酶聯(lián)免疫吸附分析

酶聯(lián)免疫吸附分析第一頁，共三十七頁，2022年，8月28日第七章酶聯(lián)免疫吸附分析

第二頁，共三十七頁，2022年，8月28日抗原：抗原是指進(jìn)入人或動(dòng)物機(jī)體后，可刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，從而引起動(dòng)物產(chǎn)生抗體或形成致敏淋巴細(xì)胞，并能和抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)?？贵w：是由抗原刺激動(dòng)物的免疫系統(tǒng)后，由免疫系統(tǒng)產(chǎn)生分泌的能和相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。抗原抗體的基本特性：a、反應(yīng)的特異性；b、反應(yīng)的等比例性第三頁，共三十七頁，2022年，8月28日抗原-抗體識(shí)別反應(yīng)示意圖第四頁，共三十七頁，2022年，8月28日它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定。測(cè)定的對(duì)象可以是抗體也可以是抗原。在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）②酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）③酶作用的底物（顯色劑）一、ELISA原理第五頁，共三十七頁，2022年，8月28日測(cè)量時(shí)，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標(biāo)記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應(yīng)結(jié)合后，再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。ELISA原理第六頁，共三十七頁，2022年，8月28日YY其所生成的顏色深淺與欲測(cè)的抗原（抗體）含量成正比。

這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計(jì)（酶標(biāo)儀）加以測(cè)定。

方法簡(jiǎn)單，方便迅速，特異性強(qiáng)。ELISA原理第七頁，共三十七頁，2022年，8月28日酶及其底物酶結(jié)合物（過碘酸鹽氧化法、戊二醛交聯(lián)法）是酶與抗體或抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是ELISA成敗的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng)，還具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物，將得到不同的顏色反應(yīng)。ELISA原理第八頁，共三十七頁，2022年，8月28日酶底物顯色反應(yīng)

測(cè)定波長(zhǎng)

辣根過氧化物酶鄰苯二胺

四甲替聯(lián)苯胺

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽

橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍(lán)綠色492460449

425

642

堿性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍(lán)色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶

甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色

360,450

420

第九頁，共三十七頁，2022年，8月28日ELISA的種類和變化

（一）雙抗體夾心法（二）間接法（三）競(jìng)爭(zhēng)法（四）雙位點(diǎn)一步法（五）捕獲法測(cè)IgM抗體（六）應(yīng)用親和素和生物素的ELISA

第十頁，共三十七頁，2022年，8月28日（一）雙抗體夾心法此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原第十一頁，共三十七頁，2022年，8月28日獲得待分析物的未標(biāo)定抗體將特異性抗體與固相載體連接形成固相抗體洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)加入封閉蛋白溶液以封閉載體表面殘留的蛋白結(jié)合位點(diǎn)洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白加受檢標(biāo)本（抗原）形成固相抗體－抗原復(fù)合物洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)加酶標(biāo)抗體生成抗體—待測(cè)抗原—酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體加底物進(jìn)行酶催化反應(yīng)根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量測(cè)定第十二頁，共三十七頁，2022年，8月28日

間接法是檢測(cè)抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測(cè)已與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。（二）間接法第十三頁，共三十七頁，2022年，8月28日包被固相載體:用已知抗原包被固相載體加待檢標(biāo)本:使相應(yīng)抗體與固相抗原結(jié)合洗滌，除去無關(guān)的物質(zhì)加酶標(biāo)抗抗體:與固相載體上抗原抗體復(fù)合物結(jié)合；洗滌，除去未結(jié)合的酶標(biāo)抗抗體加底物顯色根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量測(cè)定第十四頁，共三十七頁，2022年，8月28日ELISA法間接法測(cè)定抗體1.原理第十五頁，共三十七頁，2022年，8月28日（三）競(jìng)爭(zhēng)法

