串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)新生兒遺傳代謝病篩查

串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)

新生兒遺傳代謝病篩查

上海市兒童醫(yī)院田國(guó)力2020/11/31遺傳代謝病遺傳性代謝?。↖nbornErrorsofMetabolism,IEM）是由于基因改變導(dǎo)致某些酶或蛋白質(zhì)功能發(fā)生質(zhì)/量的改變，引起某些代謝途徑上的生化物質(zhì)發(fā)生改變引起一系列疾病。大多數(shù)為單基因遺傳病遺傳方式以常染色體隱性遺傳或X連鎖隱性遺傳為主2020/11/32遺傳代謝病發(fā)病機(jī)制異常代謝途徑代謝物（A1）↑代謝物(C1)↓代謝物

(B1)↓代謝物（A2）↑代謝物(C2)↓代謝物

(B2)↓代謝物(A)↑↑代謝物(B)↓↓

輔酶（C）正常代謝途徑酶2020/11/33疾病特點(diǎn)目前已發(fā)現(xiàn)500余種疾病主要類型有氨基酸代謝障礙、有機(jī)酸血癥、脂肪酸代謝障礙、核酸代謝異常癥、金屬代謝障礙、線粒體病80%屬常染色體隱性遺傳單病發(fā)生率低，群體患病率高單基因缺陷所致代謝通路阻,大多為單基因遺傳病，少數(shù)為線粒體基因遺傳病表現(xiàn)非特異性，有賴遺傳學(xué)或生化方法確診，代謝物、酶學(xué)和分子檢測(cè)常規(guī)試驗(yàn)檢測(cè)：缺乏特異標(biāo)志物兒科、血液科、神經(jīng)科、骨科等不同診室就診早期癥狀多無特異性，累及部位和病情輕重差異很大，極易造成誤診新生兒期、幼兒或兒童期發(fā)病,某些可至成人期開始發(fā)病。2020/11/34臨床特征多在新生兒期、幼兒或兒童期發(fā)病。某些可至成人期開始發(fā)病。新生兒期發(fā)?。簢I吐、喂奶困難、反應(yīng)力低下、呼吸暫停、急促等兒童期發(fā)?。嚎杀憩F(xiàn)為全身多器官受累以神經(jīng)肌肉系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等癥狀為主乏力、智力發(fā)育遲緩、肌張力增高或降低、癲癇、黃疸、肝脾腫大、呼吸困難代謝性酸中毒、容貌異常、毛發(fā)皮膚色素改變、特殊體味飲食、應(yīng)激反應(yīng)、體能消耗等為疾病急性發(fā)作誘因。2020/11/35遺傳代謝病診斷困難臨床癥狀和體征：缺乏特異性常規(guī)檢測(cè)：缺乏特異標(biāo)志物特殊試驗(yàn)檢測(cè)氨基酸分析：氨基酸自動(dòng)分析儀，高效液相色譜?；鈮A分析串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)氣相質(zhì)譜技術(shù)酶學(xué)分析基因診斷組織活檢、成纖維細(xì)胞組織培養(yǎng)、腦脊液培養(yǎng)、其他神經(jīng)病學(xué)檢查2020/11/36PKU歷史體內(nèi)高Phe引起患兒智力低下1930提出低苯丙氨酸飲食治療1950應(yīng)用飲食治療僅對(duì)PKU同胞有益大多患兒出現(xiàn)不可逆癥狀后才確診1963年美國(guó)新生兒PKU篩查Pediatrics,105:89,2000.2020/11/37重視遺傳代謝病篩查與診斷疾病譜的改變感染性疾病、重度營(yíng)養(yǎng)不良、腫瘤、先天畸形、遺傳代謝性疾病診斷技術(shù)的進(jìn)步生化檢測(cè)、基因芯片、全基因組測(cè)序等治療方法的提高替代治療、系譜分析、遺傳咨詢、器官移植、基因治療國(guó)內(nèi)外對(duì)出生缺陷的重視2020/11/38新生兒遺傳代謝病篩查對(duì)新生兒遺傳代謝缺陷、先天性內(nèi)分泌異常以及某些嚴(yán)重的遺傳性疾病進(jìn)行篩查的總稱患病新生兒在臨床癥狀出現(xiàn)前能給予治療，防止或減輕體格和智力發(fā)育障礙，避免癡呆或死亡的發(fā)生是當(dāng)今國(guó)際上早期發(fā)現(xiàn)遺傳代謝病患兒的有效措施2020/11/39是集篩查、早期診斷、及時(shí)治療、預(yù)防再發(fā)等措施為一體減少出生缺陷，提高人口素質(zhì)是當(dāng)今國(guó)際上早期發(fā)現(xiàn)遺傳代謝病患兒的有效措施預(yù)防效果顯著，成本效益最好

