遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)雙周周四

Meikin是第一次減數(shù)特定的動(dòng)粒功能的保守調(diào)節(jié)Meikinisaconservedregulatorofmeiosis-I-specifickinetochore【在有絲和減數(shù)中，動(dòng)粒是調(diào)節(jié)分離重要的結(jié)構(gòu)。尤其是在第一次減數(shù)中，不像在有絲的后期得到保護(hù)。盡管減數(shù)動(dòng)粒因子只在發(fā)芽的和裂殖的酵母細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，這些分子和它們的功能被認(rèn)為之前就已經(jīng)產(chǎn)生了。因此，減數(shù)動(dòng)粒的保守調(diào)節(jié)機(jī)制仍然是個(gè)謎?，F(xiàn)在我們?cè)诶鲜笊砩习l(fā)現(xiàn)了減數(shù)特定的動(dòng)力因子，它只在第一次減數(shù)中發(fā)揮作用，而不在有絲或者第二次減數(shù)中起作用，我們命名為聚合體的。這些功能主要被PLK1調(diào)節(jié)，PLK1依靠MEIKIN在動(dòng)粒中被擴(kuò)增。我們的綜合分析表明被期待已久的減數(shù)MEIKIN，MEIKIN【正文在有絲中，姐妹染色單體在S期依靠黏連蛋白形成聚合體，直到中期被來(lái)自相反的兩極的紡錘體微管解，而分離酶可以分離黏連蛋白亞單位RAD21，并沿著整個(gè)除去黏連蛋白復(fù)合體。黏連蛋白的移除引起姐妹染色單體的分離和她們向兩極運(yùn)動(dòng)，這個(gè)過(guò)程叫做均等。然而，在減數(shù)中過(guò)程中，RAD21沿的功能基本被減數(shù)黏連蛋白R(shí)EC8取代，DNA一次而核兩次會(huì)產(chǎn)生四個(gè)單倍體核或配子（Fig.1a）I，極捕獲（同向性。在第一次減數(shù)后期啟動(dòng)的時(shí)候，分離酶沿著的臂將REC8黏連蛋白分離開(kāi)，但是在著6個(gè)標(biāo)志性功能，這種功能在真核生物中具有廣泛的保守性(Fig.1a)。越來(lái)越多的表明對(duì)黏連蛋白的保護(hù)是被(

Spo13以及Mam1

8、 于解決這個(gè)存在已久的問(wèn)題，即減數(shù)的動(dòng)粒調(diào)節(jié)是否從酵母到哺乳動(dòng)物是保守的，如果是，那么具體是怎樣的哺乳動(dòng)物的減數(shù)動(dòng)粒蛋白(尋找可以與老鼠CENP-C相互作用的蛋白(ExtendedDataFig.1a)。最頻繁獲得的拷貝序列(A10Rik基因)編碼一種新型蛋白——我們叫它MEIKIN（meiosis-specifickinetochoreprotein減數(shù)特異性著絲粒蛋白。MEIKIN在初級(jí)細(xì)胞中有特殊表達(dá)（無(wú)論是還是，但不在其他表達(dá)。(ExtendedDataFig.1b)用Blast進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)MEIKIN是一種存在于脊椎動(dòng)物中的新發(fā)現(xiàn)的型性蛋白。(ExtendedDataFig.2)為了確定MEIKIN的定位我們?cè)诩?xì)胞中使用SYCP3（極化元素的成分之一進(jìn)行免疫組化染色并使用ACA對(duì)著絲粒的結(jié)構(gòu)蛋白（CENP-C）進(jìn)行染色(Fig.1b以及ExtendedDataFig.3a)。在粗線期，當(dāng)同源聯(lián)會(huì)的時(shí)候，MEIKINMEIKINI后期徹底。減II期間，MEIKIN沒(méi)有再出現(xiàn)在染色質(zhì)中。相比之下，ACA（或者CENP-C）在偶線期數(shù)量增多，并一直存在于減I與減II中(Fig.1b以及ExtendedDataFig.3a)。在細(xì)胞中，這種定位模式是相似的(拓展數(shù)據(jù)Fig.3b,c).。