新型冠狀病毒（2019-nCoV）抗體檢測試劑研發(fā)實驗要求

11/11新型冠狀病毒（2019-nCoV）抗體檢測試劑研發(fā)實驗要求新型冠狀病毒（2019-nCoV）（以下簡稱“新冠病毒”）屬于β屬的冠狀病毒，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，直徑60-140nm。具有5個必需基因，分別針對核蛋白（N）、病毒包膜（E）、基質(zhì)蛋白（M）和刺突蛋白（S）四種結(jié)構(gòu)蛋白及RNA依賴性的RNA聚合酶（RdRp）。核蛋白（N）包裹RNA基因組構(gòu)成核衣殼，外面圍繞著病毒包膜（E），病毒包膜包埋有基質(zhì)蛋白（M）和刺突蛋白（S）等蛋白。新冠病毒侵入人體后，人體會產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體進行防御。其中特異性抗體IgM最早產(chǎn)生并進行早期防御，但該抗體維持時間短，消失快，在血中持續(xù)數(shù)日至數(shù)周；隨后產(chǎn)生IgG抗體，在IgM接近消失時，IgG的含量達到高峰，并在血中持續(xù)較長時間。在臨床應(yīng)用中，因新冠病毒特異性IgG在病毒感染早期檢出率較低，因此該標(biāo)志物不單獨用于新冠病毒感染的輔助診斷，應(yīng)與新冠病毒特異性IgM抗體檢測聯(lián)合使用。新冠病毒疫苗的接種會刺激人體產(chǎn)生保護性抗體，隨著大規(guī)模人群新冠病毒疫苗接種率的提高，在新冠病毒血清學(xué)檢測過程中，應(yīng)充分考慮疫苗接種對檢測結(jié)果的影響，新型冠狀病毒肺炎診療方案提出，新冠病毒特異性IgM檢測不適用于近期接種過新冠病毒疫苗的人群。同時，新冠病毒疫苗接種后抗體持續(xù)陽性的時間尚未有明確的研究結(jié)論，新冠病毒特異性IgG檢測亦不適用于接種過新冠病毒疫苗或曾經(jīng)感染過新冠病毒的人群。在新冠病毒抗體臨床應(yīng)用上，我國《新冠病毒疫苗接種技術(shù)指南》明確規(guī)定，接種后不建議常規(guī)檢測抗體作為免疫成功與否的依據(jù)。本文適用的新冠病毒抗體檢測試劑預(yù)期用途為體外定性檢測人體血清、血漿、全血等樣本中新冠病毒特異性IgM抗體/IgG抗體/總抗體。本文不適用于檢測新冠病毒IgA抗體以及中和抗體相關(guān)產(chǎn)品。產(chǎn)品名稱應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》（國家市場監(jiān)督管理總局令第48號）及相關(guān)法規(guī)的要求，如新型冠狀病毒（2019-nCoV）抗體檢測試劑盒（膠體金法）。根據(jù)《體外診斷試劑分類規(guī)則》，該產(chǎn)品按照第三類體外診斷試劑管理，分類編碼為6840。

一、新型冠狀病毒（2019-nCoV）抗體檢測試劑性能研究實驗要求

1.分析性能研究對適用不同機型產(chǎn)品，需開展不同性能評估。如產(chǎn)品包含不同的包裝規(guī)格，需要對各包裝規(guī)格進行分析或驗證。適用的不同樣本類型應(yīng)分別進行分析性能研究。分析性能評估所用樣本的基本信息均需明確，例如樣本來源、樣本類型、采集和處理方式、稀釋方式、定值過程及數(shù)據(jù)等。研究中采用的新冠病毒陽性樣本，應(yīng)采用科學(xué)合理的方法確定其陰陽性和濃度水平。分析性能評估用樣本一般應(yīng)為真實樣本，如涉及稀釋后檢測，應(yīng)采用與適用樣本類型一致的陰性基質(zhì)。1.1.樣本穩(wěn)定性樣本穩(wěn)定性研究應(yīng)采用臨床真實樣本進行，通常應(yīng)當(dāng)至少包含一定數(shù)量陰性樣本、弱陽性樣本及陽性樣本，考察樣本在經(jīng)歷不同的儲存條件后，試劑能否穩(wěn)定輸出符合要求的結(jié)果。樣本穩(wěn)定性可以包含樣本凍融穩(wěn)定性和運輸穩(wěn)定性的研究，以及樣本經(jīng)過處理后（如滅活）穩(wěn)定性的研究。1.2.