質粒提取及純化

質粒提取及純化第一頁，共二十四頁，2022年，8月28日DNA的提取和純化小量制備大量制備堿裂解小量制備法氯化銫/溴化乙錠平衡力新法堿裂解法制備粗制裂解物煮沸小量制備法第二頁，共二十四頁，2022年，8月28日名詞解釋1.質粒質粒zhìlì（Plasmid）是附加到細胞中的非細胞的染色體或核區(qū)DNA原有的能夠自主復制的較小的DNA分子（即細胞附殖粒、又胞附殖粒）。大部分的質粒雖然都是環(huán)狀構型，它存在于許多細菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物的線粒體等胞器中。然而，1984年，在Streptomycescoelicoler（天藍色鏈霉菌）等放線菌以及在Borreliahermsii（赫氏蜱疏螺旋體）等原核生物中，又相繼發(fā)現(xiàn)線形質粒。第三頁，共二十四頁，2022年，8月28日2.基因工程基因工程（geneticengineering）又稱基因拼接技術和DNA重組技術。所謂基因工程是在分子水平上對基因進行操作的復雜技術，是將外源基因通過體外重組后導入受體細胞內(nèi)，使這個基因能在受體細胞內(nèi)復制、轉錄、翻譯表達的操作。第四頁，共二十四頁，2022年，8月28日它是用人為的方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質——DNA大分子提取出來，在離體條件下用適當?shù)墓ぞ呙高M行切割后，把它與作為載體的DNA分子連接起來，然后與載體一起導入某一更易生長、繁殖的受體細胞中，以讓外源物質在其中“安家落戶”，進行正常的復制和表達，從而獲得新物種的一種嶄新技術。它克服了遠緣雜交的不親和障礙。第五頁，共二十四頁，2022年，8月28日溶液一50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-Cl10mmol/LEDTATris-ClTris-HCl緩沖液（0.05mol/L，25℃），中文別名：三（羥甲基）氨基甲烷；氨丁三醇；緩血酸銨；三羥甲基氨基甲烷；Tris，英文名稱：Tris(hydroxymethyl)aminomethane分子式：C4H11NO3分子量：121.14CAS號：77-86-1密度：1.353熔點：167-172℃沸點：219-220℃(10mmHg)閃點：100℃水溶性：550g/L(25℃)外觀：白色結晶水溶性：無色，澄清毒性：毒性低，可致癌，不要直接接觸皮膚。第六頁，共二十四頁，2022年，8月28日用途Tris緩沖液不僅被廣泛用作核酸和蛋白質的溶劑，還有許多重要用途。Tris被用于不同pH條件下的蛋白質晶體生長。Tris緩沖液的低離子強度特點可用于線蟲（C.elegans）核纖層蛋白（lamin）的中間纖維的形成。Tris也是蛋白質電泳緩沖液的主要成分之一，其在電泳緩沖液中與甘氨酸構成緩沖體系，穩(wěn)定電泳過程中的PH。此外，Tris還是制備表面活性劑、硫化促進劑和一些藥物的中間物。Tris也被用作滴定標準物。作為蛋白緩沖液時，若后續(xù)工作需要質譜，則不適宜用Tris，最好換成其他質譜儀可耐受的緩沖液。蘇寧易用途Tris緩沖液不僅被廣泛用作核酸和蛋白質的溶劑，還有許多重要用途。Tris被用于不同pH條件下的蛋白質晶體生長。Tris緩沖液的低離子強度特點可用于線蟲（C.elegans）核纖層蛋白（lamin）的中間纖維的形成。Tris也是蛋白質電泳緩沖液的主要成分之一，其在電泳緩沖液中與甘氨酸構成緩沖體系，穩(wěn)定電泳過程中的PH。此外，Tris還是制備表面活性劑、硫化促進劑和一些藥物的中間物。Tris也被用作滴定標準物。作為蛋白緩沖液時，若后續(xù)工作需要質譜，則不適宜用Tris，最好換成其他質譜儀可耐受的緩沖液。蘇寧易購寶寶知道拇指醫(yī)生百度知道首頁電腦版反饋詞條由網(wǎng)民創(chuàng)作并享有版權，請保護版權歸屬了解更多Tris-HCl用百度知道詞條目錄百科名片概述簡介用途第七頁，共二十四頁，2022年，8月28日EDTA溶液乙二胺四乙酸能與Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+等二價金屬離子結合的一種螯合劑。由于多數(shù)核酸酶類和有些蛋白酶類的作用需要Mg2+，故常用做核酸酶、蛋白酶的抑制劑；也可用于去除重金屬離子對酶的抑制作用。用途EDTA是一種重要的絡合劑。EDTA用途很廣，可用作彩色感光材料沖洗加工的漂白定影液，染色助劑，纖維處理助劑，化妝品添加劑，血液抗凝劑，洗滌劑，穩(wěn)定劑，合成橡膠聚合引發(fā)劑，EDTA是螯合劑的代表性物質。能和堿金屬、稀土元素和過渡金屬等形成穩(wěn)定的水溶性絡合物。