對(duì)照管由于只加酶標(biāo)抗原，與固相抗體充分結(jié)合，故分解底物顯色深；測(cè)定管的顯色程度則隨待測(cè)抗原和酶標(biāo)抗原與固相抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的結(jié)果而異。如待測(cè)抗原量多，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合，使固相上結(jié)合的酶標(biāo)抗原量減少。因此，加入底物后顯色反應(yīng)較弱。第十六頁，共三十七頁，2022年，8月28日用已知特異性抗體包被固相載體測(cè)定管加待測(cè)抗原和一定量的酶標(biāo)抗原使二者與固相抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合對(duì)照管只加一定量酶標(biāo)抗原與固相抗體直接結(jié)合分別洗滌除去未結(jié)合的成分加底物顯色分別測(cè)定兩管的吸光度值，根據(jù)對(duì)照管與測(cè)定管吸光度值之比，計(jì)算標(biāo)本中待測(cè)抗原含量第十七頁，共三十七頁，2022年，8月28日ELISA特點(diǎn)一：靈敏性該測(cè)定法的靈敏度來自作為報(bào)告基團(tuán)的酶。酶是一種有機(jī)催化劑，很少量的酶即可誘導(dǎo)大量的催化反應(yīng)，產(chǎn)生可供觀察的顯色反應(yīng)現(xiàn)象。因此該體系常被稱為酶放大體系。ELISA實(shí)現(xiàn)了在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上對(duì)其進(jìn)行定量。例如，在測(cè)定血清中某一物質(zhì)的含量時(shí)，化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平，酶反應(yīng)測(cè)定法的敏感度約為5-10μg/ml。

第十八頁，共三十七頁，2022年，8月28日特點(diǎn)二：特異性其特異性來自抗體或抗原的選擇性?？乖贵w的結(jié)合實(shí)質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)之間。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性。

第十九頁，共三十七頁，2022年，8月28日ELISA要有三個(gè)必要的試劑，即免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。完整的ELISA試劑盒應(yīng)包含以下各組分：

（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑，俗稱酶標(biāo)板）；

（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（酶標(biāo)記物）；

（3）酶的底物；

（4）系列參考標(biāo)準(zhǔn)品（定量測(cè)定）；

（5）酶標(biāo)記物及樣本的稀釋液；

（6）洗滌液；

（7）反應(yīng)終止液。二、ELISA試劑第二十頁，共三十七頁，2022年，8月28日ELISA試劑盒第二十一頁，共三十七頁，2022年，8月28日ELISA試劑的作用2.1免疫吸附劑：已包被抗原或抗體的固相載體，是ELISA方法中的核心試劑。固相載體：

固相載體在ELISA測(cè)定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)?？勺鱁LISA中載體的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。專用于EILSA的產(chǎn)品稱為ELISA板，國(guó)際上標(biāo)準(zhǔn)的微量滴定板為8×12的96孔式。

良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。第二十二頁，共三十七頁，2022年，8月28日包被將抗原或抗體固定化的過程稱為包被(coating)。換言之，包被即是抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面的過程。抗體或蛋白質(zhì)等抗原是通過物理吸附與聚苯乙烯等固相載體結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的相互作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。載體對(duì)不同蛋白質(zhì)的吸附能力是不相同的，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。第二十三頁，共三十七頁，2022年，8月28日封閉封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被固相載體表面剩余吸附位點(diǎn)的過程。蛋白質(zhì)抗原或抗體包被時(shí)所用的一般濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的吸附位點(diǎn)，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些吸附位點(diǎn)，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附，增加ELISA反應(yīng)得專一性和靈敏度。封閉的程序與包被過程相類似。最常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白。研究表明，脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其最大的特點(diǎn)是價(jià)廉，可以高濃度使用（5%）。高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可直接當(dāng)作封閉劑使用，但由于奶粉的成份復(fù)雜，而且封閉后的載體不易長(zhǎng)期保存，因此在試劑盒的制備中較少應(yīng)用。第二十四頁，共三十七頁，2022年，8月28日2.2酶標(biāo)記物即酶標(biāo)記的抗原或抗體，是ELISA中最關(guān)鍵的試劑。良好的酶標(biāo)記物應(yīng)該是既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。酶標(biāo)記物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當(dāng)?shù)姆肿颖壤?，在酶?biāo)記物中應(yīng)盡量不含有或少含有游離的（未結(jié)合的）酶或游離的抗體（或抗原）。此外酶標(biāo)記物還要有良好的穩(wěn)定性。在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)和堿性磷酸酶(alkalinephosohatase,AP)。第二十五頁，共三十七頁，2022年，8月28日2.3酶的底物、HRP的底物

