天然產(chǎn)物分離技術(shù)

天然產(chǎn)物分離技術(shù)第一頁，共五十二頁，2022年，8月28日前言重要性

天然藥物的開發(fā)（WTO，知識產(chǎn)權(quán)）提取基礎(chǔ)分離第二頁，共五十二頁，2022年，8月28日提取

1文獻化學成分種類

2系統(tǒng)預試

3提取溶劑

a水（鞣質(zhì)、糖類、蛋白質(zhì)）

HClNaOH成鹽溶出冷水、熱水

b醇（乙醇、甲醇）

95%--alkaloids60-70%--皂苷、黃酮苷

40-50%--強心苷

c丙酮、乙酸乙酯、苯等（苷元）第三頁，共五十二頁，2022年，8月28日

4提取方法

a冷浸法（3-4次）

優(yōu)缺點

b滲漉法（10倍量）

受熱易分解物溶劑梯度

c煎煮法（3-4次）水或稀醇第四頁，共五十二頁，2022年，8月28日分離

1分類

a粗分（部位分離）

b細分（部位分組分離）

c單離（單體成分分離）

2方法層析（平面層析、柱層析、逆流層析）

SFE

結(jié)晶第五頁，共五十二頁，2022年，8月28日平面層析

TLC

定性：預試對照——標準品種類：硅膠G,GF254

顯色：廣泛——碘、H2SO4—EtOH

專屬——alkaloids,flavonoids等第六頁，共五十二頁，2022年，8月28日PTLC（PreparativeTLC）

制備量g級

1吸附劑（adsorbents）材料：Silicagel尺寸：20*2020*40厚度：0.5-2mm2樣品帶手工自動點樣器第七頁，共五十二頁，2022年，8月28日樣品帶寬的解決方法a用極性流動相展開約2cm，使帶變窄b用帶濃縮帶的板子

3流動相選擇

三角性法則4樣品的收集洗脫

顯色：定位轉(zhuǎn)移洗脫第八頁，共五十二頁，2022年，8月28日

5

PTLC制備樣品時引入的雜質(zhì)

粘合劑雜質(zhì)指示劑Other(分解物)(Al2O3作吸附劑)

難點解決辦法：SephedexLH-20

第九頁，共五十二頁，2022年，8月28日

6技術(shù)發(fā)展

aHPTLCb巨形板TLC

不銹鋼板(60*60)厚度5mm

上樣量＞10gc帶濃縮帶TLCd展開方式

多次展開（同方向）雙向展開

e移植TLC第十頁，共五十二頁，2022年，8月28日

OPLC（OverpressureLayerChromatography）又稱OverpressureTLC(OPTLC)

1簡介

1979年Tyihak綜合TLC,HPTLC優(yōu)點，吸收HPLC的某些特點。

平面細顆粒蒸汽相恒流速第十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日

2裝置

3特點

a與傳統(tǒng)PTLC比較

b效率50mg~0.5g1hc優(yōu)點

4制備型OPLC

聯(lián)機檢測分段收集

5應(yīng)用氨基酸，多肽，胡蘿卜素，生物堿等第十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日離心薄層層析（CTLC）

centrifugalTLC,Chromatotron1概述

CTLC是在TLC和柱色譜基礎(chǔ)上發(fā)展起來利用旋轉(zhuǎn)離心力，連續(xù)洗脫

2儀器傾斜盤流動相中央進入梯度、UV檢測、N2保護固定相活化反復使用第十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日

3特點

優(yōu)點：

（1）快速<30min

（2）流動相少（3）可反復使用（4）進樣方便（5）直接洗脫（6）直接檢測，接收靈活（7）可梯度洗脫（8）占地小，移動方便（9）分離雜質(zhì)少第十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日

3特點

缺點：

（1）固定相限制（2）Rf值（3）顯色（4）收集污染（5）上樣量少

4應(yīng)用

生物堿、人參皂苷

5注意事項第十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日柱層析

ColumnChromatogrphy

常壓柱層析(0.1~50g)

（OrdinaryColumnChromatogr.）

吸附性柱色譜

分配性柱色譜植物有效

柱色譜離子交換柱色譜成分分離

凝膠過濾柱色譜主要手段聚酰胺柱色譜大孔吸附樹脂第十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日一、吸附性柱層析

Al2O3orSilicagel

生物堿水溶性

Al2O3

甾體脂溶性Silicagel

揮發(fā)油脂溶性

1裝柱

Al2O3：吸附劑:樣品(20~50:1)(20~100:1)Silica：吸附劑:樣品(30~100:1)(300~400:1)1)干法與TLC吻合度較好，溶劑消耗少