第八頁，共二十四頁，2022年，8月28日第九頁，共二十四頁，2022年，8月28日溶液一的作用溶液Ⅰ50mM葡萄糖/10mMEDTA/25mMTris-HCl,pH=8.0葡萄糖增稠,使懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部；EDTA抑制DNase的活性.這一步溶液中還可以加入RNase,不受EDTA影響,并且可以在后續(xù)步驟中被除去第十頁，共二十四頁，2022年，8月28日溶液二200mmol/LNaOH1/100SDS(臨用前配置)第十一頁，共二十四頁，2022年，8月28日SDSSDS（全稱為sodiumdodecylsulfate,sodiumsalt）是一種化學品，中文名為十二烷基硫酸鈉。主要成分：純品外觀與性狀：白色粉末。理化熔點(℃)：204-207沸點(℃)：無資料相對密度(水=1)：1.09溶解性：溶于水，微溶于醇，不溶于氯仿、醚。主要用途：用作洗滌劑原料、印染工業(yè)的勻染劑、礦物的浮選劑。還可作為表面活性劑，起到助溶作用。第十二頁，共二十四頁，2022年，8月28日溶液三由醋酸以及鉀鹽所形成，前者在于中和堿性，后者有利于染色體DNA的沉淀。第十三頁，共二十四頁，2022年，8月28日實驗原理質粒是一種獨立于染色體DNA之外的能自主復制的雙鏈，閉合，環(huán)裝小分子的DNA，其大小范圍從1kb~200kb以上不等。廣泛存在于細胞中，在一些動，植物細胞中也發(fā)現(xiàn)有質粒的存在。目前提純質粒的方法比較多，如堿裂解法，煮沸法和SDS法等。最常用的是堿裂解法，其優(yōu)點為效率高，價廉簡單易學等。堿裂解分離質粒DNA是基于染色體DNA與變性與質粒DNA的復性的差異而達到分離的目的。在PH12.0~12.6的堿性環(huán)境中，宿主的染色體DNA變性（是氫鍵斷裂，破壞堿基配對），蛋白質變性。質粒DNA的堿基對也被破壞，閉環(huán)的DNA鏈處在纏繞狀態(tài)而不能彼此分開。加入乙酸鉀緩沖液中和后，PH調至中性，小分子的變性質粒DNA迅速復性為可溶狀態(tài)，而變性的染色體DNA因分子量巨大而難以復性，隨同高分子量RNA以及K+/SDS/蛋白質/膜復合物形成沉淀，故經(jīng)離心，即可將染色體DNA和質粒DNA分離。在實驗步驟中，加入溶解液1的目的主要是將細菌團塊重新懸浮于緩沖溶液中。溶液2含有SDS和NaOH，前者可將細菌溶解，后者可將DNA變性。溶液3由醋酸及鉀鹽所形成，前者在于中和堿性，后者則由于DNA的沉淀。加入溶液3后離心，大部分蛋白質和染色體DNA沉在下面，而上清液中所含的質粒DNA可繼續(xù)進行純化。純化質粒采用氯化鋰沉淀和聚乙二醇沉淀的方法。進一步用RNA酶消化可去除殘余的RNA。用酚：氯仿：異戊醇抽提可除去PEG和殘余的蛋白質。在經(jīng)乙醇沉淀和離心回收，即可得到高度純化的質粒DNA。制備的質粒DNA可用于酶切，連接，轉化，以及PCR等。第十四頁，共二十四頁，2022年，8月28日第十五頁，共二十四頁，2022年，8月28日質膜微囊通常直徑約50-100nm，富含膽固醇、鞘磷脂（sphingomyelin）和鞘糖脂（glycosphingolipids），并形成一個去垢劑不溶性的膜區(qū)域，以存在caveolin蛋白分子為特征。質膜微囊大量存在于內(nèi)皮細胞、脂肪細胞、血管平滑肌細胞、纖維母細胞和肺上皮細胞。隨著分子生物學研究的進展，發(fā)現(xiàn)質膜微囊參與許多細胞生命活動，例如細胞內(nèi)吞（endocytosis）、膽固醇運輸、細胞膜組裝、信號傳導和腫瘤生成，并參與許多致病性細菌和病毒的內(nèi)吞過程。第十六頁，共二十四頁，2022年，8月28日第十七頁，共二十四頁，2022年，8月28日基本方案1.堿裂解小量制備（最常用）恒溫搖床普通離心機臺式高速離心機漩渦振蕩器-20度冰箱三角燒瓶燒杯量筒刻度吸管制冰機Eppendorf管架Tip頭保溫瓶可調式移液器（0~20ul,0~200ul,20~1000ul）試管架紙巾或吸水紙2.試劑(1)溶液一：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-Cl(PH=8.0),10mmol/LEDTA(2)溶液二：200mmol/LNaOH,1/100SDS(臨用前配制)(3)溶液三：5mmol/L乙酸鉀，冰乙酸，水按6:1.15:2.85混合而成，所配溶液對鉀是3mol/L，對乙酸根是5mol/L(4)STE溶液：0.1mol/LNaCl,10mmol/LTris-Cl(PH=8.0),1mmol/LEDTA(5)TE緩沖液：10mmol/LTris-Cl(PH=8.0),1mmol/LEDTA(6)3mol/L乙酸鈉(PH5.2)(7)5mol/LiCl(8)1.6mol/LNaCl,13/100PEG：將3.9g聚乙二醇溶于20ml1.6mol/LNaCl中，再加1.6mol/LNaCl定容至30ml過濾除菌，置4攝氏度保存。(9)飽和酚(10)氯仿：異戊醇(24:1)