新生兒遺傳代謝病篩查2020/11/310新生兒遺傳代謝病篩查技術(shù)細(xì)菌抑制法:BIA熒光法：FIA,EFIA免疫法：ELISA,DELFIA串聯(lián)質(zhì)譜儀：一次檢測(cè)，多種疾病。檢測(cè)氨基酸代謝異常，脂肪酸代謝異常和有機(jī)酸代謝異常。Microarrayplatform：分子基因的研究，將DNA點(diǎn)在玻璃芯片上，然后與熒光標(biāo)記的診斷探針反應(yīng)，檢測(cè)響應(yīng)熒光信號(hào)數(shù)字微流體(DigitalMicrofluidics):用于溶酶體貯積病的篩查2020/11/311串聯(lián)質(zhì)譜篩查的優(yōu)勢(shì)一種疾病——一種測(cè)試多種疾病——多種測(cè)試新生兒篩查方案的擴(kuò)展將非常昂貴一份血樣同時(shí)檢測(cè)超過30多種物質(zhì)，近40種代謝疾病。高靈敏性、高選擇性快速檢測(cè)，達(dá)到早診斷、早治療的效果降低了篩查診斷的假陽性和假陰性VS.

傳統(tǒng)篩查

串聯(lián)質(zhì)譜MS/MS是一種在同一樣本中同時(shí)測(cè)量多種待測(cè)物的方法在同個(gè)測(cè)試平臺(tái)上檢測(cè)多個(gè)疾病就變得可能2020/11/312質(zhì)譜儀組成MS儀主要由離子源、真空接口、質(zhì)量分析器、檢測(cè)器等四部分組成樣品中被測(cè)物質(zhì)在離子源內(nèi)電離形成各種質(zhì)荷比不同帶電離子（離子化），經(jīng)真空接口進(jìn)入由電場(chǎng)或磁場(chǎng)形成的質(zhì)量分析器，利用電磁學(xué)原理，根據(jù)m/z不同將帶電離子分開，最后到達(dá)檢測(cè)器被檢測(cè)，得到樣品的質(zhì)譜圖及離子強(qiáng)度2020/11/313質(zhì)譜的基本原理將分析物離子化為各種質(zhì)荷比(m/z)不同的帶電粒子應(yīng)用電磁學(xué)原理,帶電粒子按m/z在空間或時(shí)間上產(chǎn)生分離排列成的圖譜根據(jù)它們所形成的譜圖、離子峰強(qiáng)度對(duì)分析物進(jìn)行鑒定若同時(shí)加入被檢測(cè)物質(zhì)對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)或外標(biāo)，既可以進(jìn)行定量檢測(cè)。2020/11/314MS/MS的基本原理兩個(gè)MS經(jīng)碰撞室(CID)串聯(lián)而成最常應(yīng)用于NBS的是三重四極桿，由兩個(gè)MS經(jīng)碰撞室(CID)串聯(lián)而成一級(jí)MS是功能類似于氣相和液相色譜的分離器，只允許選擇的離子(母離子)通過母離子進(jìn)人CID產(chǎn)生碎片(子離子)子離子經(jīng)二級(jí)MS選擇最終進(jìn)入檢測(cè)器通過不同掃描的方式記錄即可得到串聯(lián)質(zhì)譜圖譜，實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物的定性通過樣品中加入定量同位素內(nèi)標(biāo)，實(shí)現(xiàn)待測(cè)物定量檢測(cè)2020/11/315串聯(lián)質(zhì)譜儀一級(jí)質(zhì)譜碰撞室二級(jí)質(zhì)譜掃描特定范圍離子或允許特定離子進(jìn)入碰撞器分離器分子離子碰撞解離形成子離子掃描一定范圍子離子選擇特定子離子進(jìn)入檢測(cè)器分析儀2020/11/316串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)設(shè)備串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀進(jìn)樣器高效液相泵儀器控制及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)2020/11/317串聯(lián)質(zhì)譜新生兒篩查的基本原理遺傳代謝?。