動(dòng)物細(xì)胞融合與雜交

關(guān)于動(dòng)物細(xì)胞融合與雜交第1頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第一節(jié)細(xì)胞融合與雜交概述一.概念和目的細(xì)胞融合：自然或人為條件下，兩個(gè)或兩個(gè)以上細(xì)胞相互接觸，發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合形成融合細(xì)胞的現(xiàn)象。細(xì)胞雜交：不同類型的細(xì)胞之間發(fā)生的融合叫做細(xì)胞雜交。（種間雜交、種內(nèi)雜交）目的：獲得雜種優(yōu)勢(shì)第2頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)細(xì)胞融合的方法一、細(xì)胞融合的一般過程第3頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三細(xì)胞融合過程可分為：凝集：細(xì)胞凝集與細(xì)胞膜的糖蛋白有關(guān)蛋白質(zhì)分子重新分布：是細(xì)胞融合的必要前提脂質(zhì)分子重排：是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞融合的關(guān)鍵胞質(zhì)合并：后續(xù)的穩(wěn)定步驟。第4頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三二．融合方法

最早被采用病毒融合劑有皰疹病毒、天花病毒和副粘液病毒等在內(nèi)的病毒類融合劑。滅活仙臺(tái)病毒介導(dǎo)細(xì)胞融合過程可以大大提高融合頻率。它在病毒類融合劑中最為有效，使用最廣。1.病毒誘導(dǎo)融合：第5頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

滅活的病毒既保留了誘導(dǎo)細(xì)胞融合的能力，又不會(huì)感染細(xì)胞。滅活仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)融合的機(jī)理第6頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三使用仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合步驟先將親本細(xì)胞分別制成懸液、混合離心將沉積細(xì)胞懸于1ml滅活的仙臺(tái)病毒懸液，置冰浴間歇搖動(dòng)20分鐘，細(xì)胞凝集溫度升至37℃

，間歇搖動(dòng)30分鐘，使其進(jìn)行融合洗去病毒，即可將融合物懸浮于選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。第7頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2．化學(xué)誘導(dǎo)融合它們主要包括聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚乙烯醇、聚甘油、溶血卵磷酯、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰膽堿、甘油－醋酸酯、油酸、油胺和二價(jià)陽(yáng)離子載體等。其中則以PEG的使用最為廣泛。第8頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三PEG可能的促融合作用機(jī)理

1、PEG可能使細(xì)胞膜的脂類分子的物理結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，容易被PEG作用打開細(xì)胞膜，使細(xì)胞融合。

2、PEG可能會(huì)把細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子排開，使脂質(zhì)體扦入與膜結(jié)合。

3、PEG可能作用于膜磷脂極性基團(tuán)和細(xì)胞膜表面蛋白。使膜磷脂的表面電位下降，同時(shí)使膜糖蛋白的排阻體積減少，最終使膜出現(xiàn)缺口，進(jìn)而融合。第9頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合的效果：PEG分子量大小:1000－6000濃度:30－60％。PEG分子量和濃度越大，其融合率越高，但它的細(xì)胞毒性和粘度也隨之增大。一般認(rèn)為PEC濃度為30－50％時(shí)，以分子量1000的融合效果最佳。如果濃度增至50％和60％時(shí)則改變PEG400為好。PEG的處理時(shí)間。懸浮法，1－2分鐘離心法，5－8分鐘第10頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

