紫外-可見光分光光度法

紫外-可見光分光光度法第一頁，共七十七頁，2022年，8月28日4.1.1方法的特點(diǎn)

1.靈敏度高

通常，待測(cè)物質(zhì)的含量1～10－5％時(shí)，能夠用分光光度法準(zhǔn)確測(cè)定。所以它主要用于測(cè)定微量組分。

2.應(yīng)用廣泛

幾乎所有的無機(jī)離子和許多有機(jī)化合物可以用分光光度法進(jìn)行測(cè)定。如土壤中的氮、磷以及植物灰、動(dòng)物體液中各種微量元素的測(cè)定。

第二頁，共七十七頁，2022年，8月28日3.操作簡(jiǎn)便、迅速、儀器設(shè)備不太復(fù)雜

若采用靈敏度高、選擇性好的有機(jī)顯色劑，并加入適當(dāng)?shù)难诒蝿?，一般不?jīng)過分離即可直接進(jìn)行分光光度法測(cè)定、其方法的相對(duì)誤差通常為5～10％，其準(zhǔn)確度雖不及重量分析法和容量法，但對(duì)于微量組分的測(cè)定，結(jié)果還是滿意的。第三頁，共七十七頁，2022年，8月28日4.2.1顏色的產(chǎn)生4.2吸光光度法的基本原理第四頁，共七十七頁，2022年，8月28日4.2.2電磁波和能量第五頁，共七十七頁，2022年，8月28日第六頁，共七十七頁，2022年，8月28日

光的波長λ(cm)、頻率(Hz)，它們與光速c的關(guān)系是：4.2.3光的基本性質(zhì)

在真空介質(zhì)中，光速為2.9979×1010cm/s。單個(gè)光子的能量E與上述三要素的關(guān)系是：E－－光子的能量，J；h－－普朗克常數(shù)（6.625×10－34J·s）第七頁，共七十七頁，2022年，8月28日4.2.4溶液顏色與光吸收的關(guān)系

光波是一種電磁波。電磁波包括無線電波、微波。紅外光、可見光、紫外光、x射線等。如果按照其頻率或波長的的大小排列，可見光只是電磁波中一個(gè)很小的波段。見表12－1第八頁，共七十七頁，2022年，8月28日第九頁，共七十七頁，2022年，8月28日

有色物質(zhì)的不同顏色是由于吸收了不同波長的光所致。溶液能選擇性地吸收某些波長的光，而讓其他波長的光透過，這時(shí)溶液呈現(xiàn)出透過光的顏色。透過光的顏色是溶液吸收光的互補(bǔ)色。有色溶液對(duì)各種波長的光的吸收情況，常用光吸收曲線來描述。將不同波長的單色光依次通過一定的有色溶液，分別測(cè)出對(duì)各種波長的光的吸收程度（用字母A表示）。以波長為橫坐標(biāo)，吸光程度為縱坐標(biāo)作圖，所得的曲線稱為吸收曲線或吸收光譜曲線。第十頁，共七十七頁，2022年，8月28日能復(fù)合成白光的兩種顏色的光叫互補(bǔ)色光。物質(zhì)所顯示的顏色是吸收光的互補(bǔ)色。第十一頁，共七十七頁，2022年，8月28日KMnO4的顏色及吸收光譜第十二頁，共七十七頁，2022年，8月28日葉綠素的結(jié)構(gòu)和吸收光譜第十三頁，共七十七頁，2022年，8月28日一個(gè)新配合物的吸收

光譜第十四頁，共七十七頁，2022年，8月28日4.3光吸收基本定律

當(dāng)一束平行的單色光照射均勻的有色溶液時(shí)，光的一部分被吸收，一部分透過溶液，一部分被比色皿的表面反射。如果人射光的強(qiáng)度為I0，吸收光的強(qiáng)度為Ia，透過光的強(qiáng)度為It，反射光的強(qiáng)度為Ir，則:

