動(dòng)物細(xì)胞融合與單克隆抗體技術(shù)

關(guān)于動(dòng)物細(xì)胞融合與單克隆抗體技術(shù)第1頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三5.1細(xì)胞融合與雜交第2頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三一、概念細(xì)胞融合：兩個(gè)或兩個(gè)以上相同的細(xì)胞合并形成一個(gè)細(xì)胞的過程。細(xì)胞雜交：兩個(gè)或兩個(gè)以上不同的細(xì)胞合并形成一個(gè)細(xì)胞的過程，包括種內(nèi)雜交和種間雜交。第3頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三二、原理

異核體階段雜種細(xì)胞形成同核體異核體合核體關(guān)鍵是膜的融合：兩個(gè)親本細(xì)胞并列，細(xì)胞膜接觸膜組織局部破壞形成包圍融合細(xì)胞的連續(xù)胞膜第4頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三細(xì)胞融合過程可分為：凝集：細(xì)胞凝集與細(xì)胞膜的糖蛋白有關(guān)蛋白質(zhì)分子重新分布：是細(xì)胞融合的必要前提脂質(zhì)分子重排：是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞融合的關(guān)鍵胞質(zhì)合并：后續(xù)的穩(wěn)定步驟。第5頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三1.病毒介導(dǎo)融合：（1）誘導(dǎo)原理三、細(xì)胞融合方法（2）操作步驟(3)病毒誘導(dǎo)融合的特點(diǎn)第6頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三2.化學(xué)融合劑誘導(dǎo)融合（P107）（1）化學(xué)融合劑的種類三、細(xì)胞融合方法（2）PEG誘導(dǎo)的原理

（3）PEG誘導(dǎo)的特點(diǎn)sp3雜化，有孤對(duì)電子，可與H2O形成H鍵而具有強(qiáng)烈的吸水性。第7頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三3.電融合技術(shù)

三、細(xì)胞融合方法第8頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三電融合的特點(diǎn)

①融合頻率高，對(duì)細(xì)胞傷害?、谡医蛔冸妶?chǎng)對(duì)細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)間作用會(huì)損傷細(xì)胞③非特異性融合三、細(xì)胞融合方法磁-電融合聲-電融合電-機(jī)械融合細(xì)胞化學(xué)聚集融合生物素-抗生物素-抗原-抗體橋聯(lián)第9頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三4.激光誘導(dǎo)細(xì)胞融合（1）原理：光鑷所形成的光學(xué)勢(shì)阱會(huì)把細(xì)胞拉向光束中心，鉗住細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)生物粒子的遠(yuǎn)距離、非接觸式捕獲。（2）特點(diǎn)：可對(duì)單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行操作，但設(shè)備昂貴，操作技術(shù)要求高。三、細(xì)胞融合方法第10頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三5.微流控芯片的細(xì)胞融合技術(shù)（1）原理：將微通道網(wǎng)絡(luò)整合到生物芯片上，使得微流控系統(tǒng)成為細(xì)胞融合的理想平臺(tái)（2）特點(diǎn)：實(shí)現(xiàn)大量單個(gè)成對(duì)細(xì)胞的融合（二）細(xì)胞融合的方法第11頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三6.細(xì)胞融合的影響因素細(xì)胞的種類和性質(zhì)細(xì)胞表面性質(zhì)細(xì)胞種類親本細(xì)胞的親緣關(guān)系融合溫度及PH等環(huán)境條件離子強(qiáng)度及離子種類三、細(xì)胞融合方法第12頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三四、融合子檢出的選擇系統(tǒng)遺傳互補(bǔ)選擇營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)選擇抗性互補(bǔ)選擇形態(tài)特征互補(bǔ)選擇生長(zhǎng)特性選擇第13頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三遺傳互補(bǔ)選擇-HAT培養(yǎng)基篩選H,次黃嘌呤;A,氨基喋呤;T,胸腺嘧啶DNA內(nèi)源性途徑(主要途徑)谷氨酰胺or單磷酸尿苷酸四氫葉酸AHT外源性途徑(旁路途徑)(Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase)

次嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶

(HGPRT

)胸腺嘧啶激酶

(TK)(Thymidinekinase)B淋巴細(xì)胞：HGPRT+，

TK+骨髓瘤細(xì)胞：HGPRT-，

TK-短期存活，最終死亡死亡外源性途徑(旁路途徑)雜交瘤細(xì)胞：HGPRT+，TK+長(zhǎng)期存活第14頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三五、融合子的鑒定方法細(xì)胞學(xué)鑒定：染色體數(shù)目，形態(tài)結(jié)構(gòu)生化分析：同工酶譜為雙親的總和分子生物學(xué)鑒定：DNA探針第15頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三六、細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用基因定位和人類基因圖譜繪制腫瘤免疫的研究：腫瘤樹突狀細(xì)胞疫苗單克隆抗體的生產(chǎn)動(dòng)物新品種的培育第16頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三5.2雜交瘤技術(shù)一、B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)原理：細(xì)胞融合+克隆選擇理論

第17頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三EmilvonBehring,1901,antitoxinsGeoregesKohlerandCesarMilstein,1984,monoclonalantibodySusumuTonegama,1987,structureofIggeneGeraldEdelmanandRodneyPorter,1972,structureofantibodyPaulEhrlich,1908,productionofantibodyNobelPrizewinners第18頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三免疫球蛋白的單體分子結(jié)構(gòu)

第19頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三第20頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三第21頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三第22頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三第23頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三第24頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三第25頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三第26頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三1.親本細(xì)胞的制備（1）骨髓瘤細(xì)胞特性

①不能分泌抗體②HGPRT－或TK－缺陷型③長(zhǎng)命細(xì)胞二、B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的操作流程（2）B淋巴細(xì)胞特性：①分泌抗體②短命細(xì)胞第27頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三動(dòng)物免疫：目的：在細(xì)胞融合后獲得盡可能多的分泌針對(duì)于該目標(biāo)抗原的特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞.特定目標(biāo)抗原動(dòng)物免疫脾臟中B淋巴細(xì)胞B淋巴細(xì)胞大量增殖刺激能分泌針對(duì)于該抗原的特異性抗體第28頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三2.飼養(yǎng)細(xì)胞的制備及作用飼養(yǎng)細(xì)胞的作用：提高培養(yǎng)細(xì)胞的密度，使待克隆細(xì)胞容易生存與繁殖。腹腔細(xì)胞能清除培養(yǎng)中的死亡細(xì)胞，從而促進(jìn)單個(gè)細(xì)胞克隆的生長(zhǎng)。飼養(yǎng)細(xì)胞能釋放諸如細(xì)胞生長(zhǎng)因子類物質(zhì)，起到促進(jìn)細(xì)胞分裂、增殖的作用。飼養(yǎng)細(xì)胞的制備：腹腔巨噬細(xì)胞第29頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三3.細(xì)胞融合技術(shù)：脾細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞)骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)命不分泌抗體分泌抗體短命分泌抗體長(zhǎng)命K?hler和Milstein,19751984年Nobel醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)第30頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三4.HAT選擇性培養(yǎng)基的篩選融合后細(xì)胞混合液HAT培養(yǎng)基2weekslaterHT培養(yǎng)基正常培養(yǎng)基1weeklater第31頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三雜交瘤細(xì)胞的篩選：脾細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞)骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞脾細(xì)胞/脾細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞/骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞脾細(xì)胞篩選出不能長(zhǎng)期存活不能長(zhǎng)期存活第32頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三5.陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選（抗體的檢測(cè)）常用方法：要求：

簡(jiǎn)便、快速、敏感;在短時(shí)間內(nèi)能檢測(cè)大量樣品酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)間接免疫熒光法(Indirectimmunofluorescence,IFA)放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)雙相擴(kuò)散法第33頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)抗原第1抗體酶第2抗體待檢雜交瘤培養(yǎng)上清液底物有色產(chǎn)物酶標(biāo)儀檢測(cè)技術(shù)原理：第34頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三6.雜交瘤細(xì)胞的克隆培養(yǎng)常用克隆化方法：有限稀釋法軟瓊脂平板法顯微操作法1個(gè)細(xì)胞/96孔飼養(yǎng)細(xì)胞(feedercells)ELISA法檢測(cè)單克隆雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清，選出分泌特異性抗體的陽性孔，所分泌抗體即為單克隆抗體。第35頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三7.雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇目的：保種方法：離心收集雜交瘤細(xì)胞懸液，用含10％DMSO和10％FBS的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度，若短期保存，可置-80度冰盒中；若長(zhǎng)期保存，則從冰盒轉(zhuǎn)入液氮中。復(fù)蘇：如果凍存的細(xì)胞是來自96孔板的一孔，復(fù)蘇后也應(yīng)接種到96孔板的一個(gè)孔中第36頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三8.單克隆抗體的規(guī)?；a(chǎn)

