HPLC在藥代動(dòng)力學(xué)中的應(yīng)用

藥代(Dai)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)材料及準(zhǔn)備LC-MS/MS分析結(jié)果分析—By:@花生PPTer—主要內(nèi)容第一頁(yè)，共三十四頁(yè)?！狟y:@花(Hua)生PPTer—

藥物代謝動(dòng)力學(xué)（Pharmacokinetic，PK）是定量研究藥物在生物體內(nèi)吸收Absorption、分布Distribution、代謝Mechanism和排泄Excretion規(guī)律，并運(yùn)用數(shù)學(xué)原理和方法闡述血藥濃度隨時(shí)間變化的規(guī)律的一門學(xué)科。機(jī)體對(duì)藥物的作用第二頁(yè)，共三十四頁(yè)?！狟y:@花(Hua)生PPTer—藥代動(dòng)力學(xué)的目的不同劑型對(duì)藥物吸收的影響不同人種（或人群）對(duì)藥物代謝的影響不同人群對(duì)藥物排泄的影響指導(dǎo)藥物開發(fā)指導(dǎo)后期臨床試驗(yàn)指導(dǎo)臨床合理用藥第三頁(yè)，共三十四頁(yè)?！狟y:@花(Hua)生PPTer—吸收吸收（absorption）：藥物自給藥部位進(jìn)入血液循環(huán)的過程。消化道吸收（口腔，胃腸道吸收）消化道外吸收（注射，呼吸道，皮膚粘膜吸收）順序：靜脈、吸入、腹腔注射、舌下含化、肌肉注射、皮下注射、口服、直腸給藥、外敷。第四頁(yè)，共三十四頁(yè)?！狟y:@花(Hua)生PPTer—

吸收入血的藥物隨血流轉(zhuǎn)運(yùn)到各組織器官的過程。分布第五頁(yè)，共三十四頁(yè)?！狟y:@花(Hua)生PPTer—藥物在體內(nèi)發(fā)生化學(xué)結(jié)構(gòu)改變的過程意義：1、利于藥物排泄2、改變藥理活性：代謝/生物轉(zhuǎn)化第六頁(yè)，共三十四頁(yè)?！狟y:@花(Hua)生PPTer—藥物及代謝物從排泄或分泌器官排出體外的過程。腎臟（主要）腸肺皮膚唾液乳汁等排泄第七頁(yè)，共三十四頁(yè)?！狟y:@花(Hua)生PPTer—時(shí)量曲線反應(yīng)藥物經(jīng)歷轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)化，血藥濃度（量）隨著時(shí)間（時(shí)）的推移而發(fā)生變化的動(dòng)態(tài)規(guī)律。描述這一規(guī)律的曲線第八頁(yè)，共三十四頁(yè)?！狟y:@花(Hua)生PPTer—儀器分析在中藥藥理研究中的作用在傳統(tǒng)中藥藥代學(xué)的研究中，76%的報(bào)道中使用了HPLC/MS/MS技術(shù)，24%使用了HPLC/ESI-MS技術(shù)。靈敏，快速，選擇性高，效率高中藥的有效成分中藥材不同藥材中同一成分第九頁(yè)，共三十四頁(yè)。藥代(Dai)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)材料及準(zhǔn)備LC-MS/MS分析結(jié)果分析—By:@花生PPTer—主要內(nèi)容第十頁(yè)，共三十四頁(yè)?！狟y:@花(Hua)生PPTer—液相色譜法串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定黃芩素，黃芩甙，木蝴蝶素A和漢黃芩素在大鼠血漿中的含量實(shí)驗(yàn)題目第十一頁(yè)，共三十四頁(yè)。—By:@花(Hua)生PPTer—

本次實(shí)驗(yàn)，是利用液相色譜法串聯(lián)質(zhì)譜法，快速，準(zhǔn)確地測(cè)出大鼠血漿中的黃芩素，黃芩甙，木蝴蝶素A和漢黃芩素含量，以解釋其藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。第十二頁(yè)，共三十四頁(yè)?！狟y:@花(Hua)生PPTer—實(shí)驗(yàn)背景