為了確定MEIKIN的定位機(jī)制，我們通過(guò)在中表達(dá)融合了GFP的細(xì)胞縮小了MEIKIN的動(dòng)粒定位序列，并且發(fā)現(xiàn)了在著絲粒定位中扮演重要角色的羧基端保守序列(Fig.1cFig.1d2。我們因此得出結(jié)論：MEIKIN是第一次減數(shù)特有的著絲粒蛋白，它的局域化受與CENP-C的相互作用調(diào)控。?????????????/?為了定MEIKN在數(shù)中的能我們培育出?????????的老鼠（拓展數(shù)據(jù)Fig.4ac).。細(xì)的免組化染色也證實(shí)?????????老鼠的動(dòng)粒中沒(méi)有MEIKINFig.1并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)?????????和野生老鼠移以及的任何顯著差異，盡管在?????????????/?老鼠的內(nèi)很難檢測(cè)到成熟。(拓展數(shù)據(jù)Fig.4d–g).細(xì)胞的免疫組化染色顯著表明，隨著極化元素的正常合成，減數(shù)前期照常進(jìn)行，接著在粗線期發(fā)生聯(lián)會(huì)，并隨后形成凝縮的減數(shù)MEIKINGV階段的細(xì)胞孤立起來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)被放在培養(yǎng)基后，GV細(xì)胞繼續(xù)減數(shù)，并經(jīng)歷生發(fā)泡的分（GVBD進(jìn)入第一極體，減I可以通過(guò)第一極體的脫離而被監(jiān)測(cè)到。光學(xué)顯微鏡下觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，?????????????/?的細(xì)胞分I的(Fig.2a).。在野生鼠的細(xì)胞中，二價(jià)在GVBD后6h被排列在赤道板處，因此形成了中期板(Fig.2b).盡管?????????????/?的細(xì)胞也在減I中期出現(xiàn)了二價(jià)的排列的集合是被擾亂的(Fig.2b)。因?yàn)榧忓N體集合監(jiān)測(cè)點(diǎn)的失活使?????????????/?后期的啟動(dòng)不再延遲（Fig.5),，所以我們認(rèn)為可能是排列缺陷和紡錘體集合監(jiān)測(cè)點(diǎn)的激活使后期I為了分析減數(shù)著絲粒和的時(shí)空動(dòng)態(tài)變化，我們記錄了一系列著絲粒和的4維數(shù)據(jù)并用2mEGFP–CENP-C和組蛋白2B(H2B)–mCherry。我們對(duì)野生鼠和?????????????/?鼠細(xì)胞采取了同樣的方法，證實(shí)了無(wú)論是野生鼠的細(xì)胞還是?????????????/?的細(xì)胞，排列在中期板的二價(jià)在后期I都分離了（Fig.2c。然而引人注意的是，?????????????/?細(xì)胞的許多對(duì)姐妹著絲粒都在后期I啟動(dòng)的時(shí)候分離了，而很多（Fig.2c推測(cè)是因?yàn)榻忝萌旧珕误w被分離。事實(shí)上，免疫染色的結(jié)果表明盡管REC8在中期I通常定位于二價(jià)上的中間軸，但是在?????????????/?細(xì)胞中期II的上，REC8信號(hào)丟失(Fig.2e)。中期I時(shí)期REC8信號(hào)（和黏連蛋白）的丟失導(dǎo)致讓人聯(lián)想到shugoshin-2（SGO2，也被認(rèn)為是SGOL2）——老鼠減數(shù)著絲粒黏連蛋白的保護(hù)蛋白缺陷的老鼠的表型(Fig.2e)。我們隨后檢測(cè)了二價(jià)來(lái)定位SGO2，SGO2通常在中期I出現(xiàn)在著絲粒區(qū)域（refs11,12Fig.6a注意的是，與???????/?細(xì)胞相比，?????????????/?