若輔以5－15％的二甲亞砜或在融合前先用植物血凝素處理一下，則效果更好。

PEG誘導(dǎo)融合的優(yōu)點(diǎn)：PEG來源廣泛，操作簡(jiǎn)單，誘導(dǎo)率也相對(duì)于病毒誘導(dǎo)要高。使目前最常用的細(xì)胞融合誘導(dǎo)方法。第11頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三3．電融合法：電融合技術(shù)的原理：懸于大小不同的兩平行電極間的低導(dǎo)電率溶液中的細(xì)胞，在1－100MHz和100－1000V/cm的交流電場(chǎng)中，會(huì)向小電極移動(dòng)，并極化成偶極子，而沿電場(chǎng)方向排列成串，此時(shí)再加上適當(dāng)強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間的高壓電脈沖、即可使相鄰細(xì)胞膜的接觸區(qū)產(chǎn)生可逆電擊穿，從而觸發(fā)細(xì)胞融合。第12頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第13頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第14頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第15頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三電融合技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)①對(duì)細(xì)胞損傷小。②融合效率高。③融合方法快速，可重復(fù)性強(qiáng)。④融合細(xì)胞可在光鏡下直接觀察、跟蹤、鑒定，可控性好。第16頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三最大的不利之處是儀器的購(gòu)置。在融合大小不同的細(xì)胞時(shí)存在問題。在融合膜成分不同的細(xì)胞時(shí)存在困難。電融合技術(shù)的不利之處：第17頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三電融合技術(shù)的改進(jìn)方法1、物理法磁-電融合法聲-電融合法電-機(jī)融合法2、化學(xué)法利用化學(xué)試劑（刀豆蛋白A等）凝集細(xì)胞后電融合。3、特異性電融合法利用抗原抗體特異性結(jié)合凝集細(xì)胞電擊。第18頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三三、細(xì)胞融合的影響因素1.細(xì)胞種類和性質(zhì)（細(xì)胞種類、細(xì)胞的表面性質(zhì)、親本細(xì)胞的親緣關(guān)系）2.融合條件（溫度、pH值、氧氣）3.離子強(qiáng)度和種類（一般是Ca2+，50—100mmol/L）第19頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)融合子的檢出與鑒定一、融合子的篩選遺傳互補(bǔ)篩選法：HAT篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)選擇法抗性互補(bǔ)選擇法形態(tài)特征選擇法生長(zhǎng)特性選擇法第20頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三脾細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞)骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞脾細(xì)胞/脾細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞/骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞脾細(xì)胞篩選出不能長(zhǎng)期存活不能長(zhǎng)期存活第21頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三HAT培養(yǎng)基篩選H,次黃嘌呤;A,氨基喋呤;T,胸腺嘧啶DNA內(nèi)源性途徑(主要途徑)谷氨酰胺or單磷酸尿苷酸二氫葉酸還原酶AHT外源性途徑(旁路途徑)(Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase)

次嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶

(HGPRT

)胸腺嘧啶激酶

(TK)(Thymidinekinase)B淋巴細(xì)胞：HGPRT+，

TK+骨髓瘤細(xì)胞：HGPRT-，

TK-存活死亡外源性途徑(旁路途徑)第22頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三二、融合子的鑒定1.細(xì)胞學(xué)鑒定：染色體鑒定2.生化分析：同工酶譜分析3.分子生物學(xué)鑒定：DNA探針技術(shù)第23頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第四節(jié)雜交瘤技術(shù)一、基礎(chǔ)知識(shí)：抗體：免疫球蛋白抗原：可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并可與應(yīng)答產(chǎn)物結(jié)合的外來“異物”。免疫反應(yīng)：指機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)異己物質(zhì)的識(shí)別與清除等一系列復(fù)雜過程。抗體分子組成：2Fab+1Fc單抗：?jiǎn)慰寺】贵w是指由一個(gè)B細(xì)胞分化增殖的子代細(xì)胞(漿細(xì)胞)產(chǎn)生的針對(duì)單一抗原決定簇的抗體。（均一性、特異性）第24頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第25頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第26頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三二.B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)基本原理：正常的可產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞在融合劑的作用下產(chǎn)生融合，雜交的細(xì)胞在HAT選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到的為雜交瘤細(xì)胞，該細(xì)胞既具有可分泌抗體的功能又可在體外大量增殖的能力。第27頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三KohlerandMilstein

