實驗二蛋白質(zhì)的等電點測定和沉淀反應(yīng)(精)

試驗二、蛋白質(zhì)

等電點測定及沉淀反應(yīng)一、試驗?zāi)康?、了解蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)2、學(xué)習(xí)測定蛋白質(zhì)等電點的一種方法3、加深對蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定因素的相識。4、了解沉淀蛋白質(zhì)的幾種方法及其好用意義。5、了解蛋白質(zhì)變性與沉淀的關(guān)系。二、試驗原理蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。在蛋白質(zhì)溶液中存在下列平衡：蛋白質(zhì)分子的解離狀態(tài)和解離程度受溶液的酸堿度影響。當(dāng)溶液的PH達(dá)到確定數(shù)值時，蛋白質(zhì)顆粒上正負(fù)電荷的數(shù)目相等，在電場中，蛋白質(zhì)既不向陰極移動，也不向陽極移動，此時溶液的pH值稱為此種蛋白質(zhì)的等電點。不同蛋白質(zhì)各有特異的等電點。在等電點時，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)都有變更，可利用此種性質(zhì)的變更測定各種蛋白質(zhì)的等電點。最常用的方法是測其溶解度最低時的溶液pH值。本試驗通過視察不同pH溶液中的溶解度以測定酪蛋白的等電點。用醋酸與醋酸鈉（醋酸鈉混合在酪蛋白溶液中）配制各種不同pH值的緩沖液。向諸緩沖溶液中加入酪蛋白后，沉淀出現(xiàn)最多的緩沖液的pH值即為酪蛋白的等電點。在水溶液中的蛋白質(zhì)分子由于表面生成水化層和雙電層而成為穩(wěn)定的親水膠體顆粒，在確定的理化因素影響下，蛋白質(zhì)顆粒可因失去電荷和脫水而沉淀。蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)可分為兩類?？赡娴某恋矸磻?yīng)此時蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)尚未發(fā)生顯著變更，除去引起沉淀的因素后，蛋白質(zhì)的沉淀仍能溶解于原來的溶劑中，并保持其自然性質(zhì)而不變性。如大多數(shù)蛋白質(zhì)的鹽析作用或在低溫下用乙醇（或丙酮）短時間作用于蛋白質(zhì)。提純蛋白質(zhì)時，常利用此類反應(yīng)。不行逆沉淀反應(yīng)

此時蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生重大變更，蛋白質(zhì)常變性而沉淀，不再溶于原來溶劑中。加熱引起的蛋白質(zhì)沉淀與凝固，蛋白質(zhì)與重金屬離子或某些有機(jī)酸的反應(yīng)都屬于此類。蛋白質(zhì)變性后，有時由于維持溶液穩(wěn)定的條件照舊存在（如電荷），并不析出。因此變性蛋白質(zhì)并不確定都表現(xiàn)為沉淀，而沉淀的蛋白質(zhì)也未必都已變性。三、試劑器材1、試驗材料：雞蛋清牛乳2、儀器設(shè)備：水浴鍋溫度計錐形瓶100mL容量瓶吸管試管及試管架