I0＝Ia＋I(xiàn)t＋I(xiàn)r

在吸光光度法中，由于采用同樣質(zhì)料的比色皿進(jìn)行測(cè)量，反射光的強(qiáng)度基本上相同，其影響可以相互抵消，上式可簡(jiǎn)化為:

I0＝Ia＋I(xiàn)t

第十五頁，共七十七頁，2022年，8月28日

透過光的強(qiáng)度It；與入射光的強(qiáng)度Io比之比稱為透光度或透光率，用T表示。

T＝It/Io一束單色光通過溶液后，由于溶液吸收了一部分光能，光的強(qiáng)度就要減弱。若溶液的濃度不變，液層越厚，透過光的強(qiáng)度越小，光線減弱的程度越大。如果將液層分成許多無限小的相等的薄層，其厚度為db。則dI應(yīng)與db及I成正比，即－dI∝Idb，從而，－dI/I=k1db，積分此式，得：動(dòng)畫1.朗伯定律第十六頁，共七十七頁，2022年，8月28日將上式變成常用對(duì)數(shù)，得上式稱為朗伯定律。如用A=lg(I0/It)或lg(1/T),則A稱為吸光度。第十七頁，共七十七頁，2022年，8月28日

例1.有一單色光通過厚度為1cm的有色溶液,其強(qiáng)度減弱20%。若通過5cm厚度的相同溶液,其強(qiáng)度減弱百分之幾?

解：lgT1

c1

─────=───,lgT25c1

lgT2=5lgT1=5×lg0.80=-0.485

T2=32.7%,即減弱67.3%第十八頁，共七十七頁，2022年，8月28日

當(dāng)一束單色光通過液層厚度一定的溶液時(shí)，溶液的濃度愈大，光線強(qiáng)度減弱愈顯著。若有色溶液的濃度增加dc，入射光通過溶液后，強(qiáng)度的減弱-dI與人射光強(qiáng)度I及dc成正比，即

-dI=k3Idc，或-dI/I=k3dc，積分，可得到:通常稱比耳定律。動(dòng)畫2.比耳定律第十九頁，共七十七頁，2022年，8月28日

例2.一符合比爾定律的有色溶液，當(dāng)濃度為c時(shí)，透射比為T，若其它條件不變，濃度為c/3時(shí)，T為_________，濃度為2c時(shí)，T為__________。解:

T1/3

T2

這說明濃度與透射比T

的是指數(shù)關(guān)系。第二十頁，共七十七頁，2022年，8月28日3．朗伯一比耳定律

如果溶液濃度和液層厚度都是可的，就要同時(shí)考慮溶液濃度c和液層厚度b對(duì)吸光度的影響。為此，將朗伯和比耳公式和合并，得到即通常所稱的朗伯一比耳定律。第二十一頁，共七十七頁，2022年，8月28日4．吸光系數(shù)、摩爾吸光系數(shù)和桑德爾靈敏度

在朗伯-比耳公式，k值決定于c，b所用的單位，它與入射光的波長及溶液的性質(zhì)有關(guān)。當(dāng)濃度c以g·L-1、液層厚度b以cm表示時(shí)，常數(shù)k是以a表示，此時(shí)稱為吸光系數(shù)，單位為L·g-1·cm-1。朗伯－比耳公式可表示為:

A＝abc

若b以cm為單位，c以mol·L-1為單位時(shí)，則將k稱為摩爾吸光系數(shù)，以符號(hào)ε表示，其單位為L·mol-1cm-1。ε的物理意義表達(dá)了當(dāng)吸光物質(zhì)的濃度為1mol·L-1，液層厚度為1cm時(shí)溶液的吸光度。在這種條件下上式可改寫為:A=εbc第二十二頁，共七十七頁，2022年，8月28日