2)濕法緊密，前沿整齊

第十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日

2上樣

1)濕法溶劑溶解上樣（少量），低極性

2)干法低極性溶劑溶解性差

3洗脫常壓低壓梯度洗脫

4收集與檢查

等份

TLCUV第十八頁，共五十二頁，2022年，8月28日二、聚酰胺（Polyamide）

1原理

a氫鍵吸附原理酰胺鍵

酚類、酸類、醌類、硝基化合物成氫鍵能力與溶劑有關(guān)水<甲醇<乙醇<丙酮<稀氨液<稀NaOH

氫鍵吸附規(guī)律：基團多少；基團位置；芳香核，共軛雙鍵；分子內(nèi)氫鍵

b極性吸附原理非極性脂肪鏈

萜類、甾體、生物堿

黃酮苷與苷元非水（正相）含水（反相）第十九頁，共五十二頁，2022年，8月28日

2聚酰胺粉的制備國產(chǎn)（15~30目）層析用（80~100目）

粗粉蒸餾水浸泡過夜，磨細，混懸液直接使用抽濾后，60~80度烘干2~3小時備用3操作a裝柱細粉水浸泡裝柱，自然沉降b上樣20~30%水溶液上樣40-60:1c洗脫水含水醇95%醇3%NaOH5%NaOH4再生5%NaOH第二十頁，共五十二頁，2022年，8月28日三、分配性柱層析

1原理利用混合物在兩相互不混溶中分配系數(shù)不同，而達到分離的一種柱層析方法。分配系數(shù)差異愈大，分離效果愈好。2支持劑

硅膠、硅藻土、纖維粉

3溶劑系統(tǒng)的選擇PC層析選擇4操作a裝柱b上樣c洗脫第二十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日四、凝膠柱層析（SephadexLH-20）

1葡聚糖凝膠簡介

由葡聚糖凝膠SephadexG-25交聯(lián)親脂性羥丙基而制備，是同時具備吸附層析、分配色譜和分子篩功能的獨特層析介質(zhì)，溶劑系統(tǒng)沒有限制，包括水相緩沖液、丙酮、乙酸乙脂、氯仿、二氯甲烷、四氫呋喃、甲苯和各種混合溶劑，大量文獻證明它非常適合于天然產(chǎn)物純化，特別是中草藥有效成分如甙類、生物堿、黃酮、蒽醌、內(nèi)酯、帖類、甾類、多酚的分離。德國科學家HansHenke著有SephadexLH-20凝膠色譜分離專著，詳盡敘述了SephadexLH-20在植物化學研究中的應(yīng)用。第二十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日

2原理

分子篩：分子的大小和形狀吸附層析：被分離化合物與凝膠間的氫鍵分配層析：被分離化合物在流動相（溶劑）和固定相（凝膠）之間的分配

3操作a裝柱洗脫劑溶脹后懸浮液攪拌裝柱b上樣c洗脫

水溶性好水或電解質(zhì)溶液水溶性差醇水或丙酮水極性較小丙酮、氯仿第二十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日d濃縮

視情況而定

e再生洗脫劑平衡有污染：0.2NNaOH---0.5NHCl浸泡水洗凈---平衡保存：50%丙酮水溶液4應(yīng)用實例例如，SephadexLH-20層析分離川穹里的腺嘌呤，貝母里的腺苷浙貝寧、茄啶，日本附子里的烏頭堿，銀杏黃酮甙，夏枯草中的夏枯草黃酮苷、皂苷，升麻中的酰胺苷，水蔓菁中的水蔓菁萜苷，鹿銜草中的鹿蹄草苷，淫羊霍中的羊霍苷，多種中草藥中的蘆丁蕓香苷，紅花中的槲皮素、蘆丁、山柰酚、紅色素等多種黃酮，麥冬中的麥冬黃酮，鹿蹄草中的兒茶素，紫草中的萘醌、多酚。第二十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日五、離子交換柱層析

1原理利用大分子樹脂網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)存在的交換基團而進行的交換性柱層析方法。

2影響離子交換的因素

PH值欲交換化合物的性質(zhì)欲交換化合物的濃度溫度交換溶劑交換流速樹脂用量第二十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日3樹脂的選擇李伯廷書91頁

4操作a樹脂預處理b裝柱c上樣d交換e洗脫f樹脂再生5實際應(yīng)用第二十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日六、大孔吸附樹脂層析