細(xì)胞在后期I中的著絲粒分離缺陷卻不那么嚴(yán)重（拓展數(shù)據(jù)Fig.6bMEIKIN(Fig.2b),（~20％（Fig.3a于交叉（或者同源張立）而受到抑制，那我們可以使用在減數(shù)I中的交叉已顯著減少且單的多數(shù)單價(jià)沒(méi)能排列在赤道板，抑制了后期I的啟動(dòng)（ref.27）(Fig.3b)。有趣的是，隨著?????1?/?細(xì)胞中(Figs2a和3b).。我們?cè)贕VBD之后10h內(nèi)，?????1?/?或者?????1?/?、?????????????/?細(xì)胞還沒(méi)有進(jìn)入后期I的時(shí)候，檢測(cè)了的排列。中期板聯(lián)會(huì)以及姐妹著絲粒分離>0.6μm在?????1?/?細(xì)胞中比在?????1?/?、（Fig.3c向分離缺陷（Fig.3d).。因此，我們得出結(jié)論：MEIKINMEIKINMEIKINMEIKINCENP-CPLK1（Fig.7).。免疫沉淀反應(yīng)的試驗(yàn)表明在內(nèi)核染色質(zhì)提取物中的MEIKIN和PLK1發(fā)生免疫沉淀(Fig.4a).。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫染色的結(jié)果表明在雙線期，PLK1定位于PLK1，并在中期I達(dá)到峰值，在后期I迅速衰減，而此時(shí)MEIKIN徹底。在中期II，中心體的定位非常顯著，但是著絲粒的定位顯示出衰減到和有絲相近的等級(jí)，這表明著絲粒的PLK1擴(kuò)增是減I特有的(Fig.4b).值得注意的是著絲粒的PLK1的信號(hào)在?????????????/?細(xì)胞中減弱(Fig.4b,c).，在?????????????/?細(xì)胞中分散。這些結(jié)果顯示，MEIKINPLK1I們?cè)O(shè)法在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，過(guò)加入PLK1抑制劑BI2536(ref.28)來(lái)抑制減I期PLK1的活動(dòng)。我們?cè)贕VBD后4h到6h之間用BI2356對(duì)細(xì)胞處理了2個(gè)小時(shí)因?yàn)檫@個(gè)短暫的處理可以使得約70％的卵母細(xì)胞減I并抑制著其絲粒區(qū)PLK1的活動(dòng)(拓展數(shù)據(jù)Fig.8a,b).。超過(guò)一半的BI2356處理后的細(xì)胞在中期II出現(xiàn)了排列這很可能是因?yàn)槎鄶?shù)或者全部的姐妹染色單體在減I期分離(Fig.4d和拓展數(shù)據(jù)Fig.8c)。相應(yīng)的，被BI2356處理后的多數(shù)細(xì)胞在中期II時(shí)，著絲粒區(qū)的REC8減少(Fig.4e和拓展數(shù)據(jù)Fig.8d)。這些結(jié)果顯示，PLK1的活動(dòng)，至少中期I之后，是需要被用來(lái)在隨后的后期I中保護(hù)著絲粒REC8黏接下來(lái)我們通過(guò)對(duì)?????1?/?細(xì)胞在GVBD后使用BI2356處理9h到10h來(lái)檢測(cè)PLK1的活動(dòng)是否在減I的姐我們認(rèn)為，PLK1也在促進(jìn)細(xì)胞的定向分離起到重要作用。MEIKIN我們的分析表明小鼠的MEIKIN和栗酒酵母的Moa1也是類(lèi)似的，因?yàn)閮煞N突變類(lèi)型都表現(xiàn)出了定向分離和著絲Moa1卻攜帶推定結(jié)構(gòu)域（PBD）的結(jié)合位點(diǎn)（(Ser-Thr-Pro序列(Fig.5a)。免疫沉淀試驗(yàn)表明，在體內(nèi)，Moa1與裂殖酵母的Polo（Plo1）通過(guò)PBD結(jié)合模體連接在一起(Fig.5b)。因?yàn)镻lo1事實(shí)上定位于減I的著絲粒(ref.30)(Fig.5cPlo1Moa1Moa1PBD(moa1-101A)突變的細(xì)胞以及moa1Δ細(xì)胞中，減I特有的著絲粒Plo1擴(kuò)增也了(Fig.5c)。