第28頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三脾細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞)骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)命不分泌抗體分泌抗體短命分泌抗體長(zhǎng)命K?hler和Milstein,19751984年Nobel醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)雜交瘤技術(shù)路線第29頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第30頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第31頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三B淋巴細(xì)胞本身是一種終末分化細(xì)胞，通常不再進(jìn)行細(xì)胞分裂，存活一段時(shí)間后便會(huì)死亡——短命細(xì)胞（一）、親本細(xì)胞概述脾臟與B淋巴細(xì)胞(Blymphocytes)：一般來講，脾臟有三大功能：1.它是“血庫(kù)”，當(dāng)人體休息安靜時(shí)，它貯存血液；當(dāng)處于運(yùn)動(dòng)、失血、缺氧等應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，它又將血液排送到血循環(huán)中，以增加血容量。2.脾臟猶如一臺(tái)“過濾器”，當(dāng)血液中出現(xiàn)病菌、抗原、異物、原蟲時(shí)，脾臟中的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞就會(huì)將其吃掉。3.脾臟還可以制造免疫球蛋白、補(bǔ)體等免疫物質(zhì)，發(fā)揮免疫作用。第32頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三B淋巴細(xì)胞發(fā)育過程：祖B淋巴細(xì)胞前B淋巴細(xì)胞成熟B淋巴細(xì)胞抗原刺激、遞呈細(xì)胞和Th細(xì)胞作用活化B淋巴細(xì)胞分化為漿細(xì)胞第33頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三骨髓瘤細(xì)胞(myelomacells):惡性增殖的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，只要營(yíng)養(yǎng)條件適合可永遠(yuǎn)分裂和存活——長(zhǎng)命細(xì)胞。①能在體外連續(xù)生長(zhǎng)，倍增期短于24小時(shí)；②缺乏HGPRT酶；③克隆效應(yīng)高；④在動(dòng)物中有致腫瘤性；⑤與小鼠淋巴細(xì)胞融合率相當(dāng)高；⑥本身不合成Ig，且不抑制雜交瘤細(xì)胞中的Ig合成基因。骨髓瘤細(xì)胞的選擇原則第34頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（二）、雜交瘤技術(shù)的操作流程1.動(dòng)物免疫：目的：在細(xì)胞融合后獲得盡可能多的分泌針對(duì)于該目標(biāo)抗原的特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞.特定目標(biāo)抗原動(dòng)物免疫脾臟中B淋巴細(xì)胞B淋巴細(xì)胞大量增殖刺激能分泌針對(duì)于該抗原的特異性抗體第35頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三免疫動(dòng)物的選擇選擇免疫動(dòng)物，即供脾動(dòng)物，通常選用小鼠。正常供體和骨髓瘤細(xì)胞種系發(fā)生越近緣，產(chǎn)生的雜交瘤就越穩(wěn)定(反之亦然)。因?yàn)樽鳛槿诤嫌玫拇蠖鄶?shù)小鼠骨髓瘤細(xì)胞是從BALB/C純系小白鼠取得，所以用BALB/C作脾細(xì)胞供體最為合適。第36頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三常規(guī)免疫法脾內(nèi)一次性免疫法短程免疫法體外免疫法常用免疫方法：“穩(wěn)妥；優(yōu)勢(shì)克隆”皮下注射腹腔注射靜脈注射免疫途徑：“省時(shí)；省抗原”“省時(shí)”“操作繁瑣”第37頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三免疫方案

a.顆粒性抗原免疫性較強(qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。下面以細(xì)胞性抗原為例的免疫方案:初次免疫1×10７／0.5mlip(腹腔內(nèi)注射)↓2～3周后第二次免疫1×10７／0.5mlip↓3周后加強(qiáng)免疫(融合前三天)

1×10７／0.5mlip或iv(靜脈內(nèi)注射)↓取脾融合第38頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

b.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐劑;

初次免疫Ag

1～50μg加福氏完全佐劑皮下多點(diǎn)注射│(一般0.8～1ml

0.2ml／點(diǎn))↓3周后第二次免疫劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip│(ip劑量不宜超過0.5ml)↓3周后第三次免疫劑量同上，不加佐劑，ip│(5～7天后采血測(cè)其效價(jià)，檢測(cè)免疫效果)↓2～3周后加強(qiáng)免疫，劑量50～500μg為宜，ip或iv↓3天后取脾融合第39頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（2）、細(xì)胞融合及HAT篩選1、細(xì)胞融合方法：1)脾細(xì)胞懸液的制備：最后一次加強(qiáng)免疫后第3天制備（機(jī)械分離法），培養(yǎng)基RPMI1640。