HRP催化過氧化物的氧化反應(yīng)，最具代表性的過氧化物為H2O2，其反應(yīng)式如下：

DH2+H2O2D+H2O

上式中，DH2為供氫體，H2O2為受氫體。在ELISA中，DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物，以便作比色測(cè)定。常用的供氫體有鄰苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(3,3‘,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB)

第二十六頁，共三十七頁，2022年，8月28日2.3.1HRP的底物OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結(jié)合物最常用的底物。OPD見光易變質(zhì)，與過氧化氫混合成底物應(yīng)用液后更不穩(wěn)定，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。TMB經(jīng)HRP作用后產(chǎn)物顯藍(lán)色，酶反應(yīng)用HCl或H2SO4終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸收波長(zhǎng)為405nm。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有無致癌性等優(yōu)點(diǎn)，因此在ELISA中應(yīng)用日趨廣泛。。第二十七頁，共三十七頁，2022年，8月28日

2.4.2AP的底物

AP為磷酸酯酶，一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate,p-NPP)作為底物，可制成片劑，使用方便。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在405nm波長(zhǎng)處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時(shí)間。

第二十八頁，共三十七頁，2022年，8月28日2.5洗滌液

滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)，其疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)借疏水鍵結(jié)合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團(tuán)和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時(shí)，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗(yàn)的靈敏度。第二十九頁，共三十七頁，2022年，8月28日2.6對(duì)照品陰性對(duì)照品須先行檢測(cè)，確定其中不含待測(cè)物質(zhì)。例如HBsAg檢測(cè)的陰性對(duì)照品中不可含HBsAg。陽性對(duì)照品多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)，其中加入一定量的待檢物質(zhì)，此量最好在試劑說明書中標(biāo)明。加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱。國(guó)外檢測(cè)HBsAg的ELISA試劑盒檢測(cè)敏感度約為0.5ng/ml，陽性對(duì)照品中含量約為10ng/ml。在對(duì)照品中一般加入抗生素和防腐劑，以利保存。2.7標(biāo)準(zhǔn)品定量測(cè)定的ELISA試劑盒應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測(cè)范圍的4-5個(gè)濃度，一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中。第三十頁，共三十七頁，2022年，8月28日1、樣品的采集與保存2、試劑的準(zhǔn)備3、包被4、加樣

在ELISA實(shí)驗(yàn)中一般有5次加樣步聚，即加標(biāo)準(zhǔn)品、加樣本、加酶標(biāo)記物、加底物、加反應(yīng)終止液。三、ELISA實(shí)驗(yàn)過程第三十一頁，共三十七頁，2022年，8月28日4、保溫

在ELISA中一般加標(biāo)本和加酶標(biāo)記物后會(huì)有一次抗原抗體反應(yīng)?？乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)。ELISA屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會(huì)，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個(gè)逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育。

第三十二頁，共三十七頁，2022年，8月28日5、洗滌

目的：分離游離的酶標(biāo)記物。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。洗滌的方式：自動(dòng)洗滌儀與手工操作。a.吸干或甩干孔內(nèi)反應(yīng)液；b.用洗滌液過洗一遍;c.浸泡，即將洗滌液注滿板孔，放置1-2分鐘，間歇搖動(dòng)，浸泡時(shí)間不可隨意縮短；d.吸干孔內(nèi)液體;e.重復(fù)操作c和d，洗滌3-4次（或按說明規(guī)定）。

第三十三頁，共三十七頁，2022年，8月28日6、顯色和比色顯色顯色是ELISA中的最后一步溫育反應(yīng)，此時(shí)酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在定量測(cè)定中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。底物顯色一般在室外溫或37℃反應(yīng)20-30分鐘后即不再加深，約40分鐘將達(dá)到顯色的頂峰，再延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，可使本底值增高。底物液受光照會(huì)