第十八頁，共二十四頁，2022年，8月28日(11)RNnaseA溶液(10mg/ml),無水乙醇，異丙醇(12)LB培養(yǎng)基(含100mlug/ml氨芐青霉素)：稱取胰蛋白胨5g，酵母提取物2.5g,NaCl5g,加雙蒸水400ml溶解，用5mol/LNaCl調至PH=7.4，定容至500ml，在103.4kpa下高壓滅菌20min3.細菌和質粒大腸桿菌JM103(pUC19),大腸桿菌JM103(pUC19-cTnI)第十九頁，共二十四頁，2022年，8月28日4.實驗步驟1.細菌繁殖：LB培養(yǎng)基，2ml/20ml，37℃，200rpm，搖一搖，過夜。

2.離心10min，5000rpm，4℃；棄上淸液。

3.沉淀（菌體細胞）預冷的TES緩沖液洗滌，離心10min，5000rpm，4℃，加入預冷的1mlSolutionI，冰浴10min。

4.重新懸浮，加入150ul溶菌酶母液，室溫放置5min。

5.加入1.2mlSolutionII，冰浴5min。

6.加入0.9ml預冷乙酸鉀，混勻，離心10min，12000rpm，4℃。

7.加入1.5ml異丙醇，-20℃冰箱內(nèi)放置15min。

8.離心10min，12000rpm，4℃。

9.取沉淀，懸于400ulTE緩沖液中。

第二十頁，共二十四頁，2022年，8月28日10.加入40ul，3MNaAc。

11.酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀。

12.離心10min，12000rpm，4℃。

13.取沉淀，冷凍干燥，再懸浮于50ulTE緩沖液中。

14.電泳檢測提取DNA的質量。第二十一頁，共二十四頁，2022年，8月28日二.質粒DNA的大量制備1.原理大量堿裂解方法不僅相當快捷可靠，而且可獲得相當純凈的粗制DNA，煮沸法的大量制備也簡單易行。但得到的DNA比較粗制，高純度的質粒DNA可通過氯化銫或溴化乙錠平衡離心法或層析法進一步純化，促使DNA得到。2材料含有氨芐青霉素或其他適當?shù)倪x擇性試劑的LB培養(yǎng)基或豐富培養(yǎng)基帶有質粒的大腸桿菌菌株。葡萄糖溶液/Tris/EDTA溶液卵清溶菌酶3mol/l的乙酸鉀溶液（PH約5.5）異丙醇70/100乙醇約20ml容量的高速離心管步驟1.往5ml的含選擇性試劑（通常是氨芐青霉素）的LB培養(yǎng)基或豐富培養(yǎng)基接種單菌落。于37攝氏度及劇烈震蕩培養(yǎng)過夜。2.往2L燒瓶加入500ml含有適當抗生素的LB培養(yǎng)基，然后將1ml過夜培養(yǎng)的大腸桿菌培養(yǎng)物，在與37攝氏度培養(yǎng)至飽和狀態(tài)第二十二頁，共二十四頁，2022年，8月28日注意：以提高產(chǎn)量，應采用表面積較大及帶折流板的燒瓶以增大通氣度，振搖速度大于400r/min3于4攝氏度，6kg離心10min4用4mlGTE重懸沉淀并轉移到一個容積大于等于20ml的高速離心管中5加入1ml新配的含25mg/ml溶菌酶的GTE溶液徹底重懸沉淀，于室溫放置10min注意：如果DNA要用層析法純化，加入5微克/