摩爾吸光系數(shù)是有色化合物的重要特性。ε

愈大，表示該物質(zhì)對(duì)某波長的光吸收能力愈強(qiáng)，因而光度測(cè)定的靈敏度就越高。ε的值，不能直接取1mol/L這樣高濃度的有色溶液來測(cè)量，而只能通過計(jì)算求得。由于溶液中吸光物質(zhì)的濃度常因離解、聚合等因素而改變。因此，計(jì)算ε

時(shí)，必須知道溶液中吸光物質(zhì)的真正濃度。但通常在實(shí)際工作中，多以被測(cè)物質(zhì)的總濃度計(jì)算，這樣計(jì)算出的ε

值稱為表觀摩爾吸光系數(shù)。文獻(xiàn)中所報(bào)道的ε

值就是表觀摩爾吸光系數(shù)值。第二十三頁，共七十七頁，2022年，8月28日桑德爾（Sandell)靈敏度

桑德爾靈敏度又叫桑德爾指數(shù)，用S表示。在分光光度分析中常常使用。桑德爾靈敏度規(guī)定儀器的檢測(cè)極限為A=0.001時(shí)，單位截面積光程內(nèi)所能檢測(cè)出被測(cè)物質(zhì)的最低含量，以μg/cm2表示。S與ε的關(guān)系可如下推導(dǎo)：A=0.001=bcε，即

cb=0.001/ε

c為mol/1000cm3;b為cm,故cb為單位截面積光程內(nèi)的物質(zhì)量，即mol/1000cm2。如果cb乘以被測(cè)物質(zhì)的摩爾質(zhì)量M，就是單位截面積光程內(nèi)被測(cè)物質(zhì)的質(zhì)量，即為S，所以,S=cb/1000×M×106=cbM×103μg/cm2，代入cb后,

第二十四頁，共七十七頁，2022年，8月28日5.偏離朗伯－比耳定律的原因

朗伯－比耳定律是吸光光度分析的理論基礎(chǔ)、在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，通常是使液層厚度保持不變，然后測(cè)定一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，根據(jù)A=kbc=k’c關(guān)系式，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，應(yīng)得到一通過原點(diǎn)的直線，稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線或工作曲線。但是，在實(shí)際工作中，當(dāng)有色溶液的濃度較高時(shí)，往往不成直線，這種現(xiàn)象稱為偏離朗伯－比耳定律。見圖12－8，第二十五頁，共七十七頁，2022年，8月28日

引起偏離朗伯－耳定律的原因主要有以下幾個(gè)方面：

(1).由于入射光不是單色光而引起的偏離

朗伯－比耳定律只適用于單色光。但實(shí)際上單波長的光不能得到。目前各種方法所得到的入射光是具有一定波長范圍的波帶，而非單色光。因而發(fā)生偏離朗伯一比耳定律的現(xiàn)象。單色光的純度愈差，吸光物質(zhì)的濃度愈高，偏離朗伯-比耳定律的程度愈嚴(yán)重。在實(shí)際工作中，若使用精度較高的分光光度計(jì)，可獲得較純的單色光。

(2).由于介質(zhì)的不均勻性引起的偏離

當(dāng)被測(cè)溶液是膠體溶液、懸濁液或乳濁液時(shí)，入射光通過溶液后除一部分被吸收外，還有一部分因溶液中存在微粒的散射作用而損失，并使透光度減小。而當(dāng)膠體或其他微粒凝聚沉淀時(shí)，又會(huì)使溶液吸光度下降。第二十六頁，共七十七頁，2022年，8月28日(3).溶液中的化學(xué)變化引起的偏離