河捎谶z傳因素體內(nèi)正常代謝途徑受阻氨基酸代謝病患者血中氨基酸水平異常有機(jī)酸血癥及脂肪酸代謝障礙病患者血中游離肉堿或不同種類的?；鈮A水平異常利用串聯(lián)質(zhì)譜儀通過檢測(cè)檢測(cè)濾紙干血片中氨基酸、游離肉堿及?；鈮A的水平通過一系列規(guī)則來評(píng)估結(jié)果將化合物濃度和代謝疾病關(guān)聯(lián)起來，綜合判斷多種遺傳代謝病一個(gè)測(cè)試平臺(tái)上同時(shí)檢測(cè)多個(gè)疾病2020/11/318串聯(lián)質(zhì)譜新生兒篩查的步驟采血后滴于專用采血濾紙片，晾干，制成濾紙干血片采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，通過同位素內(nèi)標(biāo)法(IS)分析物和對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)比等比于分析物和對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)的濃度比一次性定量檢測(cè)新生兒的濾紙干血片樣品中的數(shù)十種氨基酸、酰基肉堿濃度通過一系列規(guī)則來評(píng)估結(jié)果將化合物濃度和代謝疾病關(guān)聯(lián)起來，綜合判斷30余種遺傳代謝病2020/11/319衍生化氨基酸掃描質(zhì)譜圖氨基酸m/z同位素m/zAla146.0Ala-d4150.3Leu188.1Leu-d3191.2Phe222.2Phe-d5227.2Tyr238.2Tyr-13C6246.22020/11/320串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)指標(biāo)名稱縮寫丙氨酸AlanineAla精氨酸ArginineArg瓜氨酸CitrullineCit鳥氨酸OrnithineOrn苯丙氨酸PhenylalaninePhe酪氨酸TyrosineTyr甘氨酸GlycineGly亮氨酸LeucineLeu甲硫氨酸MethionineMet纈氨酸ValineVal脯氨酸ProlinePro2020/11/321串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)指標(biāo)名稱縮寫名稱縮寫名稱縮寫游離肉堿CC0己酰肉堿C6肉豆蔻二烯酰肉堿C14:2乙酰肉堿C2己二酰肉堿C6DC3-羥基肉豆蔻酰肉堿C14-OH丙酰肉堿C3辛酰肉堿C8棕櫚酰肉堿C16丙二酰肉堿C3DC辛烯酰肉堿C8:1棕櫚烯酰肉堿C16:1丁酰肉堿C4辛二烯酰肉堿C8:23-羥基棕櫚烯酰肉堿C16:1-OH3-羥基丁酰肉堿C4-OH葵酰肉堿C103-羥基棕櫚酰肉堿C16-OH異戊酰肉堿C5葵烯酰肉堿C10:1十八碳酰肉堿C18異戊烯酰肉堿C5:1葵二烯酰肉堿C10:2十八碳烯酰肉堿C18:13-羥基異戊酰肉堿C5-OH月桂酰肉堿C123-羥基十八碳烯酰肉堿C18:1-OH戊二酰肉堿C5DC肉豆蔻酰肉堿C143-羥基十八碳酰肉堿C18-OH肉豆蔻烯酰肉堿C14:12020/11/322高苯丙氨酸血癥2020/11/323中鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥2020/11/324游離肉堿及酰基肉堿有機(jī)酸血癥相關(guān)：C0、