我們隨后檢測(cè)了這些突變?cè)谥亟M缺陷（即染色胞同樣的姐妹染色單體分離(Fig.5dPBDMoa1為了描繪Plo1對(duì)于Moa1的作用，我們?cè)噲D使件數(shù)減數(shù)的Plo1失活。由于細(xì)胞水平的Plo1減少會(huì)損害紡錘體的形成和細(xì)胞核（數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示，我們?cè)噲D使用煙草紋飾（TEV）蛋白酶來(lái)改變內(nèi)源性Plo1（Plo1-TEV肽序列融合。事實(shí)上，表達(dá)了Cnp3C-TEV的Plo1-tev細(xì)胞表現(xiàn)出中期IPlo1-tev信號(hào)選擇性地在著絲粒處減少，但并不在SPB（酵母中心體）處減少，而表達(dá)了控制性Cnp3C并且未和TEV融合的Plo1-tev細(xì)胞顯現(xiàn)出Plo1-tev的正常定位(Fig.5e)。顯著的是，表達(dá)Cnp3C-TEV的Plo1-tev細(xì)胞主要經(jīng)歷了減I期的均等(Fig.5f)。因這些發(fā)現(xiàn)使人回想起曾觀測(cè)到出芽酵母Spo13具有PBD結(jié)合模體并與PLK（Cdc5）協(xié)同作用盡管Moa1Spo13的主要的氨基酸序列同源性丟失了，以及Cdc5具有的在減數(shù)中保護(hù)黏連蛋白的作用是主要的爭(zhēng)議之處(Fig.Cnp3C顯著地抑制，但不是被Spo13-145A–Cnp3C（攜帶PBD結(jié)合模體變異）的抑制(Fig.5g)。通過(guò)在moa1Δ細(xì)胞中表達(dá)Moa1以及它與Cnp3C融合的變異相似的結(jié)果也被盡管Moa1–Cnp3C產(chǎn)生了更強(qiáng)有力的抑制。Spo13是Moa1受啟發(fā)于我們發(fā)現(xiàn)的Spo13減數(shù)著絲粒調(diào)控者M(jìn)oa1結(jié)合到CENP-C上的現(xiàn)象，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了老鼠體內(nèi)的減數(shù)特有的著絲粒蛋白MEIKIN。盡管MEIKIN與Moa1之間并沒(méi)有顯著的序列同源性，但我們的研究揭示出這兩Spo13(refs21,22,26,31,34)具有一Spo13PLKmoa1Δ缺Cdc5I(refs16,32)的保護(hù)中的源物，形成了一個(gè)新的蛋白，我們?yōu)槠淙∶麨椤甅eikin’。 出芽酵 REC8正在MEIKIN守的就裂殖母中的Moa1只在DNA之后被要一樣MEKIN開(kāi)時(shí)在線期位于絲粒所以也許也是會(huì)控黏蛋白維持不是的建這些結(jié)一致是們的析表中期I的上的姐妹絲粒野生體內(nèi)聯(lián)合的而?????????小鼠中離的盡它們沒(méi)分地像絲的前期??/?、??????????????????MEIKINRC8 MeikinMeikinPLK 雖然比在減數(shù)的細(xì)胞中少，并且?????????????/?細(xì)胞的PLK減少較之細(xì)胞更為溫和，盡管減數(shù)的著絲MeikinPLK著絲粒功能的兩個(gè)標(biāo)記。因此當(dāng)下的研究為兩個(gè)同樣對(duì)減I分子水平相互協(xié)調(diào)這個(gè)長(zhǎng)期存在的問(wèn)題，提供了一個(gè)明確的答案。由于MEIKIN在人類(lèi)體內(nèi)是保守的，就像REC8黏連蛋白一樣，MEIKIN也許是與相關(guān)聯(lián)的【實(shí)驗(yàn)方法對(duì)于酵母雙雜交的篩選，小鼠編碼羧基端（692-906）CENP-CcDNA和碼羧基端（272-434）的MeikincDNApGBKT7（bait）AH109效果匹配的小鼠cDNA庫(kù)被轉(zhuǎn)化為菌株的誘餌，并且陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株在營(yíng)養(yǎng)限制板上被篩選（SD-trp-leu-his-ade,+10M3AT繁殖和序列中提取出來(lái)候選捉質(zhì)粒被重轉(zhuǎn)化為酵母菌株AH109以及bait載體或p53的負(fù)控制誘導(dǎo)載體。cDNAbaitPgbkt7：hCENP-C（732–945MPLK11–264，259–373Sgo2和?????1????1????????????敲除小鼠之前就