0.4%酪蛋白乙酸鈉溶液取0.4g酪蛋白，加少量水在乳缽中細(xì)致地研磨，將所得的蛋白質(zhì)懸膠液移入200mL錐形瓶內(nèi)，用少量40—50℃的溫水洗滌乳缽，將洗滌液也移入錐形瓶內(nèi)。加入10mL1mol/L醋酸鈉溶液。把錐形瓶放到50℃水浴中，并當(dāng)心地旋轉(zhuǎn)錐形瓶，直到酪蛋白完全溶解為止。將錐形瓶內(nèi)的溶液全部移到100mL容量瓶內(nèi)，加水至刻度，塞緊玻塞，混勻。3、試劑1.00mol/L醋酸溶液100mL0.10mol/L醋酸溶液300mL0.01mol/L醋酸溶液50mL蛋白質(zhì)溶液500mL5%卵清蛋白溶液或雞蛋清的水溶液（簇新雞蛋清：水=1:9）pH4.7醋酸-醋酸鈉的緩沖溶液；3%硝酸銀溶液；5%三氯乙酸溶液；95%乙醇；飽和硫酸銨溶液；硫酸銨結(jié)晶粉末；0.1M鹽酸溶液；0.1M氫氧化鈉溶液；0.05M碳酸鈉溶液；0.1M醋酸溶液；甲基紅溶液四、試驗操作（一）酪蛋白等電點的測定（1）取同樣規(guī)格的試管4支，按下表依次分別精確地加入各試劑，然后混勻。試管號蒸餾水mL0.01M醋酸mL0.1M醋酸mL1.0M醋酸mL18.40.6-—28.7-0.3—38.0-1.0—47.4--1.6（2）向以上試管中各加酪蛋白的醋酸鈉溶液1mL，加一管，搖勻一管。此時1、2、3、4管的pH依次為5.9、5.5、4.7、3.5。視察其混濁度。靜置10分鐘后，再視察其混濁度。最混濁（有顆粒沉淀）的一管pH即為酪蛋白的等電點。（二）蛋白質(zhì)沉淀試驗1．蛋白質(zhì)的鹽析：無機(jī)鹽（硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等）的濃溶液能析出蛋白質(zhì)。鹽的濃度不同，析出的蛋白質(zhì)也不同。如球蛋白可在半飽和硫酸銨溶液中析出，而清蛋白則在飽和硫酸銨溶液中才能析出。由鹽析獲得的蛋白質(zhì)沉淀，當(dāng)降低其鹽類濃度時，又能再溶解，故蛋白質(zhì)的鹽析作用是可逆過程。加5%卵清蛋白溶液5ml于試管中，再加等量的飽和硫酸銨溶液，混勻后靜置數(shù)分鐘則析出球蛋白的沉淀。倒出少量混濁沉淀，加少量水，視察是否溶解，為什么？將管中內(nèi)容物過濾，向濾液中添加硫酸銨粉末到不再溶解為止，此時析出的沉淀為清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸餾水，視察沉淀的再溶解。2．重金屬離子沉淀蛋白質(zhì)：重金屬離子與蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶于水的復(fù)合物。取1支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2ml，再加3%硝酸銀溶液1~2滴，振蕩試管，有沉淀產(chǎn)生。放置片刻，傾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？為什么？

3．有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)：取1支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2ml，再加1ml5%三氯乙酸溶液，振蕩試管，視察沉淀的生成。放置片刻，傾出上清液，向沉淀中加入少量水，視察沉淀是否溶解。4．有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)：取1支試管，加入2ml蛋白質(zhì)溶液，再加入2ml95%乙醇?；靹颍暡斐恋淼纳?。5．乙醇引起的變性與沉淀：

取3支試管，編號。依下表依次加入試劑：

試劑

mL

管號

5%卵清蛋白0.1M氫氧化鈉0.1M鹽酸95%乙醇

pH4.7緩沖液

111121113111振搖混勻后，視察各管有何變更。放置片刻，向各管內(nèi)加水8ml，然后在第2、3號管中各加一滴甲基紅，再分別用0.1M醋酸溶液及0.05M碳酸鈉溶液中和之。視察各管顏色的變更和沉淀的生成。每管再加0.1M鹽酸溶液數(shù)滴，視察沉淀的再溶解。說明各管發(fā)生的全部現(xiàn)象。五、試驗結(jié)果管號pH值混濁度解釋現(xiàn)象1234（一）蛋白質(zhì)等電點測定（二）蛋白質(zhì)的鹽析1．蛋白質(zhì)的鹽析現(xiàn)象解釋蛋白質(zhì)溶液中加硫酸銨溶液加水上清液中加硫酸銨粉末加水2．重金屬離子沉淀蛋白質(zhì)

現(xiàn)

象解

釋蛋白質(zhì)溶液中加硝酸銀

沉淀中加水

3．有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)

現(xiàn)

象解

釋蛋白質(zhì)溶液中加三氯乙酸

沉淀中加水

4．有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)現(xiàn)

象解

釋

5．乙醇引起的變性與沉淀