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文檔簡介

蛋白質(zhì)與生物大分子的相互作用研究基因的功能研究成為熱點,研究的對象即為基因編碼的產(chǎn)物—蛋白質(zhì),生物功能的主要體現(xiàn)者和執(zhí)行者。在所有生命活動中,細(xì)胞接受外源或是內(nèi)源的信號,通過其特有的信號途徑,調(diào)節(jié)其基因的表達(dá),以保持其生物學(xué)特性,這其中必須涉及蛋白與蛋白、核酸的相互作用。掌握或發(fā)明研究相互作用的方法非常重要。nucleus

cytoplasm

主要內(nèi)容免疫共沉淀(Co-IP):蛋白—蛋白,蛋白—DNAPulldown(親和層析):蛋白—蛋白,蛋白—DNA/RNA電泳遷移實驗(EMSA):蛋白—DNA/RNA酵母雙雜交系統(tǒng):蛋白—(X)—蛋白用途:鑒定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合,結(jié)合位點分析;篩選一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。原理:當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時,完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)x的抗體免疫沉淀x,那么與x在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)y也能沉淀下來。一、免疫共沉淀(invivo)Co-Immunoprecipitation,Co-IPCo-IP工作原理示意圖Co-immunoprecipitationbindingwashelutionYYYYYWesternblot鑒定PAGE質(zhì)譜細(xì)菌蛋白質(zhì)的“proteinA”可特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的Fc片段Co-IP鑒定蛋白相互作用實驗注意事項

細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件(NP40、Triton-X100等);每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的,通過經(jīng)驗確定。確保共沉淀的蛋白是由所加入的特異性抗體沉淀得到的,而并非其他非特異蛋白:

1、使用單克隆抗體:多抗?

2、使用對照抗體:(1)單克隆抗體:正常小鼠IgG或另一類單抗(2)兔多克隆抗體:正常兔IgG。StructuralbasisofGprotein–coupledreceptor–Gproteininteractions。Nature

Chem

Biol,2010,6:541-548(分析蛋白相互作用的位點)大鼠G蛋白耦聯(lián)受體M3RG蛋白α(綠色)β(藍(lán)色)γ(紫色)亞基G蛋白藕聯(lián)受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)示意圖將不同變異體的表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入cos-7細(xì)胞中,單獨轉(zhuǎn)染的為對照;左圖為IP前的IB,右圖為IP后的IB,二者復(fù)合物為80kD(陽性結(jié)果)。圖為兩次獨立實驗的其中一次。TAK-242(Resatorvid),aSmallMoleculeInhibitorofToll-LikeReceptor(TLR)4Signaling,

BindsSelectivelytoTLR4andInterfereswithInteractionsbetweenTLR4andItsAdaptorMolecules.MolPharmacol,2011,79:34-41(鑒定)分析靶蛋白與小分子化合物的作用:TheimmunoprecipitateswereseparatedusingSDSimmunoblottingwithanti-FLAGM2mAboranti-HAtag

mAb.analyzedusingautoradiography.TRAM分析小分子化合物對蛋白相互作用的干擾ScreeningofClpEinteractionproteinsConstructrecombinantplasmidpAE03-ClpEandtransformintoS.pneumoniae

D39WesternblotforidentificationCo-Immunoprecipitation(Co-IP)transfer1ml(OD600=0.5-0.6)clearedlysateofD39andD39-ClpE-GFPtoa10mlbeakerseparately.Add500μlproteinG-agarosebeads(GE),incubatefor3hat4°Conarotatingapparatuswithmagneticstirrertoremovenon-specificallyboundproteins.Add800μlproteinG-agarosebeadsand20–25μgGFPantibody(Clontech)tothesupernatant.Incubateovernightat4°Conarotatingapparatus.Washbeadsfivetimeswith1mlPBSfor2mineachwash.Resuspendpelletin50-80μl2×SDSsamplebuffer.Load10–15μlofsupernatantonanSDS/polyacrylamidegel.D39-ClpE-GFPClpPIB:GFPIB:ClpEMarkerD39-ClpE-GFPD39D39D39-ClpE-GFPClpP97.2kD優(yōu)點:相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的,處于天然狀態(tài);蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的,可以避免人為的影響。難點:需要高質(zhì)量的抗體進(jìn)行IP;兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合,而可能有第三者在中間起橋梁作用;檢測不到弱或瞬時的相互作用。應(yīng)用:分析與蛋白質(zhì)相互作用的DNA序列信息染色質(zhì)免疫共沉淀(ChromatinImmuno-precipitation,ChIP)Chip-seq技術(shù)可獲得數(shù)百萬條序列標(biāo)簽,并能把所關(guān)注的蛋白的DNA結(jié)合位點精確定位到基因組上。華大基因、上海生物芯片有限、上??党缮镉邢薰镜菺enome-WideMappingofinVivoProtein-DNA