。所有單一的和雙倍 敲除小鼠都共同帶有C57BL/6背景。任何可能的時(shí)候，每一個(gè)敲除動(dòng)物被與同窩出生仔或者同一群體匹配的非同窩出生小2608，IMCBAH23-05-04，CDB)。沒(méi)有使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法預(yù)確定樣本量。Meikin A10rik）敲除小鼠和型分打靶載體被設(shè)計(jì)用于Meikin座的外顯子4。4.40kb和4.98kb的靶臂碎片，Meikin外顯子4的5'和3'端，分別使用PCR從小鼠C57BL/6BAC克?。≧PCI23-32I13)和定向克隆側(cè)翼pGK-Neo-polyA和DT-A盒中得到。同源重組細(xì)胞被來(lái)源于C57BL/6N52的Baltha1ES細(xì)胞孤立，并且嵌合小鼠是通過(guò)在桑葚胚中植入重組胚胎干細(xì)胞(hostICR)得到的（熊本大學(xué)，CARDG418（4,734bpNeo104F5'-TCTCCTGTGAGC,作用于右臂(5,531bpDNADNAPvuII5'DANC57BL/6的雌配，后代的型用PCR技術(shù)，使用以下引物進(jìn)行檢測(cè)：Ex3F(common-forward):5'-CCCCAGAGGAAAAGACACCACC-3',Ex4R(wild-type-reverse):5'-CTCGACAACAAGCTGTCCATCTC-3'Neo4R(（12周大雄性，8周雌性）鼠體內(nèi)的，副睪還有被安裝在Bouin氏液，并被嵌入石蠟中。組織取材被APS5μm(Matsunami)H.E.染色MEIKIN1-434MEIKIN（317–434MEIKINICRpET19bPet28c（Novagen）的cDNANi-NTA(QIAGEN)的(GEhealthcare)。下面的一抗被用來(lái)做免疫印跡（IB）和免疫熒光（IF）研究：小鼠的抗微管蛋白(IB,1:5,000IF,1:1,000,DM1A,Sigma,catalogueno.T9026ACA（(IF,1:20,MBL,catalogueno.NA-8184)PLK1(IBandIF,1:1,000,Abcam,catalogueno.ab17056),兔的抗-CENP-U/MLF1T78(IF,1:100,Abcam,catalogueno.ab34911H3(IB,1:1,000,Abcam,catalogueno.ab1791GFP(IF,1:1,000,Invitrogen,catalogueno.A11122m-CENP-C(IBandIF,1:1,000),mREC8(IF,1:500),鼠抗mREC8(IF,1:500),mSYCP3(IF,1:1,000)53mSGO2(IF,(1,000555以下二級(jí)抗體被用來(lái)做免疫熒光研究：Alexa488（Invitrogencatalogueno.A21202，驢抗兔子(Invitrogen,catalogueno.A21206),Alexa555結(jié)合的抗鼠(Invitrogen,catalogueno.A21422),驢抗兔子(Invitrogen,catalogueno.A31572),抗人(Invitrogen,catalogueno.A21433),抗家（Invitrogen,catalogueno.A21434),Alexa647結(jié)合的驢抗鼠(Invitrogen,catalogueno.A31571),抗兔子(Invitrogen,catalogueno.A21244),抗人(Invitrogen,catalogueno.A21445),抗(Invitrogen,catalogueno.A21247)。