溶液中的化學(xué)變化如締合、離解、溶劑化、形成新的化合物、互變異構(gòu)等，使吸光度不隨溶液濃度而成正比地改變，而導(dǎo)致偏離朗伯－比耳定律。

例如，重鉛酸鉀在弱酸性介質(zhì)中有如下平衡：

Cr2O72-+H2O2HCrO4-

在450nm波長處測(cè)量不同濃度重鉻酸鉀溶液的吸光度。由于在濃度低時(shí)重鉻酸根的離解度大，而濃度高時(shí)離解度小，同時(shí)由于鉻酸氫根離子（HCrO4-）的摩爾吸光系數(shù)比重鉻酸根離子的摩爾吸光系數(shù)要小得多，因此低濃度時(shí)重鉻酸根離子的吸光度降低十分顯著，這就使工作曲線偏離朗伯和耳定律。第二十七頁，共七十七頁，2022年，8月28日4.4光度分析的方法和儀器4.4.1光度分析的方法

1.目視比色法 用眼睛觀察、比較溶液顏色深度以確定物質(zhì)含量的方法稱為目視比色法。將一系列不同量的標(biāo)準(zhǔn)溶液依次加入各比色管中，再分別加入等量的顯色劑和其他試劑，并控制其他實(shí)驗(yàn)條件相同，最后稀釋至同樣體積，配成一套顏色逐漸加深的標(biāo)準(zhǔn)色階。將一定量的被測(cè)溶液置于另一比色管中，在同樣條件下進(jìn)行顯色，并稀釋至同樣體積，從管口垂直向下（有時(shí)由側(cè)面）觀察顏色。如果被測(cè)溶液與標(biāo)準(zhǔn)系列中某溶液的顏色相同，則被測(cè)溶液的濃度就等于該標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度。如果被測(cè)試液濃度介于相鄰兩種標(biāo)準(zhǔn)溶液之間，則試液的濃度就介于這兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間。第二十八頁，共七十七頁，2022年，8月28日2．標(biāo)準(zhǔn)曲線法

根據(jù)朗伯－比耳定律，保持液層厚度，入射光波長和其它測(cè)量條件也不變，則在一定濃度范圍內(nèi)，所測(cè)得吸光度與溶液中待測(cè)物質(zhì)的濃度成正比。因此，配制一系列已知的具有不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在選定波長處測(cè)其吸光度A，然后以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度c為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制出A－c關(guān)系曲線。如果符合光的吸收定律，則可獲得一條直線，稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線或稱工作曲線。在相同條件下測(cè)量樣品溶液的吸光度，就可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的濃度。Ac標(biāo)準(zhǔn)工作曲線動(dòng)畫第二十九頁，共七十七頁，2022年，8月28日3.加入標(biāo)準(zhǔn)法

所謂的加入標(biāo)準(zhǔn)法，即在一定濃度的試樣溶液測(cè)定吸光度A0后，加入合適濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再測(cè)吸光度A1，或再加幾次標(biāo)準(zhǔn)溶液，得A2,A3…吸光度，計(jì)算或作圖外推求試樣濃度的方法。即：

A0=kC樣；A1=k(C樣＋C標(biāo)）設(shè)試樣體積為V0;加入的標(biāo)準(zhǔn)溶液體積為V標(biāo)，則：A1=k(C樣V0+C標(biāo)V標(biāo))/(V0+V標(biāo)），聯(lián)解方程可求出C樣?；蛴肁對(duì)C標(biāo)作圖，外推求出C樣。第三十頁，共七十七頁，2022年，8月28日4.二元混合組分的測(cè)定

混合溶液里兩組分的測(cè)定有如圖12－5的三種情況：

（a）若1和2兩組分的最大吸收峰互不重合，而且在1組分的最大吸收波長λ1處，2組分沒有吸收；或在2組分的最大吸收波長λ2處，1組分無吸收。這樣比較簡(jiǎn)單，按單組分測(cè)定方法測(cè)1和2兩組分即可。（b）若1和2組分在混合溶液中的吸光光譜曲線如圖12－5(b)所示，則當(dāng)1和二混合在一起時(shí)，在1組分的最大吸收波長處，2組分無吸收，所以只需在λ1處測(cè)定1組分。但在λ2處所測(cè)定吸光度是1和2的總吸收，因此必須事先測(cè)得1組分在λ2的ε，先從λ1出1組分，再從疊加處得的和量中減去組分1。