C2、C3、3DC、C4、C4-OH、C5、C5-OH、C5DC、C5:1脂肪酸代謝病有關(guān)：C0、C4、C5DC、C6、C8、C10、C12、C14、C14:1、C16、C16-OH、C18、C18-OH2020/11/325標(biāo)本前處理方式2020/11/326衍生化標(biāo)本前處理方法樣品處理過程中加入鹽酸正丁醇，引入丁基改變分子結(jié)構(gòu)（除去羧酸功能團(tuán)），消除潛在負(fù)離子，提高正離子模式下的離子化效率酯化作用可以減少潛在的溶劑或其他干擾物質(zhì)降低分析物極性—更好的去溶劑化，樣品更加容易進(jìn)入儀器真空環(huán)境酯化作用可以引入測(cè)量酰基肉堿和氨基酸方式（游離酸形式）無法檢測(cè)到的干擾物2020/11/327非衍生化標(biāo)本前處理方法無需使用鹽酸正丁醇，使用甲醇萃取后可直接進(jìn)樣整個(gè)樣本預(yù)處理步驟僅需半小時(shí)，琥珀酰丙酮的測(cè)試無需單獨(dú)處理具有擴(kuò)展性：類固醇疾病、維生素缺乏等多種臨床疾病二羧酸?；鈮A或氨基酸可能有兩個(gè)負(fù)電荷位置，影響正離子效率（分子的pKa值、流動(dòng)相的pH值）2020/11/328非衍生化法為應(yīng)用趨勢(shì)操作繁瑣(3h)過程難以標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)環(huán)境和人員有害需要氮吹設(shè)備衍生化法非衍生化法操作步驟簡(jiǎn)單(40min)易于標(biāo)準(zhǔn)化不涉及酸腐、有毒物擴(kuò)展性好發(fā)達(dá)國(guó)家的遺傳代謝病篩查已從傳統(tǒng)衍生化法逐步轉(zhuǎn)為非衍生化法（近5年美國(guó)12.20%→46.84%）2020/11/329標(biāo)本前處理方法比較衍生化實(shí)驗(yàn)步驟長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)過程2.5小時(shí)左右需要氮吹設(shè)備丁醇鹽酸具有強(qiáng)烈腐蝕性對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求高實(shí)驗(yàn)人員需防護(hù)試劑相對(duì)便宜非衍生化簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)過程實(shí)驗(yàn)過程1小時(shí)無需氮吹及衍生化過程環(huán)境好人員無需特殊防護(hù)試劑價(jià)格相對(duì)貴2020/11/330美國(guó)CDC統(tǒng)計(jì)年度N熒光法比例%MS（N）MS%非衍/衍生%衍生化非衍生化2009218135116.175638452.250.82010214135116.399535563.135.72011250236814.7111662269.555.72012248335414.2108666770.661.42013263051019.4%106580471.175.5Phe測(cè)定標(biāo)本數(shù)為例2020/11/331檢測(cè)指標(biāo)選擇2020/11/332不同酶缺陷引起不同代謝途徑差異引起特定指標(biāo)升高或降低氨基酸代謝病可有一種或數(shù)種氨基酸水平異常有機(jī)酸血癥或脂肪酸氧化代謝病可有一種或數(shù)種?；鈮A水平異常一種指標(biāo)異?？商崾疽环N或幾種代謝病一種疾病也可對(duì)應(yīng)多種指標(biāo)異常計(jì)算不同氨基酸或?；鈮A之間的比值，有助于不同疾病之間的鑒別，降低假陽性率或假陰性率。