的????2環(huán)境和37℃下，在用10％的FBS增補(bǔ)的M16中培養(yǎng)(Sigma)，90min內(nèi)還歷GV分解（GVBD）的細(xì)胞被從實(shí)驗(yàn)中移除。對(duì)于細(xì)胞的藥物治療，100nMBI2536(ChemieTek),5mM逆轉(zhuǎn)素(Sigma)和10mM諾考達(dá)唑(Sigma)在顯示出的時(shí)間點(diǎn)被加入到培養(yǎng)媒介中，對(duì)照組細(xì)胞用等效體積的DMSO處理。過(guò)細(xì)胞過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾(BDFalcon)沖區(qū)達(dá)30min，使用PBS沖洗，并用3％BSA/PBT(0.1%TritonX-100/PBS)室溫下阻斷1h。為了測(cè)量前中期I早期姐妹著絲粒的距離，細(xì)胞被在1%的鏈霉蛋白酶(Sigma)中，以此除去透明帶，并固定在切片上的固定緩沖區(qū)3h。對(duì)于免疫染色細(xì)胞和細(xì)胞，樣本被簡(jiǎn)單的用PBS沖洗，室溫下用3%BSA/PBS阻斷10min，室溫下在3%BSA/PBS中用初級(jí)抗體培養(yǎng)1h和二級(jí)抗體培養(yǎng)1小時(shí)。全標(biāo)本包埋細(xì)胞中，在4℃下每個(gè)抗體被培育。切片用PBS沖洗，用含有DAPI的VEHIELD媒介安裝固定(VectorLaboratories)。在被CoolSnapHQCCD相機(jī)(RoperScientific)和DeltaVision系統(tǒng)(GEHealthcare)協(xié)助的IX-70顯微鏡(Olympus)中被獲取。只有全標(biāo)本包埋的細(xì)胞被FV1000共聚焦激光掃描顯微鏡在1μm的時(shí)間間隔FLUOVIEWOlympus)。測(cè)量姐妹著絲粒距離來(lái)說(shuō)通過(guò)z截面包圍整個(gè)胞核獲取通過(guò)對(duì)在結(jié)構(gòu)上保守的胞核的一對(duì)姐妹著絲粒C??2+??2+??2的平方根得以被測(cè)出。GFPMEIKIN，對(duì)于內(nèi)GFP標(biāo)記的MEIKIN變體的外源性表達(dá)，如前所述，質(zhì)粒DNA被注入活小鼠的內(nèi)，Meikin變體，后，再反向操作4次。隨后被返還于腹腔，腹壁和皮膚被縫合。免疫染色在電穿孔后24-28小時(shí)內(nèi)被實(shí)施，用以在使用兔抗GFP的情況下，評(píng)價(jià)GFP標(biāo)記的Meikin變體在細(xì)胞的定位(Invitrogen)。由于GFP標(biāo)記的蛋白在減數(shù)前中期表達(dá)的效率是5–10%，我們檢測(cè)了GFP陽(yáng)性細(xì)胞中GFP標(biāo)記的MEIKIN在著絲粒的定位。細(xì)胞共焦成RNAs2mEGFP–CENP-C(0.8pg)H2B–mCherry(0.2pg)進(jìn)行顯微注射，IBMX3hGVBDIBMX1.5經(jīng)歷GVBD的細(xì)胞在進(jìn)一步圖像分析時(shí)被移除高分辨率成像技術(shù)在GVBD開(kāi)始后5.5h展開(kāi)使用裝備有403C、高度消色透鏡1.2WCorrM27物鏡(CarlZeiss)和一個(gè)3D多位置宏的ZeissLSM710實(shí)施。我們獲取了平均兩512*512xy17z（1.5μm5min30.36mm330.36mm325.5mm。2mEGFP–CENP-C采用峰加強(qiáng)和去除背景。圖像shiy9ong使用Imaris(Bitne)3D重建，并且后期的著絲粒信號(hào)被手動(dòng)追蹤。著絲粒追蹤通過(guò)POV-Ray()可視。PCRRNATRIzol(Invitrogen).從組織中分離出來(lái)的，cDNA0.5μgRNASuperscriptIII(Invitrogen)，之后的Ex-Taqpolymerase(Takara)進(jìn)行PCR放大以及模板cDNA（從1ngRNA）得到的。