Interactions.Science,2007,316(5830):1497-1502Johnson等利用ChIP-seq

對轉(zhuǎn)錄因子NRSF(神經(jīng)元限制性沉默因子)在DNA上的結(jié)合位點進(jìn)行了全基因組的篩查:結(jié)果:獲得了1946個結(jié)合位點;結(jié)合位點的最小能分辨為50bp。獲得的經(jīng)典與非經(jīng)典的神經(jīng)限制性沉默元件(NRSE)序列。高質(zhì)量的ChIP-seq結(jié)果提供了研究新的DNA-蛋白相互作用的內(nèi)容,發(fā)現(xiàn)其為胰島發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要轉(zhuǎn)錄因子。ZBED6,aNovelTranscriptionFactorDerivedfromaDomesticatedDNATransposonRegulatesIGF2ExpressionandMuscleGrowth.

PLoSBiology,2009,7(12):1-13EllenMarkljung等發(fā)現(xiàn)抑制家豬IGF2基因表達(dá)的因子是ZBED6蛋白;進(jìn)一步用Chip-seq研究ZBED6蛋白的作用靶點。ZBED6蛋白的1200個作用靶點起著發(fā)育、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞分化等作用。二、Pull-down實驗(invitro)用途:

1.鑒定兩個已知蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用

2.篩選與已知融合蛋白相互作用的未知蛋白質(zhì)原理:利用GST、HIS等標(biāo)簽蛋白將一種蛋白質(zhì)(誘餌蛋白)固定于某種基質(zhì)上(如Sepharose),當(dāng)細(xì)胞抽提液經(jīng)過該基質(zhì)時,可與該固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附,通過改變洗脫液或洗脫條件即可回收所吸附的蛋白。

洗脫(2)結(jié)合(3)檢測(6)收集(5)洗脫(4)固定誘餌蛋白(1)ThePolymericImmunoglobulinReceptor

Translocates

PneumococciacrossHumanNasopharyngealEpithelialCells.

Cell,2000,102:827–837(篩選、鑒定)polymericimmunoglobulinreceptor(pIgR)CbpA

ThehpIgR-mediatedbacterialadherenceandinvasionwereabolishedbyeitherinsertionalknockoutofcbpA

orantibodiesagainsteitherhpIgRorCbpA.methods蛋白表達(dá):ExpressionofCbpAPolypeptides(6×His)Pull-down:AffinityPurificationoftheCbpABindingProteins蛋白鑒定:ProteinsinthefractionswereanalyzedbySDSandIB,andN-TerminalSequencingoftheCbpABindingProteinsrCbpACovalentlyconjugated

to1mlofAffi-Gel15(BioRad)in0.1MMOPS(pH7.5)at4℃;Thecolumnwassequentiallywashedwithwashingbuffer;DetroitcellssurfaceproteinswerelabeledwithSulfo-NHS-LC-biotin;Celllysateswerepreparedinabuffercontainingproteaseinhibitors;Cellulardebriswasremovedbycentrifugationat4℃,Thesupernatantwas

recycledthroughtheCbpA1-affinitycolumnfor4hat4℃;washthecolumnwithwashingbuffer;theboundproteinswereelutedin300mlfractionswith100mMglycine-HCl(pH2.5)。Pulldown篩選CbpA在A549上的受體:

Lane1CbpA-GST表達(dá)全菌,Lane2A549細(xì)胞膜蛋白溶解液,Lane3Pulldown純化大柱穿透液,Lane4Pulldownspincolumun柱穿透液1,Lane5Pulldownspincolumun柱穿透液2,Lane6pulldown篩檢結(jié)果,Lane7pulldown陰性對照結(jié)果.類均相Pull-down鑒定hplgR與CbpA結(jié)合的區(qū)段及是否需要糖基化

rCbpAwereimmobilizedoncarboxylatedlatexbeads.LatexbeadscoatedwithCbpApolypeptideswereresuspendedin100μlofPBS/Mg2+/Ca2+and0.1%TritonX-100,andmixedwith100μlofhSC(plgR胞外部分).Unboundproteinswereremovedbyextensivewashingbuffer.ThebeadswerethenresuspendedinSDSloadingbuffertosolubilizeboundproteins.ProteinswereseparatedinSDSgelsanddetectedbyIB.CbpA與hplgR結(jié)合區(qū)段的鑒定