主要有兩種方法（1）體外法：用人工反應(yīng)器大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞（2）體內(nèi)法：用生物體作為細(xì)胞反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞第37頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)第38頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三微載體培養(yǎng)第39頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三9.融合后雜交瘤不生長(zhǎng)的原因分析：聚乙二醇有毒小牛血清的質(zhì)量有問題；支原體污染HAT有問題第40頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三10.雜交瘤細(xì)胞不分泌抗體或停止分泌抗體原因分析

融合后經(jīng)HAT選擇有細(xì)胞克隆出現(xiàn)，但不能篩選出產(chǎn)生特異抗體的雜交瘤，常見原因是：抗體檢測(cè)法不夠敏感HAT選擇失敗動(dòng)物免疫不成功染色體丟失和克隆競(jìng)爭(zhēng)第41頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三三、T淋巴細(xì)胞雜交瘤概念：T淋巴細(xì)胞亞群經(jīng)有絲分裂原刺激后能分泌多種淋巴因子。將之與胸腺瘤或淋巴瘤BW5147株融合而建立的T淋巴細(xì)胞雜交瘤株。淋巴因子：干擾素、白細(xì)胞介素2、巨噬細(xì)胞激活因子等第42頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三四、抗體的發(fā)展現(xiàn)狀人鼠型雜交瘤：人淋巴細(xì)胞+鼠骨髓瘤細(xì)胞問題：易丟失人染色體人型雜交瘤：人淋巴細(xì)胞+人骨髓瘤細(xì)胞問題：①尚未獲得理想的瘤系，②建株困難，抗體產(chǎn)量太低等1.人源單克隆抗體第43頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三2.鼠源單克隆抗體鼠衍生雜交瘤：?jiǎn)栴}：①出現(xiàn)人抗鼠抗體反應(yīng)②鼠抗體不能有效激活人免疫系統(tǒng)第44頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三(1)抗體DNA重組

通過基因工程技術(shù)用人蛋白取代鼠抗體的恒定區(qū)，仍保留鼠蛋白在抗體中的可變區(qū)，形成約含有65%人蛋白的嵌合抗體。

問題：含有一定量的鼠蛋白，親和力差，產(chǎn)量低，純化費(fèi)用高，臨床效果差3.基因工程抗體第45頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三人－鼠嵌合抗體第46頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三第47頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三(2)噬菌體表達(dá)技術(shù)

用體外基因克隆技術(shù)將B細(xì)胞全套可變區(qū)基因克隆出來，插入噬菌體表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化工程細(xì)菌進(jìn)行表達(dá)。問題：①?zèng)]有經(jīng)過天然抗體成熟，親和力低②需要相當(dāng)復(fù)雜的抗體基因技術(shù)和多輪篩選才能獲得。3.基因工程抗體第48頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三(3)外因鼠技術(shù)

將小鼠體內(nèi)產(chǎn)生抗體的基因滅活，然后將人的抗體基因轉(zhuǎn)入小鼠早期胚胎，獲得含有人抗體的小鼠—外因鼠。前景：①100%全人源化單克隆抗體

②2011年全球有7種治療性全人單克隆抗體獲得美國(guó)FDA和歐盟的批準(zhǔn)，這些全人抗體幾乎完全由轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生。3.基因工程抗體第49頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三五、單克隆抗體的應(yīng)用疾病的診斷或特異性抗原（蛋白）的檢測(cè)免疫膠體金快速檢測(cè)試紙第50頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三疾病的診斷或特異性抗原（蛋白）的檢測(cè)被動(dòng)免疫治療大分子蛋白的提純生物導(dǎo)向藥物五、單克隆抗體的應(yīng)用第51頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三生物導(dǎo)向藥物第52頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三H7N9新型