用來(lái)從cDNART–PCRMeikin-F2:5’-agatggacagcttgttgtcgagta-3’;Meikink-R2:5’-ctcagcaa mSMC1-3516F:5’-ttacatcaaggaacagtcaacttgc-3’;mSMC1–3702R:5’-ctattgttcattggggttggggttg-3’;Zfp438-F1:5’-gtatgcaaggacctgacaactcac-3’;Zfp438-R1:5’-catttgcttcctcctctctgtgta-3’;BC051142-F1:5’-ccttatcaaccttgtcagccttct-3’;BC051142-R1:5’-ctcgaatctctttggacagcagta-3’;Nsun7-F1:5’-cctctcgatttaccatattctgcc-3’;Nsun7-R1:5’-tatcaaagccttcacagagtggac-3’;Spesp1-F1:5’-catgaagctggtggtcctagttg-3’;Spesp1-R1:5’-gatggaccagaatgctgtactttg-3’;Snf1lk-F1:5’-gaggtccagctcatgaaacttttg-3’;Snf1lk-R1:5’-gctagcttgatatccatgttgctg-3’;Acbd3-F1:5’-caggagcagcactatcagcagtat-3’;Acbd3-R1:5’-cgacttctcctcgacgtactgtaa-3’;Ncor1-F1:5’-aactcttctggtggaggtgactct-3’;Ncor1-R1:5’-tgcccaggaataggagatttagac-3’.兔的抗,MEIKIN蛋白以及從控制組的40–60只野生兔（3周大）中提取的染色質(zhì)結(jié)合蛋白中的IgG(5mg當(dāng)量)MOPS-SDS4–12%NuPAGE(Invitrogen)中跑，并使用液相色MEIKIN107M50mMTris-HCl(pH37℃下消化得到的混合多肽直接使用LC–MS–MS分析系統(tǒng)(Zaplous,AMR,Tokyo,Japan)進(jìn)行FinniganLTQ質(zhì)譜分析(ThermoScientificC18ESI（0.2350mm,LCassistBioworkss(ver.3.3;ThermoScientific)NCBISEQUEST人類(lèi)MeikincDNA人類(lèi)編碼Meikin同源cDNAs的氨基端（氨基酸1-264）和羧基端（氨基酸259-373）利用人cDNA文氨基端的NheI-hMEIKIN-N-1F:tACCGGTgctagcatgtggccgctacgggtctcc和NotI-hMEIKIN-N-795R:羧基端的NheI-hMEIKIN-C-1F:tACCGGTgctagcatgcagaaaacaaattccagtactc和 從Biochain購(gòu)得成人的冷動(dòng)物。在用PBS/0.1%TritonX100沖洗之后，像如上描述的那樣進(jìn)行免疫染色。（YE（SPA）進(jìn)行培養(yǎng)。moaΔ,GFP-3Pk-plo+和rec12D的構(gòu)建面已經(jīng)描述過(guò)。栗酒酵母的內(nèi)源性plo+的GFP羧基端標(biāo)記是使用基于PCR的靶向方法完成的。為了得到氨基端有3HA或者GFP標(biāo)記的Plo1，Plo1的兩側(cè)是5'ORF3'非翻譯區(qū)(UTR3HAGFPpUC119(3HA;vp183andGFPpak64PCR5'-UTR-3HA/GFP-plo1-3'-UTRplo1ts2ura4+菌株（來(lái)自IanHagan。為了得到plo1-tev等位，將TEV蛋白酶的識(shí)別序列Glu-Asp-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly(-Ala-Ser)同時(shí)插入通過(guò)定向位點(diǎn)誘pUC119pak645'-UTR-plo1-3'-UTR341405plo1-tev等位的PCR放大碎片被引入plo1-ts2::ura4菌株。Cnp3C-CFP-TEV的實(shí)施前面有所描述，然而增強(qiáng)子發(fā)