適用的樣本類型明確適用的樣本類型，如：血清、血漿或全血等，血漿和全血需考察不同抗凝劑的適用性。如產(chǎn)品適用于血清和血漿，可采用同源比對驗證樣本的可比性。如產(chǎn)品適用于全血，可采用該樣本類型進行全性能評估，亦可至少進行檢出限、不同區(qū)域病毒樣本的包容性和精密度研究，同時進行同源比對試驗。研究樣本采集時間點的選擇：是否受病程、臨床癥狀、用藥情況等因素的影響。1.3.校準(zhǔn)品的量值溯源和質(zhì)控品的賦值明確校準(zhǔn)品的的量值溯源（如適用）。明確質(zhì)控品的賦值（如適用）。需至少進行三批產(chǎn)品分別在不同適用機型的賦值研究。1.4.精密度應(yīng)對精密度指標(biāo)，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)等的評價標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求。精密度研究應(yīng)采用臨床樣本。應(yīng)考慮運行、時間、操作者、儀器、試劑批次和地點等影響精密度的條件，設(shè)計合理的精密度試驗方案進行評價。設(shè)定合理的精密度評價周期，例如：為期至少20天的檢測，具體方案可參考性能評價相關(guān)文件進行。用于精密度評價的臨床樣本應(yīng)至少包含4個水平：陰性樣本、臨界陽性樣本、（中和強）陽性樣本，并根據(jù)產(chǎn)品特性設(shè)定適當(dāng)?shù)木芏纫?。陰性樣本：待測物濃度低于檢出限或為零濃度，陰性檢出率應(yīng)為100%（n≥20）。臨界陽性樣本：待測物濃度略高于試劑盒的檢出限，陽性檢出率應(yīng)≥95%（n≥20）。中陽性樣本：待測物濃度呈中等陽性，陽性檢出率為100%且CV≤15%（n≥20）。強陽性樣本：待測物濃度呈強陽性，陽性檢出率為100%且CV≤15%（n≥20）。1.5.包容性應(yīng)對具有時間和區(qū)域特征性的不同來源的患者真實臨床樣本進行驗證。IgM抗體、IgG抗體檢測試劑分別研究各10個不同患者樣本，驗證內(nèi)容應(yīng)包括檢出限、重復(fù)性等，開展樣本及濃度的確認方法、試驗數(shù)據(jù)。其中應(yīng)注意，包容性研究樣本和檢出限研究樣本不能重復(fù)。1.6.檢出限檢出限的確定：建議選取特定滴度的特異性抗體陽性樣本梯度稀釋進行檢出限確定，每個梯度的稀釋液重復(fù)3～5份，每份稀釋液重復(fù)檢測不少于20次，將具有95%陽性檢出率的抗體水平作為檢出限。IgM抗體、IgG抗體應(yīng)分別選擇不同來源具有代表性的5個臨床樣本進行檢出限的確定。檢出限的驗證：選擇具有時間和區(qū)域特征性的至少5個臨床樣本（與檢出限確定不同樣本）在檢出限濃度水平進行驗證，應(yīng)達到95%陽性檢出率。采用的稀釋液應(yīng)與適用樣本類型的基質(zhì)一致，可采用陰性樣本進行稀釋。抗體檢測試劑應(yīng)對抗體類型和滴度進行驗證。1.7.分析特異性1.7.1交叉反應(yīng)驗證（IgM抗體、IgG抗體檢測試劑應(yīng)分別驗證）地方性人類冠狀病毒（HKU1，OC43，NL63和229E）。H1N1（新型甲型H1N1流感病毒（2009）、季節(jié)性H1N1流感病毒）、H3N2、H5N1、H7N9，乙型流感Yamagata、Victoria，呼吸道合胞病毒，鼻病毒A、B、C組，腺病毒1、2、3、4、5、7、55型，腸病毒A、B、C、D組，EB病毒、麻疹病毒、人巨細胞病毒、輪狀病毒、諾如病毒、腮腺炎病毒、水痘-帶狀皰疹病毒。肺炎支原體。高濃度新型冠狀病毒特異性IgG抗體與特異性IgM抗體的交叉反應(yīng)驗證。驗證不少于20份正常人樣本。1.7.2內(nèi)源/外源物質(zhì)干擾：開發(fā)人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進行評價，在病毒抗體臨界陽性水平進行干擾試驗驗證。

