice,可調(diào)節(jié)的免疫反應(yīng)&保守的BBB導(dǎo)致了EAE輕微的表現(xiàn)型第十九頁，共五十二頁。1.NG2KOmice的EAE表現(xiàn)型更(Geng)輕微

Arepresentativeofthreeindependentexperimentsispresented

第二十頁，共五十二頁。26/33×100%=78.78%diseaseincidence(84±4.5vs.100%inWTmice)Diseaseonsetwasdelayed(13.06±3.66vs.8.16±1.71daysforWTmice)

Arepresentativeofthreeindependentexperimentsispresented

第二十一頁，共五十二頁。CD45：血管周浸潤的(De)炎性細胞，巨噬細胞CoIIIV:microvesselbasallaminaTO-PRO-3：細胞核

第二十二頁，共五十二頁。脊髓(Sui)截面染色小膠質(zhì)細胞&巨噬細胞激活的星形膠質(zhì)細胞Stressmarker-positivecells

浸潤的T細胞第二十三頁，共五十二頁。大腦皮(Pi)層脊髓第二十四頁，共五十二頁。2.NG2KOmice骨髓(Sui)中，EAE相關(guān)的炎癥更輕微

EAE相關(guān)的促炎性基因的mRNA的表達情況第二十五頁，共五十二頁。3.EAE

inducedNG2KOmice，OPCs的(De)數(shù)量無改變

EAEandMS，急性期，OPC的數(shù)量顯著增加，在慢性后期中，顯著減少（脫髓鞘過程中）WhetherNG2缺失影響少突狀膠質(zhì)細胞的免疫反應(yīng)？

首先要證明NG2是不存在的或不生成免疫熒光定量分析OPCs數(shù)量

確定PDGFRα確定NG2的確敲除了，且在NG2KOmice中不表達第二十六頁，共五十二頁。EAE第二十七頁，共五十二頁。theinsertionofa1100-bp

neomycin-resistance第二十八頁，共五十二頁。在NG2KOmice中，NG2特異性的信號沒有被發(fā)現(xiàn)（基于NG2敲除的前提下(Xia)，理解為沒有生成），實驗更加嚴謹---------IFN-γEAE研究NG2缺失第二十九頁，共五十二頁。免疫熒光定量(Liang)分析OPCs數(shù)量第三十頁，共五十二頁。MBP:神經(jīng)纖維(Wei)APP:損傷的軸突第三十一頁，共五十二頁。4.EAE

inducedNG2KOmice，緊密蛋白(Bai)的連續(xù)性分布與BBB功能有關(guān)周細胞：神經(jīng)血管形成BBB功能NG2KOmice中，是否神經(jīng)炎癥水平降低與血腦屏障特異性改變有關(guān)

研究了內(nèi)皮細胞的緊密連接蛋白、claudin-5、occludin（咬合蛋白）的結(jié)構(gòu)和功能的分布血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能的改變與緊密連接蛋白的表達變化有關(guān)第三十二頁，共五十二頁。第三十三頁，共五十二頁。第三十四頁，共五十二頁。第三十五頁，共五十二頁。Dextran-FITCexperiments–血管內(nèi)皮(Pi)通透性試驗

NG2KOmice周細胞缺乏NG2影響TJs的動態(tài)組合可替換信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑第三十六頁，共五十二頁。5.免疫細胞表(Biao)達NG2

NG2KOmice，巨噬細胞產(chǎn)生更少的炎性物質(zhì)，浸潤能力減弱

NG2可能與其他炎性細胞浸潤CNS有關(guān)，

whetherNG2isexpressedinWTmiceornotbycellsofthesystemicimmunesystem.?

TCellBMDDCsBMDMs第三十七頁，共五十二頁。CD3:TCellCD11c：BMDDsCD11b:BMDMsDAPI：核酸(Suan)，DNAAT區(qū)?第三十八頁，共五十二頁。6.NG2KOmice,T細胞對MOG反應(yīng)，炎癥(Zheng)較少

是否缺乏NG2的免疫細胞會影響疾病的表達情況

觀察TCell的增殖和細胞因子的表達情況

ConA:+positive①植物血凝素類多克隆刺激劑，通過細胞表面的CD3-TCR復(fù)合體作用于T細胞,對小鼠T細胞增殖作用更強一些

②單獨anti-CD3包被在板上能刺激純化T細胞增殖，加入anti-CD28作用更強

PLP:-negative

MO35-55:EAE第三十九頁，共五十二頁。6.NG2KOmice,T細胞(Bao)對MOG反應(yīng)，炎癥較少

是否缺乏NG2的免疫細胞會影響疾病的表達情況

觀察TCell的增殖和細胞因子的表達情況

ConA:+positive①植物血凝素類多克隆刺激劑，通過細胞表面的CD3-TCR復(fù)合體作用于T細胞,對小鼠T細胞增殖作用更強一些

②單獨anti-CD3包被在板上能刺激純化T細胞增殖，加入anti-CD28作用更強

PLP:-negative

MO35-55:EAE第四十頁，共五十二頁。6.NG2KOmice,T細胞對MOG反應(yīng)，炎(Yan)癥較少

是否缺乏NG2的免疫細胞會影響疾病的表達情況

觀察TCell的增殖和細胞因子的表達情況

ConA:+positive①植物血凝素類多克隆刺激劑，通過細胞表面的CD3-TCR復(fù)合體作用于T細胞,對小鼠T細胞增殖作用更強一些

②單獨anti-CD3包被在板上能刺激純化T細胞增殖，加入anti-CD28作用更強

PLP:-negative

MO35-55:EAE第四十一頁，共五十二頁。6.NG2KOmice,T細胞對MOG反應(yīng)(Ying)，炎癥較少

是否缺乏NG2的免疫細胞會影響疾病的表達情況

觀察TCell的增殖和細胞因子的表達情況

ConA:+positive①植物血凝素類多克隆刺激劑，通過細胞表面的CD3-TCR復(fù)合體作用于T細胞,對小鼠T細胞增殖作用更強一些

②單獨anti-CD3包被在板上能刺激純化T細胞增