Vncs為S.pn的另一種膜蛋白,hSC為表達(dá)hplgR的MDCK細(xì)胞,Neo為不表達(dá)hplgR的MDCK細(xì)胞。Pull-down的優(yōu)缺點優(yōu)點:靈敏、周期短不需要構(gòu)建基因文庫抗體質(zhì)量要求不高可鑒定直接相互作用缺點:需要純化的蛋白體外相互作用(假陽性、假陰性)DNA/RNA

Pull-down實驗應(yīng)用:主要用于篩選、鑒定與目的DNA或RNA片段相互作用的蛋白質(zhì)(轉(zhuǎn)錄因子、翻譯調(diào)控因子類)方法:與蛋白相互作用的Pull-down類似,只是固定于色譜柱或磁珠上的為標(biāo)記的DNA或RNA片段,其他步驟一樣。優(yōu)缺點:相較于酵母單/三雜交,其無需構(gòu)建基因文庫、操作較簡便、周期短。缺點與蛋白Pull-down一樣。AsubsetofreplicationproteinsenhancesoriginrecognitionandlyticreplicationbytheEBvirusZEBRAprotein.PLoS

Pathog.2010,6(8)InvivoDNApulldown共孵育:BZKOcellsweretransfectedwithexpressionvectorsfortheindicatedformsofZEBRAtogetherwithBiotinylated

oligomerscontainingoneof3regulatoryregions.Pulldown:TheBiotinylatedprobeswerepurifiedfromcelllysatesusingavidinbeads.IB:TheamountofZEBRAboundtoeachprobeandthetotalamountofZEBRApresentineachlysatewereassessedbywesternblotanalysis.檢測DNA結(jié)合的蛋白量A:upstreamregionoforiLyt[BUR]B:ashortregionofRp[BRpS]C:fulllengthRp[BRpL]Chip檢測(蛋白結(jié)合的DNA量)

又叫凝膠阻滯實驗(Gelretardationassay)或DNA遷移率變動實驗(DNAmobilityshiftassay)。是在80年代初期出現(xiàn)的用于在體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。它具有簡單、快捷等優(yōu)點,是當(dāng)前被選作鑒定特定DNA或RNA結(jié)合蛋白質(zhì)的一種典型的實驗方法。原理:DNA/RNA分子與蛋白的結(jié)合導(dǎo)致了電泳時遷移率的降低。三、電泳遷移實驗ElectrophoreticMobilityShiftAssay,EMSA)

凝膠阻滯實驗的基本原理圖標(biāo)記的DNA片段由于與蛋白質(zhì)B結(jié)合,在凝膠電泳中移動速度變慢,因而呈現(xiàn)滯后的條帶。ACB顯影或顯色****凝膠電泳標(biāo)記的DNA片段細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合******BDNA-蛋白質(zhì)結(jié)合物電泳遷移緩慢滯后帶表明DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合(a)(b)

(c)在凝膠阻滯實驗中競爭DNA與探針DNA之間的競爭作用(a)沒有加入競爭DNA的正常的凝膠阻滯實驗,探針DNA與特異蛋白質(zhì)結(jié)合,出現(xiàn)阻滯條帶;(b)加入的超量競爭DNA與探針DNA競爭結(jié)合同一種蛋白質(zhì),阻滯條帶消失;(c)競爭DNA為其它序列,與探針DNA分別結(jié)合不同的蛋白質(zhì),則出現(xiàn)同(a)一樣的阻滯條帶。**********蛋白質(zhì)與未標(biāo)記的競爭DNA結(jié)合凝膠電泳顯影或顯色蛋白質(zhì)不與非標(biāo)記DNA結(jié)合**********RoleofAdaptorTRIFintheMyD88-IndependentToll-LikeReceptorSignalingPathway.MasahiroYamamoto,etal.Science301,640(2003);C:50g/mlpoly(I:C)fortheindicatedperiods.Nuclearextractswereprepared,andNF-kBDNAbindingactivitywasdeterminedbyelectrophoreticmobilityshiftassay(EMSA)usinganNF-B–specificprobe.poly(I:C),建立的基礎(chǔ):真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子:DNA結(jié)合域:DNAbindingdomain,BD轉(zhuǎn)錄激活域:Activationdomain,AD四、酵母雙雜交系統(tǒng)