2020/11/333一個(gè)指標(biāo)對(duì)應(yīng)一種疾病疾病指標(biāo)丙二酸血癥C3DC戊二酸血癥I型C5DC精氨酸血癥ARG酪氨酸血癥TYR2020/11/334多個(gè)指標(biāo)對(duì)應(yīng)一種疾?。褐饕笜?biāo)疾病指標(biāo)苯酮尿癥PHE，TYR，PHE/TYR楓糖尿癥LEU/ILE，VAL戊二酸血癥第II型C4，C5，C8，C8:1，C10，C12，C14，C16極長(zhǎng)鏈?；o酶A脫氫酶缺乏癥C14:1，C14,C16，中鏈?；o酶A脫氫酶缺乏癥C6，C8,C10，C8/C102020/11/335一個(gè)指標(biāo)對(duì)應(yīng)多種疾病疾病指標(biāo)3-甲基巴豆酰輔酶Α羧化酶缺乏癥C5OH±C5OH3-羥基-3-甲基戊二酸尿癥C5OH±C6DCB-酮硫解酶缺乏癥C5:1±C5OH3-甲基戊烯二酸血癥C5OH多種羧化酶缺乏癥C5OH±C32020/11/336一個(gè)指標(biāo)對(duì)應(yīng)多種疾病疾病指標(biāo)丙酸血癥、甲基丙二酸血癥C3瓜氨酸血癥、NICCDCit↑OTC，CPS，NAGSCit↓2020/11/337疾病與臨床癥狀疾病臨床癥狀氨基酸代謝障礙PKU、MSUD、尿素循環(huán)障礙智力低下、發(fā)育遲緩、高血氨有機(jī)酸代謝障礙MMA、PA、IVA代謝性酸中毒、嗜睡、呼吸窘迫、周期性代謝危象脂肪酸代謝障礙MCAD、VLCAD、LCHAD低血糖、昏迷、猝死、心肌病2020/11/3382020/11/339疾?。ㄈ毕菝福┏Ｒ娍s寫主要標(biāo)志相關(guān)比例異戊酸血癥（異戊?；o酶A脫氫酶缺乏）IVAC5C5/C0,C5/C2,C5/C3戊二酸血癥I型（戊二酰輔酶A脫氫酶缺乏）GAIC5-DCC5-DC/C5-OH,C5-DC/C8,C5-DC/C163-羥-3-甲基戊二酰輔酶A裂解酶缺乏癥HMGC5-OH,C6-DCC5-OH/C8多種?；o酶A脫氫酶缺乏MCDC5-OHC5-OH/C8甲基丙二酸血癥(甲基丙二酰-CoA變位酶)MUTC3C3/C2,C3/C163-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥（3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶，α，β亞組）3MCCC5-OHC5-OH/C8,C5-OH/C0甲基丙二酸血癥（腺苷鈷胺素合成）CblA，BC3C3/C2,C3/C16丙酸血癥(丙酰-CoA羧化酶)PROPC3C3/C2,C3/C16β酮基硫解酶缺乏癥BKTC5:1,C5-OHC5-OH/C8甲基丙二酸血癥合并同型半胱氨酸血癥(MTHF甲基轉(zhuǎn)移酶）CblC,DC3C3/C2,C3/C16,C3/Met甲基丙二酸血癥合并同型半胱氨酸血癥(MMADHC蛋白)CblC,DC3C3/C2,C3/C16,C3/Met

丙二酸血癥MALC3-DCC3-DC/C10異丁酰甘氨酸血癥(異丁酰-CoA脫氫酶)IBGC4C4/C2,C4/C3,C4/C82-甲基3-羥基丁酰輔酶A水解酶缺乏癥2M3HBAC5-OHC5-OH/C82-甲基丁酰甘氨酸血癥(2-甲基丁酰-CoA脫氫酶)2MBGC5C5/C0,C5/C2,C5/C33-甲基戊二酰血癥

(3-甲基戊二酰-CoA水合酶)3MGAC5-OHC5-OH/C82020/11/3402020/11/341新生兒篩查的首要代謝疾病氨基酸類代謝病6苯丙酮尿癥楓糖漿尿癥同型胱氨酸尿癥瓜氨酸血癥精氨酸琥珀酸血癥酪氨酸血癥Ι型脂肪酸類代謝病5中鏈?；o酶A脫氫酶缺乏癥極長(zhǎng)鏈乙酰輔酶A脫氫酶缺乏癥長(zhǎng)鏈-3-羥酰輔酶A脫氫酶缺乏癥三功能蛋白缺乏癥肉堿攝取缺陷癥有機(jī)酸類代謝病9異戊酸血癥