是一種多年生草本植物栽培黃芩inKorea。這種植物的根在傳統(tǒng)的東方醫(yī)學(xué)治療各種疾病,包括發(fā)燒,潰瘍、炎癥和癌癥。含有黃芩各種各樣的黃酮,phenylethanoids、氨基酸、植物固醇和精油。黃芩苷,黃芩甙元oroxyiln和漢黃芩素(圖1)是黃芩的主要有效成分這些類黃酮具有抗過敏[2]、抗氧化劑(3、4),抗艾滋病毒(5、6),抗炎[7],抗腫瘤(8-10),抗焦慮藥[11],[12]和antigenotoxicanti-hepatitisB病毒活動(dòng)[13]。第十三頁(yè)，共三十四頁(yè)?！狟y:@花(Hua)生PPTer—實(shí)驗(yàn)背景黃芩是一種多年生草本植物，它的根在傳統(tǒng)的東方醫(yī)學(xué)中被用于治療各種疾病，包括發(fā)熱，潰瘍，炎癥和癌癥。它含有各類黃酮，氨基酸，植物固醇和精油，其中的主要活性成分是黃芩苷，黃芩甙，木蝴蝶素A和漢黃芩素，它們具有抗氧化，抗過敏，抗病毒，抗焦慮等有顯著的作用。第十四頁(yè)，共三十四頁(yè)?！狟y:@花(Hua)生PPTer—材料和試劑黃芩甙元、漢黃芩素和木蝴蝶素的分離我們之前的方法[13],以及他們的純度是99.0%。黃芩苷是從西格瑪化工有限公司(圣。路易斯,密蘇里州,美國(guó))。2-(3、4-Dimethoxy-phenyl)5、7-dihydroxychromen-4號(hào)(DPDC,純度為99.0%,內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn))是由東亞藥業(yè)有限公司(龍仁市、韓國(guó))。甲醇和乙酸乙酯(高效液相色譜級(jí))獲得Burdick&杰克遜Inc.(美國(guó)MI馬斯基根)和其他化學(xué)物質(zhì)是最高質(zhì)量的第十五頁(yè)，共三十四頁(yè)?！狟y:@花(Hua)生PPTer—制備校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量控制樣品分別將baicalein,baicalin,oroxylinA,wogonin的原溶液和DPDC加入DMSO中，DPDC的添加量為1mg/1ml。將原溶液用乙腈稀釋，得到工作溶液.DPDC溶液（0.1微克/毫升）由儲(chǔ)備的等量溶液經(jīng)乙腈稀釋得到。

所有的已配置好的溶液都在聚丙烯小試管中避光置于4℃下一周。第十六頁(yè)，共三十四頁(yè)?！狟y:@花(Hua)生PPTer—通過將將工作溶液按比例配置，得到含量分別為5,10,20,50,100,200and500ng/ml的baicalein,oroxylinA,wogonin大鼠血漿標(biāo)準(zhǔn)液和含量分別為5,10,20,50,100,200,500,1000,2000and5000ng/ml的baicalin大鼠血漿標(biāo)準(zhǔn)液。通過分別將25微升0.24,2.40,8.00微克/ml工作溶液添加到475微升大鼠血漿中，得到12.0,120和400ng/ml的QC溶液最后將各配置溶液以50微升，分別置于聚丙烯小試管中，并保存于-20℃直到分析開始。制備校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量控制樣品第十七頁(yè)，共三十四頁(yè)?！狟y:@花(Hua)生PPTer—樣品制備