第三十一頁，共七十七頁，2022年，8月28日

(c)這種情況比較復(fù)雜，要解一個(gè)一元二次方程。第三十二頁，共七十七頁，2022年，8月28日第三十三頁，共七十七頁，2022年，8月28日5.三元絡(luò)合物的應(yīng)用

所謂的三元絡(luò)合物是指由三個(gè)組分所形成的絡(luò)合物。目的是提高靈敏度和選擇性。例：[Co(H2O)3(NH3)3]2+

淡紅色

[Co(H2O)2(NH3)4]2+

暗紅色

[Co(H2O)(NH3)5]2+

紅色

[Co(NH3)6]2+

黃色第三十四頁，共七十七頁，2022年，8月28日4.4.2分光光度計(jì)第三十五頁，共七十七頁，2022年，8月28日停留分光光度計(jì)第三十六頁，共七十七頁，2022年，8月28日A原理第三十七頁，共七十七頁，2022年，8月28日第三十八頁，共七十七頁，2022年，8月28日光柵和棱鏡分光原理光柵分光動(dòng)畫棱鏡分光動(dòng)畫第三十九頁，共七十七頁，2022年，8月28日儀器光通路圖第四十頁，共七十七頁，2022年，8月28日B.分光光度計(jì)的類型動(dòng)畫第四十一頁，共七十七頁，2022年，8月28日雙光束光度計(jì)動(dòng)畫示意動(dòng)畫第四十二頁，共七十七頁，2022年，8月28日雙波長光度計(jì)光路示意圖動(dòng)畫第四十三頁，共七十七頁，2022年，8月28日C.光電轉(zhuǎn)換器

I.定義光電轉(zhuǎn)換器是將光輻射轉(zhuǎn)化為可以測(cè)量的電信號(hào)的器件。

S=kP+kd=kP

k:校正靈敏度；P：輻射功率；kd:暗電流（可通過線路補(bǔ)償，使為0）II.理想的光電轉(zhuǎn)換器要求靈敏度高；S/N大；暗電流??；響應(yīng)快且在寬的波段內(nèi)響應(yīng)恒定。第四十四頁，共七十七頁，2022年，8月28日第四十五頁，共七十七頁，2022年，8月28日1.硒光電池+-SeFe(Cu)h玻璃Ag(Au)透明膜-收集極塑料--(當(dāng)外電阻<400，i=10-100A)優(yōu)點(diǎn)：光電流直接正比于輻射能；使用方便、便于攜帶（耐用、成本低）；缺點(diǎn)：電阻小，電流不易放大；響應(yīng)較慢。只在高強(qiáng)度輻射區(qū)較靈敏；長時(shí)間使用后，有“疲勞”(fatigue)現(xiàn)象。第四十六頁，共七十七頁，2022年，8月28日2.真空光電管90VDC直流放大陰極R-+光束e陽極絲（Ni）抽真空

陰極表面可涂漬不同光敏物質(zhì)：高靈敏(K,Cs,Sb其中二者)、紅光敏(Na/K/Cs/Sb,Ag/O/Cs)、紫外光敏、平坦響應(yīng)(Ga/As，響應(yīng)受波長影響小)。產(chǎn)生的光電流約為硒光電池的1/10。優(yōu)點(diǎn)：阻抗大，電流易放大；響應(yīng)快；應(yīng)用廣。缺點(diǎn)：有微小暗電流（Darkcurrent，40K的放射線激發(fā)）。第四十七頁，共七十七頁，2022年，8月28日3.光電倍增管（photomultipliertube,PMT）