yeasttwo-hybridsystem酵母雙雜交技術(shù)的原理酵母雙雜交原理圖UASLacZ/His報告基因表達(dá)X外源基因

BDGAL4BD外源基因GAL4ADADBD質(zhì)粒AD質(zhì)粒表達(dá)表達(dá)融合蛋白融合蛋白Y

BDXYADYADRNA多聚酶

BDX酵母雙雜交系統(tǒng)的組成與BD融合的蛋白表達(dá)載體,表達(dá)的蛋白稱誘餌蛋白(bait)與AD融合的蛋白表達(dá)載體,表達(dá)的蛋白稱靶蛋白(prey或target)帶報告基因(reportgene)的宿主細(xì)胞baittargettargetbait酵母雙雜交技術(shù)的應(yīng)用篩選、鑒定蛋白間的相互作用:驗證預(yù)測的蛋白間相互作用、鑒定突變對蛋白與蛋白結(jié)合的影響、篩選蛋白的級聯(lián)底物。篩選、鑒定小分子與蛋白質(zhì)之間的相互作用:鑒定干擾相互作用的分子、篩選藥物作用位點及藥物對蛋白相互作用影響。篩選、鑒定核酸與蛋白質(zhì)之間的相互作用:尋找靶序列的結(jié)合蛋白(轉(zhuǎn)錄因子)。酵母雙雜交技術(shù)的特點優(yōu)點:不需要抗體;可直接得到相互作用蛋白的核酸序列;胞內(nèi)實驗。缺點:篩選工作需要構(gòu)建基因文庫。假陽性結(jié)果比例較高。雙報告基因三報告基因例:用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與NifA(巴西固氮螺菌)相互作用的蛋白質(zhì)??茖W(xué)通報,2005,50(6):540-545采用的酵母雙雜交系統(tǒng):酵母細(xì)胞:S.cerevisiaePJ69-4A(clontech公司) 含有3個報告基因:ade2、his3和lacZ,其中ade2基因表達(dá)最為嚴(yán)謹(jǐn),his3和lacZ的表達(dá)相對松弛。兩個載體pGBD(誘餌)和pGAD(靶蛋白)分別含報告基因trp和leu。實驗步驟:含nifA的誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

將重組質(zhì)粒pGBD-nifA轉(zhuǎn)入釀酒酵母PJ69-4A中,鋪于SD/-Trp,SD/-Trp/-Ade,SD/-Trp/-His+3-AT及SD/-Trp+X-Gal+BU平板上,30℃培養(yǎng)2~5d.

pGBD-nifA轉(zhuǎn)化子在SD/-Trp和SD/-Trp+X-Gal+BU平板上有正常的菌落長出,但在X-Gal存在下不呈現(xiàn)藍(lán)色,而在SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His+3-AT平板上沒有菌落長出,延長培養(yǎng)時間,仍然呈陰性結(jié)果.這說明誘餌質(zhì)粒pGBD-nifA不能自動激活報告基因的表達(dá),對宿主菌也沒有毒性作用,因此pGBD-nifA可以用作誘餌質(zhì)粒.

巴西固氮螺菌Sp7基因文庫的構(gòu)建提取巴西固氮螺菌Sp7的染色體DNA,用Sau3AⅠ酶切后回收0.5~3kb的DNA片段;然后與經(jīng)BamHⅠ酶切的3個酵母雙雜合系統(tǒng)的質(zhì)粒載體pGAD1-C1,pGAD-C2及pGAD-C3分別進(jìn)行連接(以確保外源片段的正確閱讀),則構(gòu)建成3個質(zhì)粒文庫,分別命名為YSPC1,YSCP2和YSCP3。

巴西固氮螺菌Sp7基因文庫的篩選和陽性克隆的鑒定共轉(zhuǎn)化:將基因組文庫YSPC1,YSPC2和YSPC3分別與誘餌質(zhì)粒pGBD-nifA共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞,從YSPC1,YSPC2和YSPC3三個基因組文庫中共分別得到1.4×106,3×105和3.5×105個共轉(zhuǎn)化子.篩選陽性克?。菏紫葘⑥D(zhuǎn)化產(chǎn)物鋪于SD/-Leu/-Trp/-Ade選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選,3個文庫轉(zhuǎn)化物中共有168個菌落表現(xiàn)為Ade+;再將Ade+菌落挑出點種于SD/-Trp/-Leu+X-Gal+BU,SD/-Trp/-Leu/-His和SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His這3種不同的平板上進(jìn)行篩選.最后,從3個文庫中篩選到對3個報告基因ade2,his3和lacZ均能激活的陽性克隆109個。單倍體酵母的接合酵

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