2)骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備：于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期挑選形態(tài)較好的細(xì)胞，臺(tái)盼蘭染色后計(jì)數(shù)，挑選80％以上存活率的細(xì)胞離心后重新懸浮。2)50%PEG配制：稱取2gPEG（1000或4000）于青霉素瓶加塞，8磅（0.06MPa）15min，待冷至50℃加等量預(yù)熱的不含血清的培養(yǎng)基。第40頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三1）108小鼠脾細(xì)胞與107骨髓瘤細(xì)胞混合，離心（1000rpm，10min），棄上清。2）輕扣管底，混勻細(xì)胞，37℃水浴3）60s內(nèi)滴加0.6ml50％PEG，邊滴邊搖動(dòng)試管，30s內(nèi)將細(xì)胞懸液吸入吸管靜置30s，再在30s內(nèi)緩慢轉(zhuǎn)入離心管；5min內(nèi)后加入10mlDMEM終止PEG作用。3）離心，棄上清，加15mLHAT培養(yǎng)基，混勻，轉(zhuǎn)入96孔板（預(yù)先有HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)的飼養(yǎng)細(xì)胞），每孔100ul。4）37℃孵箱孵育，2-3天換HAT一次，持續(xù)2周3)細(xì)胞融合：第41頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三細(xì)胞融合注意事項(xiàng)：1、細(xì)胞比例：脾細(xì)胞/瘤細(xì)胞約5-10/1。2、反應(yīng)時(shí)間：慢、轉(zhuǎn)、柔。3、反應(yīng)溫度：37℃，所有用液均需提前預(yù)熱。4、PEG選擇：分子量、濃度（30—50%間）。5、不要使用含有血清的培養(yǎng)基（PEG能引起蛋白質(zhì)沉淀）。第42頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2、HAT培養(yǎng)基的篩選融合后細(xì)胞混合液HAT培養(yǎng)基2weekslaterHT培養(yǎng)基正常培養(yǎng)基1weeklater第43頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三HAT培養(yǎng)基篩選H,次黃嘌呤;A,氨基喋呤;T,胸腺嘧啶DNA內(nèi)源性途徑(主要途徑)谷氨酰胺or單磷酸尿苷酸二氫葉酸還原酶AHT外源性途徑(旁路途徑)(Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase)

次嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶

(HGPRT

)胸腺嘧啶激酶

(TK)(Thymidinekinase)B淋巴細(xì)胞：HGPRT+，

TK+骨髓瘤細(xì)胞：HGPRT-，

TK-存活死亡外源性途徑(旁路途徑)第44頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（3）、雜交瘤細(xì)胞的篩選（抗體的檢測(cè)）一般在雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1／10面積時(shí)，即可開始檢測(cè)特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。檢測(cè)抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡(jiǎn)便、特異、敏感的方法為原則?？煽康暮Y選方法必須在融合前建立，避免由于方法不當(dāng)貽誤整個(gè)篩選時(shí)機(jī)。第45頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)抗原第1抗體酶第2抗體待檢雜交瘤培養(yǎng)上清液底物有色產(chǎn)物酶標(biāo)儀檢測(cè)技術(shù)原理：第46頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（4）、雜交瘤細(xì)胞的克隆培養(yǎng)克隆化一般是指將抗體陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化。經(jīng)過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個(gè)孔內(nèi)只有一個(gè)克隆。在實(shí)際工作中，可能會(huì)有數(shù)個(gè)甚至更多的克隆?？寺』脑瓌t是，對(duì)于檢測(cè)抗體陽(yáng)性的雜交克隆應(yīng)盡早進(jìn)行克隆化，否則抗體分泌的細(xì)胞會(huì)被抗體非分泌的細(xì)胞所抑制，因?yàn)榭贵w非分泌細(xì)胞的生長(zhǎng)速度比抗體分泌的細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，二者競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果會(huì)使抗體分泌的細(xì)胞丟失。第47頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三雜交瘤細(xì)胞的克隆培養(yǎng)常用克隆化方法：有限稀釋法軟瓊脂平板法80個(gè)細(xì)胞/96孔飼養(yǎng)細(xì)胞(feedercells)ELISA法檢測(cè)單克隆雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清，選出分泌特異性抗體的陽(yáng)性孔，所分泌抗體即為單克隆抗體。第48頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三1）、有限稀釋法有限稀釋法原理是從理論上將細(xì)胞稀釋到10個(gè)/ml，然后裝成每小孔(96孔板)0.1ml，使每孔理論上含有單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)過培養(yǎng)后即可獲得單個(gè)細(xì)胞形成集落。有時(shí)為了加快克隆細(xì)胞生長(zhǎng)速度，常采用腹腔巨噬細(xì)胞做飼養(yǎng)層細(xì)胞。第49頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三1.取1.0ml5×104ml細(xì)胞+4ml培養(yǎng)基稀釋，得1×104/ml.2.取0.5ml1×104ml細(xì)胞液+9.5ml培養(yǎng)基稀釋，得1×103/ml.3.取1.0ml1×103ml細(xì)胞液+9.0ml培養(yǎng)基稀釋，得1×102/ml.有限稀釋法舉例：

第50頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2）軟瓊脂培養(yǎng)法：本法對(duì)于某些抗原，可以把克隆化培養(yǎng)與特異性篩選測(cè)定結(jié)合起來進(jìn)行，所以它的特點(diǎn)是效率較高，速度較快。但缺點(diǎn)是克隆率不高。第51頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三利用單個(gè)細(xì)胞在軟瓊脂培養(yǎng)基上的局限化生長(zhǎng)，待細(xì)胞集落長(zhǎng)到肉眼可見后，用巴氏吸管從瓊脂上挑出來(一般8—10天后)，再移到液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，并檢測(cè)培養(yǎng)上清液的活性?；驹淼?2頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三飼養(yǎng)細(xì)胞

在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)過程中，需要加入飼養(yǎng)細(xì)胞。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(較為常用)、小鼠脾臟細(xì)胞或小鼠胸腺細(xì)胞。

第53頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三飼養(yǎng)層細(xì)胞的作用提高培養(yǎng)細(xì)胞的密度，使待克隆細(xì)胞容易生存與繁殖。腹腔細(xì)胞能清除培養(yǎng)中的死亡細(xì)胞，從而促進(jìn)單個(gè)細(xì)胞克隆的生長(zhǎng)。飼養(yǎng)細(xì)胞能釋放諸如細(xì)胞生長(zhǎng)因子類物質(zhì)，起到促進(jìn)細(xì)胞分裂、增殖的作用。第54頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三目的：保種。方法：離心收集雜交瘤細(xì)胞懸液，用含10％DMSO和10％FBS的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度，若短期保存，可置-80度冰盒中；若長(zhǎng)期保存，則從冰盒轉(zhuǎn)入液氮中。復(fù)蘇：如果凍存的細(xì)胞是來自96孔板的一孔，復(fù)蘇后也應(yīng)接種到96孔板的一個(gè)孔中（5）雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇第55頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從上清中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液含量為10～60μg／ml，如果大量生產(chǎn)，費(fèi)用較高。體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，制備腹水。（6）單克隆抗體的大量生產(chǎn)第56頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三腹水的制備

常規(guī)是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液體石臘于BaLb／c鼠，1～2周后腹腔注射1×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7～10天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動(dòng)物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達(dá)5-20mg/ml，這是目前最常用的方法，還可將腹水中細(xì)胞凍存起來，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水快、量多。第57頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期三回顧：1）免疫脾細(xì)胞的制備2）骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與篩選3）細(xì)胞融合（關(guān)鍵）4）HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞5）陽(yáng)性克隆的篩選（盡早、反復(fù)原則）6）克隆化