石英套光束1個(gè)光子產(chǎn)生106~107個(gè)電子?xùn)艠O，Grill陽極屏蔽光電倍增管示意圖共有9個(gè)打拿極(dynatron)，所加直流電壓共為9010VPMT動(dòng)畫第四十八頁，共七十七頁，2022年，8月28日900Vdc90V123456789陽極陰極石英封讀出裝置R光電倍增管（PMT）電路圖優(yōu)點(diǎn)：高靈敏度；響應(yīng)快；適于弱光測(cè)定，甚至對(duì)單一光子均可響應(yīng)。缺點(diǎn)：熱發(fā)射強(qiáng)，因此暗電流大，需冷卻（-30oC)。不得置于強(qiáng)光(如日光)下，否則可永久損壞PMT！第四十九頁，共七十七頁，2022年，8月28日4.硅二極管p區(qū)n區(qū)pn結(jié)p區(qū)n區(qū)(反向偏置)耗盡層空穴電子

反向偏值—耗盡層(depletionlayer)—pn結(jié)電導(dǎo)趨于0(i=0)；光照—耗盡層中形成空穴和電子—空穴移向p區(qū)并湮滅—外加電壓對(duì)pn“電容器”充電—產(chǎn)生充電電流信號(hào)(i0)。特點(diǎn)：靈敏度介于真空管和倍增管之間。第五十頁，共七十七頁，2022年，8月28日5.光電二極管陣列，photodiodearray(PDA)SiO2窗p

型硅n型硅基pnpnpnpnpnpn0.025mm2.5mm側(cè)視(crosssection)頂視(topview)光束說明：在一個(gè)硅片上，許多pn結(jié)以一維線性排列，構(gòu)成“陣列”；每個(gè)pn結(jié)或元（element，64-4096個(gè)）相當(dāng)于一個(gè)硅二極管檢測(cè)器；硅片上布有集成線路，使每個(gè)pn結(jié)相當(dāng)于一個(gè)獨(dú)立的光電轉(zhuǎn)換器；硅片上置于分光器焦面上，經(jīng)色散的不同波長的光分別被轉(zhuǎn)換形成電信號(hào)；實(shí)現(xiàn)多波長或多目標(biāo)同時(shí)（simultaneously）檢測(cè)。PDA在靈敏度、線性范圍和S/N方面不如光電倍增管。應(yīng)用較少。第五十一頁，共七十七頁，2022年，8月28日6.電荷轉(zhuǎn)移器件,CTDSiO2絕緣體摻雜n區(qū)襯基-5V-10V電極hCTD側(cè)視圖（一個(gè)電荷轉(zhuǎn)移單元或像素）光子—空穴—空穴聚集（金屬-SiO2電容)a行轉(zhuǎn)換器單元b個(gè)檢測(cè)單元/行=ab個(gè)像素=二維排列于一片硅片上；類似膠片上的信息存貯；測(cè)量兩電極間電壓變化—CID使電荷移至電荷放大器并測(cè)量—CCD第五十二頁，共七十七頁，2022年，8月28日襯基5V10Vh-5V-10Ve-v1n型Si襯基5V10V+5V+10V襯基5V10V-10Vv1n型Sin型Siv2襯基5V10V+10Vn型Si電荷形成并聚集測(cè)量V1測(cè)量V2電荷重新注入(1)CID破壞性讀出非破壞性讀出第五十三頁，共七十七頁，2022年，8月28日(2)CCD512320320512pixel高速寄存器123三相時(shí)鐘輸出（存貯）h金屬基電極(electrode)SiO2絕緣體(insulator)p型硅----勢(shì)阱(potentialwell)On-chippreamp1234第五十四頁，共七十七頁，2022年，8月28日CCD光電轉(zhuǎn)換演示動(dòng)畫CCD動(dòng)畫第五十五頁，共七十七頁，2022年，8月28日CID與CCD之比較

與PDA相比，CTD最大的優(yōu)勢(shì)在于其二維特性，可作為影像檢測(cè)器，在電視及航空等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。ChargeinjectiondeviceChargecoupleddevice第五十六頁，共七十七頁，2022年，8月28日4.5顯色反應(yīng)和顯色條件分光光度法對(duì)顯色反應(yīng)的要求在光度分析法中，使被測(cè)物質(zhì)在試劑（顯色劑）的作用下形成有色化合物的反應(yīng)稱為顯色反應(yīng)。對(duì)于顯色反應(yīng)，一般必須滿足下列要求：