50個(gè)單位的大鼠血漿和QC樣品標(biāo)準(zhǔn)混合10l10%抗壞血酸是一種抗氧化劑(31日),0.05的350lmhydrochloric酸、5lDPDC乙腈解決方案和1000l在1.5ml-polypropylene乙酸乙酯管的混合物在13000×gcentrifuged5分鐘。有機(jī)層是pipette-transferred和蒸發(fā)使用真空干燥集中器。殘留的溶解在40lsonicating3分鐘,50%的甲醇centrifuged。aliquots(10l)注入質(zhì)/女士系統(tǒng)。第十八頁(yè)，共三十四頁(yè)?！狟y:@花(Hua)生PPTer—樣品制備取50毫升大鼠血漿標(biāo)準(zhǔn)液，并混合以QC和10微升10%抗壞血酸作為抗氧化劑。再加入350微升0.05M鹽酸，5微升DPDC于乙腈溶液中，并加入1000微升乙酸乙酯于1.5ml的聚丙烯小管中?；旌衔镫x心（13000xg）5分鐘。分離有機(jī)層并干燥。溶解殘?jiān)?0微升50%甲醇并靜置3分鐘，再度離心。取上清液10微升加入LC-MS/ms系統(tǒng)。第十九頁(yè)，共三十四頁(yè)。藥代(Dai)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)材料及準(zhǔn)備LC-MS/MS分析結(jié)果分析—By:@花生PPTer—主要內(nèi)容第二十頁(yè)，共三十四頁(yè)?！狟y:@花(Hua)生PPTer—簡(jiǎn)介色譜質(zhì)譜的在線聯(lián)用將色譜的分離能力與質(zhì)譜的定性定量功能結(jié)合起來(lái)，實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜混合物更準(zhǔn)確的定量和定性分析。而且也簡(jiǎn)化了樣品的前處理過程，使樣品分析更簡(jiǎn)便。第二十一頁(yè)，共三十四頁(yè)。安(An)捷倫液相色譜/離子阱質(zhì)譜系統(tǒng)在線真空脫氣機(jī)二元或四元梯度液相泵

自動(dòng)進(jìn)樣器

柱溫箱二極管陣列檢測(cè)器第二十二頁(yè)，共三十四頁(yè)?！狟y:@花(Hua)生PPTer—（分離、定量和定性）

黃芩苷，千層紙素A和漢黃芩素，大鼠血漿中黃芩活性成分的測(cè)定。經(jīng)過液液萃取與2-（3,4-二甲氧基-苯基）-5,7-二羥基-色烯-4-酮作為內(nèi)標(biāo)物，黃芩素，黃芩，千層紙素A和漢黃芩素是從一個(gè)洗脫色譜柱C18于7分鐘，由甲醇和0.1％甲酸的等度流動(dòng)相柱（60:40，V/V）。被檢測(cè)的分析物使用電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式。第二十三頁(yè)，共三十四頁(yè)。—By:@花(Hua)生PPTer—

LC-MS/MS分析

色譜系統(tǒng)由NANOSPACE的

SI-2泵（高壓輸液泵），SI-2自動(dòng)進(jìn)樣器和一個(gè)S-MC系統(tǒng)控制器，固定相C18柱（5微米，2.1mm內(nèi)徑×100mm），流動(dòng)相使用甲醇的混合物中，

并0.1％甲酸（60:40，V/V），流速0.2毫升/分鐘，色譜柱和自動(dòng)進(jìn)樣器托盤溫度分別為50?C和4?C，時(shí)間為7.0分鐘，洗脫液被直接引入串聯(lián)的正電離電噴霧源四極桿質(zhì)譜儀。第二十四頁(yè)，共三十四頁(yè)。ESI是近年來(lái)出現(xiàn)的一種新的電(Dian)離方式。它主要應(yīng)用于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。它既作為液相色譜和質(zhì)譜儀之間的接口裝置，同時(shí)又是電(Dian)離裝置。它的主要部件是一個(gè)多層套管組成的電(Dian)噴霧噴嘴。最內(nèi)層是液相色譜流出物，外層是噴射氣，噴射氣常采用大流量的氮?dú)?，其作用是使噴出的液體容易分散成微滴。另外，在噴嘴的斜前方還有一個(gè)補(bǔ)助氣噴嘴，補(bǔ)助氣的作用是使微滴的溶劑快速蒸發(fā)。在微滴蒸發(fā)過程中表面電(Dian)荷密度逐漸增大，當(dāng)增大到某個(gè)臨界值時(shí)，離子就可以從表面蒸發(fā)出來(lái)。離子產(chǎn)生后，借助于噴嘴與錐孔之間的電(Dian)壓，穿過取樣孔進(jìn)入分析器。加到噴嘴上的電壓可以是正，也可以是負(fù)。通過調(diào)節(jié)極性，可以得到正或負(fù)離子的質(zhì)譜。產(chǎn)物離子被轉(zhuǎn)換為采用量化。第二十五頁(yè)，共三十四頁(yè)。—By:@花(Hua)生PPTer—