用于干擾試驗的物質(zhì)物質(zhì)活性成分血液中干擾物質(zhì)膽紅素、血脂、血紅蛋白、類風(fēng)濕因子、抗核抗體、抗線粒體抗體、HAMA、總IgG、總IgM、紅細胞壓積（全血樣本適用）等?？共《舅幬铴?干擾素、扎那米韋、利巴韋林、奧司他韋、帕拉米韋、洛匹那韋、利托那韋阿比多爾抗生素左氧氟沙星阿奇霉素頭孢曲松美羅培南全身性抗菌藥妥布霉素過敏性癥狀緩解藥物鹽酸組胺

1.8.高劑量鉤狀效應(yīng)應(yīng)對高劑量鉤狀效應(yīng)進行研究。10.IgM抗體破壞試驗（IgM抗體檢測試劑適用）：對至少5份含有病原體特異性IgM抗體的樣本進行IgM破壞試驗研究，方法為采用特定的化學(xué)制劑（如2－巰基乙醇或二硫蘇糖醇）處理樣本后，重新進行檢測，IgM檢測結(jié)果應(yīng)為陰性。1.9.企業(yè)參考品性能：根據(jù)主要原材料研究資料中的企業(yè)參考品設(shè)置情況，采用三批產(chǎn)品對企業(yè)參考品進行檢驗。1.10.反應(yīng)體系研究1.10.1研究樣本采集時間點的選擇：是否受病程、臨床癥狀、用藥情況等因素的影響。1.10.2反應(yīng)條件確定應(yīng)考慮反應(yīng)時間、判讀時間、反應(yīng)溫度/濕度、洗滌液體積和洗滌次數(shù)（如涉及）等條件對產(chǎn)品性能的影響，通過試驗確定上述條件的最佳組合。1.10.3反應(yīng)體系中樣品加樣方式及加樣量確定通過試驗確定最佳的加樣方式及加樣量。如樣本需采取稀釋或其他必要的方法進行處理后方可用于最終檢測，應(yīng)對樣本稀釋液及其用量、其他必要的處理方法等進行研究。對于IgM抗體檢測試劑，如采用間接法，建議考慮高濃度特異性IgG對結(jié)果的影響，合理設(shè)置IgG去除相關(guān)樣本處理步驟，以降低特異性IgG可能造成的假陰性和假陽性。應(yīng)對樣本是否可以滅活，以及可采用的滅活方式、滅活時間進行研究確定。

2.穩(wěn)定性研究2.1.實時穩(wěn)定性（貨架有效期）至少對三批申報產(chǎn)品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的實時穩(wěn)定性進行研究。明確儲存的環(huán)境條件（如溫度、濕度和光照）及有效期。2.2.使用穩(wěn)定性產(chǎn)品實際使用期間穩(wěn)定性的研究應(yīng)包括所有組成成分的開封穩(wěn)定性。適用時開展復(fù)溶穩(wěn)定性、機載穩(wěn)定性及凍融次數(shù)研究等。如涉及校準(zhǔn)品，還應(yīng)開展校準(zhǔn)頻率或校準(zhǔn)穩(wěn)定性研究。明確產(chǎn)品使用的溫度、濕度條件等。2.3.運輸穩(wěn)定性開展產(chǎn)品可在特定或者預(yù)期的條件下運輸?shù)难芯?，明確產(chǎn)品正確運輸?shù)沫h(huán)境條件（如溫度、濕度、光照和機械保護等）。同時說明產(chǎn)品的包裝方式以及暴露的最差運輸條件。注意應(yīng)考察經(jīng)過運輸條件后實時穩(wěn)定性。3.陽性判斷值研究陽性判斷值的確定：開展對申報試劑陰性/灰區(qū)/陽性等結(jié)果判斷的陽性判斷值（cut-off，CO）確定的研究，包括具體的試驗方案、人群樣本選擇、評價標(biāo)準(zhǔn)、統(tǒng)計學(xué)分析和研究數(shù)據(jù)等。確定陽性判斷值使用的樣本來源的選擇應(yīng)考慮到不同的地理區(qū)域、不同的感染階段和生理狀態(tài)等因素的影響。如適用,可采用受試者工作特征曲線（receiveroperatingcharacteristiccurve,ROC）的分析方式來選擇確定合理的陽性判斷值；如結(jié)果存在灰區(qū)（equivocalzone），應(yīng)明確灰區(qū)建立的基礎(chǔ)。應(yīng)重點考察對弱陽性樣本的區(qū)分能力，研究中應(yīng)包含有統(tǒng)計學(xué)意義的弱陽性樣本例數(shù)。陽性判斷值的驗證：應(yīng)搜集采用分布均勻的真實樣本對所確定的陽性判斷值進行驗證。陽性判斷值的驗證樣本不應(yīng)與陽性判斷值的確定樣本以及臨床試驗樣本重復(fù)。