（1）選擇性好。即在顯色條件下，顯色劑盡可能不要與溶液中其他共存離子顯色，如果其他離子也和顯色劑反應(yīng)，干擾離子的影響應(yīng)容易消除。

第五十七頁，共七十七頁，2022年，8月28日(2)靈敏度高。顯色反應(yīng)的靈敏度高，才能測(cè)定低含量的物質(zhì)。靈敏度可從摩爾吸光系數(shù)來判斷，但靈敏度高的顯色反應(yīng)，不一定選擇性好。在實(shí)踐中應(yīng)全面考慮。（3）顯色產(chǎn)物應(yīng)具有固定的組成，符合一定的化學(xué)式。對(duì)于形成不同配合比的配合物的顯色反應(yīng)，需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，使生成一定組成的配合物，以提高其重現(xiàn)性。（4）顯色產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)應(yīng)該穩(wěn)定。在測(cè)量過程中溶液的吸光度應(yīng)改變很小。

(5）顯色產(chǎn)物與顯色劑之間的顏色差別要大。第五十八頁，共七十七頁，2022年，8月28日顯色條件

1.顯色劑的用量

被測(cè)物質(zhì)與顯色劑的反應(yīng)可用下列一般式表示：

M十R＝MR

（被測(cè)物）（顯色劑）（有色配合物）為了使顯色反應(yīng)盡可能完全，一般應(yīng)加入過量的顯色劑。如果配合物穩(wěn)定度高，而且在一定條件下能保持穩(wěn)定，顯色劑不必大量過量。在分析實(shí)踐中，由于待測(cè)物質(zhì)的濃度未知，稍過量的顯色劑是必要的。第五十九頁，共七十七頁，2022年，8月28日

當(dāng)生成不太穩(wěn)定的有色配合物時(shí)，必須加入相當(dāng)過量的試劑，以保證獲得足夠的有色配合物并有可觀的吸光度。有時(shí)顯色劑的用量過大，反而會(huì)引起副反應(yīng)，對(duì)光度測(cè)定不利。應(yīng)嚴(yán)格控制顯色劑的用量，以保證得到正確的結(jié)果。通常，顯色劑的用量是根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來確定的。第六十頁，共七十七頁，2022年，8月28日2.溶液的酸度

(1)

酸度對(duì)顯色劑濃度的影響

所用的顯色劑不少是有機(jī)弱酸（以HR表示），酸度提高則平衡傾向于生成HR，使R的實(shí)際濃度降低，不利于顯色反應(yīng)的進(jìn)行。因此。顯色時(shí)溶液的酸度不能高于某一限度。此外，在不同的酸度下，R的濃度不同，有時(shí)可引起有色配合物配位數(shù)的改變。

(2）酸度對(duì)被測(cè)離子形態(tài)的影響當(dāng)被測(cè)離子是容易水解的金屬離子時(shí)，若酸度低于某一限度，被測(cè)離子形成羥基配合物、多核羥基配合物、堿式鹽或氫氧化物沉淀，不利于光度分析。

第六十一頁，共七十七頁，2022年，8月28日（3）對(duì)顯色劑顏色的影響許多有機(jī)顯色劑具有酸堿指示劑的性質(zhì)，隨著pH的改變，顯出不同的顏色，在選擇酸度時(shí)必須考慮這種情況。例如

H2RH++HRH＋R2-

（黃色）（橙色）（紅色）pH6.9pH12.4第六十二頁，共七十七頁，2022年，8月28日

3．顯色時(shí)間

有些顯色反應(yīng)能瞬間完成，且有色化合物的顏色很快達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，在較長時(shí)間內(nèi)保持不變；有些顯色反應(yīng)雖能迅速完成，但由于空氣的氧化、光的照射或其他原因使有色化合物的顏色逐漸減退；有些顯色反應(yīng)需要一定時(shí)間才能完成。