1大孔吸附樹脂簡介

大孔樹脂吸附技術(shù)是上世紀七十年代發(fā)展起來的一種新工藝，是由苯乙烯、二乙烯或a-甲基丙烯酸酯等聚合而成的高分子網(wǎng)狀孔穴結(jié)構(gòu)。藥液通過大孔樹脂吸附，其中的有效成分吸附在樹脂上，再經(jīng)洗脫回收，可除掉藥液中雜質(zhì)，是一種純化精制藥的有效方法。非極性吸附樹脂在吸附藥液中成分時,主要是依靠物理結(jié)構(gòu)（如比表面、孔徑等）起作用，不同的樹脂有不同的針對性。其操作的基本程序大多是：提取液－通過大孔樹脂－吸附上有效成分的樹脂－洗脫－洗脫液回收－洗脫液干燥－半成品。該技術(shù)目前已較廣應(yīng)用于新藥的開發(fā)和生產(chǎn)中,主要用在分離和提純過程中。2大孔吸附樹脂的優(yōu)點

經(jīng)大孔樹脂吸附技術(shù)處理后，可有效地去除水煎液中大量的糖類、無機鹽、黏液質(zhì)等吸潮成分，有利于多種中藥劑型的生產(chǎn)，增強產(chǎn)品的穩(wěn)定性。大孔樹脂吸附技術(shù)還能縮短生產(chǎn)周期,所需設(shè)備簡單。免去了靜置沉淀、濃縮等耗時多的工序。第二十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日3大孔吸附樹脂吸附機理

4影響分離的因素

分子極性大小分子體積PH值樹脂柱的清洗洗脫液的選擇第二十八頁，共五十二頁，2022年，8月28日5操作a樹脂預處理b裝柱c上樣d洗脫e樹脂再生

6實際應(yīng)用

適合中等程度的水溶性化合物中藥、天然色素，從發(fā)酵液中得到抗生素、（青霉素先鋒霉素螺旋霉素）蛋白質(zhì)（胰島素肽系抗生素）功能性食品添加劑（維生素）等聚苯乙烯合成吸附樹脂吸附含有π電子的化合物如含有苯環(huán)和共軛雙鍵的化合物

甲基丙烯酸甲酯類吸附劑吸附含羧基、酯基、氨基、酰胺基等與H可結(jié)合的官能團的化合物

第二十九頁，共五十二頁，2022年，8月28日

特殊柱層析

（SpecialColumnChromatogr.）

干柱柱層析

減壓柱層析植物有效成分

特殊柱層析短柱柱色析分離新方法閃式柱色析棒色譜

一、干柱柱層析

1簡介第三十頁，共五十二頁，2022年，8月28日

2特點

a優(yōu)點

分離效果比濕法裝柱高可用薄層最佳分離條件直接套用對有熒光或顏色的物質(zhì)，可在紫外燈下將已分離的各層帶分別切開，避免常規(guī)液相層析中因流出液收集不當而造成的層帶交叉適用于制備性分離設(shè)備簡單，消耗溶劑少，工時省，共軛雙鍵；分子內(nèi)氫鍵

b缺點

樣品容量比濕法裝柱小，因此，消耗填充劑量大

第三十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日

3原理與薄層層析相同，借顆粒間的孔隙所產(chǎn)生的毛細作用而展層，因此，可套用薄層條件，分離效果亦相同。干填充劑顆粒的深孔內(nèi)充滿空氣，溶劑和樣品分子很難進入顆粒的深孔，吸附與解吸主要在外部表面進行?？朔藰悠贩肿佑捎谶M出填充劑深孔所造成的擴散及傳質(zhì)緩慢，因此其柱效比濕裝柱高。

a種類（填充劑）氧化鋁活性III~V吸附層析硅膠活性II~III干柱聚酰胺層析分配層析第三十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日b展開劑

多采用混合溶劑

避免溶劑解混產(chǎn)生，影響分離效果解決辦法：搭配極性相差適當?shù)娜軇?/p>

如石油醚－乙醚氯仿－乙醇石油醚－乙醇氯仿－甲醇

苯、苯酚等不透過紫外光的溶劑對紫外光燈檢出層帶有影響

c分離條件探索

探索和選擇對樣品分離度最大的填充劑和展開劑

薄層層析(最佳分離條件)

同批次第三十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日d樣品容量

1:100~1:300

樣品只能與吸附劑的外部表面接觸

4操作a柱的制備(常用50cm)

聚乙烯薄膜柱玻璃柱

b加樣和展開加樣：溶液加樣；拌樣加樣展開：

c層帶的定位及分割

第三十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日二、減壓柱層析（抽柱VacuumLiquidChromatography)

1簡介

簡便、實用、快速的層析方法，其基本原理與吸附層析相同，適用于較大量的制備性分離或提取物的極性分段劃分。（粗分）2操作

G-4垂熔玻砂漏斗或短粗柱、磨底抽濾瓶、減壓泵及分部收集瓶組成。a裝柱b上樣c洗脫d收集第三十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日