如果產(chǎn)品適用不同樣本類型，需要對所有樣本類型進行陽性判斷值的驗證。4.其他研究4.1.主要原材料研究主要原材料包括抗原、抗體、質(zhì)控品、參考品等。應(yīng)確定主要原材料的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)研究。主要原材料可企業(yè)自制，也可外購，供應(yīng)商應(yīng)固定，不得隨意更換。4.1.1.新型冠狀病毒特異的抗原、抗體病原體特異的抗原、抗體是該類產(chǎn)品的關(guān)鍵原材料。4.1.1.1.新型冠狀病毒抗體檢測試劑所用特異性抗原應(yīng)確定抗原表位，確定抗原來源、制備、篩選、純化、鑒定及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（外觀、蛋白濃度、純度、分子量、功能性試驗等）。主要包括以下兩種情況：4.1.1.1.1.企業(yè)自制抗原天然抗原，應(yīng)確定毒株選擇、培養(yǎng)、抗原提取、純化、鑒定等試驗過程。重組抗原，則應(yīng)確定有關(guān)特定基因選擇、序列信息、克隆構(gòu)建及轉(zhuǎn)化、抗原表達及純化、鑒定等內(nèi)容，重組抗原應(yīng)明確與天然抗原結(jié)構(gòu)的異同。4.1.1.1.2.企業(yè)外購抗原應(yīng)確定抗原的名稱、抗原生物學(xué)來源、供應(yīng)商名稱、供應(yīng)商選擇的依據(jù)，供應(yīng)商需出具的抗原性能指標(biāo)及檢驗報告。重組抗原應(yīng)明確關(guān)特定基因選擇、序列信息，克隆構(gòu)建及轉(zhuǎn)化，抗原表達及純化、鑒定等研究，重組抗原應(yīng)明確與天然抗原結(jié)構(gòu)的異同。4.1.1.2.其他主要原材料除上述主要原材料外，產(chǎn)品中包含的其他主要原材料，如小鼠抗人IgM/IgG單克隆抗體、酶標(biāo)抗體、膠體金、硝酸纖維素膜、微孔板、樣本稀釋液等，均應(yīng)進行選擇及驗證，。明確主要原材料的供應(yīng)商和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。免疫層析方法學(xué)的產(chǎn)品如適用于全血，應(yīng)介紹血細胞去除方式，并驗證去除效果。4.1.2.試劑盒質(zhì)控品/質(zhì)控線應(yīng)設(shè)置合理的質(zhì)控品/質(zhì)控線。質(zhì)控品應(yīng)至少包含陰性和陽性兩個水平?？贵w檢測試劑陽性質(zhì)控品可選擇臨床陽性樣本，陰性質(zhì)控品可選擇臨床陰性樣本或陰性基質(zhì)等。確定相關(guān)原料的來源、選擇和性能，并進行相關(guān)研究，明確供應(yīng)商和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。企業(yè)應(yīng)對質(zhì)控品的檢測結(jié)果（如A值）做出明確的范圍要求（試驗有效性的判斷）。4.1.3.企業(yè)參考品該類產(chǎn)品的企業(yè)參考品一般包括陽性參考品、陰性參考品、檢出限參考品和重復(fù)性參考品。應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能驗證的實際需要設(shè)置企業(yè)參考品。應(yīng)確定企業(yè)參考品的原料來源、選擇、制備、陰陽性及濃度/滴度確認方法或試劑等相關(guān)驗證。企業(yè)參考品的基質(zhì)應(yīng)與待測樣本相同。新型冠狀病毒抗體檢測試劑的企業(yè)參考品的設(shè)置建議如下：4.1.3.1.陽性參考品陽性參考品應(yīng)考慮覆蓋不同來源及特征的新型冠狀病毒感染樣本，可選擇至少各5份確認為陽性的臨床樣本，并設(shè)置不同滴度水平。4.1.3.2.陰性參考品陰性參考品應(yīng)考慮檢測特異性的評價，應(yīng)納入正常臨床樣本、含類風(fēng)濕因子等干擾因素的樣本及其他病原體特異性抗體、抗原陽性樣本，建議包括冠狀病毒（HKU1、OC43、N