錐電壓分別為35V的黃芩素，33V的千層紙素A和漢黃芩素28V的黃芩苷和55V的DPDC。（？）Multiplereaction-監(jiān)測(cè)（MRM）模式下使用的特定前體/產(chǎn)物離子被轉(zhuǎn)換為采用量化。第二十六頁(yè)，共三十四頁(yè)。藥(Yao)代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)材料及準(zhǔn)備LC-MS/MS分析結(jié)果分析—By:@花生PPTer—主要內(nèi)容第二十七頁(yè)，共三十四頁(yè)。baicalein,oroxylinA,wogoninandDPDC（三種待測(cè)物與內(nèi)參物）的電噴霧電離產(chǎn)生豐富(Fu)的質(zhì)子化分子離子（[MH]+）為質(zhì)荷比（m/z）：271.2，285.3，285.3和315.0，

這些碎片離子被生產(chǎn)作為突出的產(chǎn)品離子分別是：黃芩素M/Z123（三羥基苯基部分），M/Z271（黃芩[MH]+離子損失葡萄糖醛酸部分），M/Z270漢黃芩素（[MH]+離子損失甲基），對(duì)于M/Z270（[MH]+離子損失甲基基團(tuán)）千層紙素A和M/Z299（[MH]+離子損失甲基基團(tuán)）為DPDC。第二十八頁(yè)，共三十四頁(yè)?！狟y:@花(Hua)生PPTer—用該色譜法分離黃芩素，黃芩苷，千層紙素A和漢黃芩素的保留時(shí)間是約4.36，2.59，5.17和6.17分鐘，良好的分辨這四個(gè)類黃酮。第二十九頁(yè)，共三十四頁(yè)。

校準(zhǔn)曲(Qu)線是通過濃縮，得到黃芩素，千層紙素A和漢黃芩素范圍和黃芩苷濃度為5.0-5000納克/毫升的大鼠血漿。對(duì)于低CV值（CV=方差/均值）黃芩素（3.6％），黃芩（5.7％）的斜坡上，千層紙素A（2.6％）和漢黃芩素（3.0％）所表示的方法的可重復(fù)性（表1）。第三十頁(yè)，共三十四頁(yè)。服務(wù)(Wu)管理Servicemanagement—By:@花生PPTer—

批內(nèi)和批間CV值分別為：黃芩素0.8-6.1％，千層紙素為一1.7-5.2％，漢黃芩素1.4-5.9％，黃芩苷1.6-4.1％。日內(nèi)和批間的RE值為-4.0至4.2％的黃芩素（baicalein），-1.3至1.7％千層紙素A（oroxylinA）和-3.8-5.8％漢黃芩素（wogonin），-1.7-1.7％黃芩苷（baicalin）。這些結(jié)果表明本方法具有可接受的準(zhǔn)確性和精確度。(如Table2)第三十一頁(yè)，共三十四頁(yè)。服(Fu)務(wù)管理Servicemanagement—By:@花生PPTer—

提取回收黃芩素，黃芩苷，千層紙素A和漢黃芩素的加標(biāo)大鼠血漿測(cè)定采用一步法液-液萃取，用乙酸乙酯在酸性pH濃度為15.0，75.0和在400納克/毫升重復(fù)六次。回收率分別為黃芩素82.8-87.1％，黃芩苷和71.1-76.9％，千層紙素為一81.5-83.2％漢黃芩素為81.4-84.7