3注意事項a真空度

20~70mmHg

b洗脫劑極性由小到大梯度遞增

c交叉色帶4應(yīng)用實例二萜生物堿的分離黃酮類化合物的分離

第三十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日三、短柱柱層析（抽柱VacuumLiquidChromatography)

短柱柱層析在制備量分離方面有獨到之處，在微量成分的富集上有一定實用價值。1短柱層析理論

經(jīng)典色譜理論：柱效隨柱徑的加大而下降，柱子愈長，分離越好，柱效越高。

近來研究發(fā)現(xiàn)，此理論有一定局限性，在實踐基礎(chǔ)上，提出新的觀點：柱徑加大后，在適當條件下柱效反而提高。a適當條件：柱徑：3~20cm短粗柱柱長：5~30cm第三十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日b原因

(1)Knox提出“無限直徑效應(yīng)”，認為柱短，柱徑相對較粗，層析相對集中于中部進行，消除或減少了“柱壁效應(yīng)”。(2)柱短，可使洗脫液在柱內(nèi)受阻減少，且截面增大，使自然流速大大增加，為采用高細度吸附劑提供了可能條件。

2層析方法同普通柱層析，不同之處在于采用短粗柱，使用吸附劑粒度細小，且粒度范圍窄，裝柱應(yīng)盡量均勻。洗脫時多采用梯度洗脫，對洗脫劑選擇較嚴格。

3注意事項a填料、洗脫劑bRf>0.2c預純化操作第三十八頁，共五十二頁，2022年，8月28日四、閃式柱層析（FlashChromatography)

20世紀700年代后發(fā)展起來的一種快速柱層析技術(shù)。1簡介

柱短，分離時間短，快，分離效率高。閃式硅膠（FlashSicicagel）

進口，國產(chǎn)（山東即墨化學試劑廠）球型微粒，粒度在40-63um(230-400目)之間（均勻）

加壓層析0.3-1Kg/cm210mg-10g樣品10-15min

第三十九頁，共五十二頁，2022年，8月28日

2

操作

與普通柱層析法基本相同。a裝柱：濕法干法（20cm）b上樣：拌樣濕法c洗脫：Rf加液8-10cm，加壓3實際應(yīng)用

皂苷、甾體、生物堿、黃酮

第四十頁，共五十二頁，2022年，8月28日五、棒色譜（StickChromatography)

1簡介

與制備型薄層層析原理相同,分離量大。把硅膠、氧化鋁等制成園柱形的棒，下端上樣，上行展開而達到分離目的。（吳鳳鄂）2操作

a制棒b上樣c展開引導座－－兩端相通，內(nèi)填層析硅膠展開裝置－－層析槽，密封罩d收集3應(yīng)用

生物堿、皂苷、甾醇等第四十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日

加壓柱層析

（PressureLiquidChromatogr.）類型

低壓柱層析

加壓柱層析中壓柱色析高壓柱色析

優(yōu)點

分離因子a高，故能完成復雜的分離過程

a=兩組分的相對保留時間之比分離因子是評價色譜柱選擇性的一種指標第四十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日

制備型與分析型的區(qū)別：分析型：不要求樣品回收制備型：要求樣品載量高，因此便要求有特殊的層析裝置和操作系統(tǒng)基本原理1加壓柱層析效果的好壞

Speed分析型制備型ResolutionLoad與Load相關(guān)的因素柱徑柱長粒度填充劑密度第四十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日

2加壓柱層析目的

得出一個化合物Lab.一定純度生產(chǎn)規(guī)?；厥章蕟挝粫r間內(nèi)分得的化合物量

洗脫液流速快可用更細的顆粒，分辨率提高避免不穩(wěn)定化合物在開口柱上由于長時間暴露而導致分解（最大優(yōu)點）第四十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日

3分類（Classifcaton）

AnalyticalHPLC:ug---<5mgPrep.HPLC:5mg---gmsLow-pressureLC:10mg---1gMedium-pressureLC:100mg---100g

選擇制備型系統(tǒng)要考慮的事

以上各法的極限（適應(yīng)范圍）要分離的樣品量根據(jù)以上條件要求而選用的方法柱大小，固定相，壓力，洗脫劑

經(jīng)驗積累第四十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日

4操作aTLC探索條件（層析系統(tǒng)選擇）b分析型小試c優(yōu)化條件（超載）d套用優(yōu)化條件（制備）e正式操作f獲得純品g分析鑒定純品h再生柱正相：actone—water—methanol—THF---dichloromethane反相：water---methanol第四十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日

5Prep.LC的各種條件的應(yīng)用情況及優(yōu)化aColumn:loading,f,size,columnefficiency,a,K’numberoftheoreticalplates,resolutionbStationaryphase:液—液,固—液,粒度大小硅膠---普通,鍵合相