4．顯色溫度

（1）對(duì)顯色反應(yīng)速度的影響。反應(yīng)速度常隨溫度的升高而加快。（2）由于溫度的升高可能導(dǎo)致某些有色配合物發(fā)生分解或氧化還原反應(yīng)，因而會(huì)使有色配合物破壞而不利于光度測(cè)定。

第六十三頁，共七十七頁，2022年，8月28日

（3）溫度升高會(huì)引起有色配合物離解度的增大，使其穩(wěn)定性降低而導(dǎo)致吸光度下降。（4）溫度變化會(huì)使有色配合物的摩爾吸光系數(shù)改變，從而使吸光度發(fā)生改變。必須指出，在分析實(shí)踐中，并不是每一顯色反應(yīng)都同時(shí)存在上述四個(gè)方面的影響。通過繪制吸光度一溫度曲線可以確定反應(yīng)的適宜溫度。

5．溶劑

通常，水溶性有色配合物因加入適當(dāng)有機(jī)溶劑，使溶液的介電常數(shù)降低，使配合物離解度減小，或穩(wěn)定性增大。有時(shí)，可增大速度。第六十四頁，共七十七頁，2022年，8月28日4.6儀器測(cè)量誤差和測(cè)量條件儀器測(cè)量誤差

在分光光度分析法中，使用任何光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量時(shí)，都會(huì)產(chǎn)生一定的誤差。這些誤差可能來自光源的電壓不穩(wěn)定，光電元件靈敏度的變化和儀器刻度讀數(shù)不準(zhǔn)確等。如果測(cè)量時(shí)透光率讀數(shù)的絕對(duì)誤差是ΔT，對(duì)于同一臺(tái)儀器，它基本上是常數(shù)。但由于吸光度與透光率之間是負(fù)對(duì)數(shù)關(guān)系，在不同A值時(shí)，同樣的ΔT的讀數(shù)誤差所引起的吸光度的絕對(duì)誤差ΔA是不同的。A值越大，由ΔT引起的ΔA也越大。第六十五頁，共七十七頁，2022年，8月28日

根據(jù)朗伯－比耳定律,由ΔA引起的被測(cè)物質(zhì)濃度的誤差Δc為

ΔA＝k′Δc

再是根據(jù)吸收公式微分，可得：儀器測(cè)量誤差ΔT引起的濃度測(cè)量的相對(duì)誤差為：第六十六頁，共七十七頁，2022年，8月28日設(shè)ΔT＝0.01，計(jì)算不同T值與Δc/c的關(guān)系，可得到下圖：lnT=-1lgT=-0.434T=0.368這時(shí)誤差最小動(dòng)畫第六十七頁，共七十七頁，2022年，8月28日4.6.2測(cè)量條件的選擇

除選擇適宜的顯色條件外，還應(yīng)當(dāng)選擇合適的測(cè)量條件。主要的測(cè)量條件包括入射光波長、吸光度范圍和空白溶液等。下面將分別討論。

1．選擇入射光波長入射光的波長對(duì)測(cè)定結(jié)果的靈敏度和準(zhǔn)確度都有很大的影響。選擇時(shí)，應(yīng)先繪制有色溶液的光吸收曲線。然后選用該溶液的最大吸收波長來進(jìn)行測(cè)量。如果試液中某種組分在同樣的波長也有吸收，則對(duì)測(cè)定有干擾，這時(shí)，可選另一靈敏度稍低．但能避免干擾的入射光波長。

第六十八頁，共七十七頁，2022年，8月28日

2．控制吸光度的范國由儀器測(cè)量誤差的討論中可知，為了使測(cè)定結(jié)果獲得較高的準(zhǔn)確度，應(yīng)該控制溶液的吸光