新城疫病毒誘導雞胸腺法氏囊細胞凋亡的初步研究img,alt,stylemargin

本文格式為Word版，下載可任意編輯——新城疫病毒誘導雞胸腺法氏囊細胞凋亡的初步研究,,img,alt,stylemargin新城疫病毒誘導雞胸腺、法氏囊細胞凋亡的初步研究李翔房慧伶曾蕓廣西大學動物科學技術學院廣西南寧530005摘要新城疫NewcastleDisease,胭是由副粘病毒科新城疫病毒NewcastleDisaasVirus,胭r引起的烈性傳染桂疾病。最近研究說明，NDV可在體外謗導淋巴細胞凋亡，但NDV在體內誘導淋巴細胞凋亡尚未見報道．本研究用新城疫病毒標準強毒F48E株感染雞，通過光鏡和電鏡查看雞的胸腺和法氏囊中淋巴細胞凋亡的形態(tài)特征并在光鏡下計數(shù)和舉行統(tǒng)計學分析．光鏡下，對照組胸膝爭法氏囊凋亡淋巴細胞數(shù)量較少；

感染蛆脾腺和琺氏囊琳巴細胞展現(xiàn)了明顯的細胞凋亡．無論是對照組還是感染組，凋亡細胞的數(shù)量在皮質多于髓質，而且在皮質與越質交界處最多．電鏡下可以領會地查看到細胞凋亡過程和多種形態(tài)的凋亡細胞及凋亡小律的形成與除掉．意肇后期，在腳腺和法氏囊組織中察覺有細胞變柱，壞死．胸腺和法氏囊淋巴細胞平均凋亡率變化曲線圖顯示胸腺和法氏囊淋巴細胞的凋亡率變化規(guī)律的一樣的．1感染組的凋亡率顯著高于對照組；

2對照蛆凋亡率隨著天數(shù)的增加而增大3感染組的凋亡率隨著天數(shù)的增加而增大，并于第三天達成最大．以后逐步回落．統(tǒng)計舉分析說明胸腺和法氏囊淋巴細胞的凋亡率感染姐與對照蛆對比呈楓顯著差異p0．01。

測驗姑果說明NDV標準強毒F45B人I感皋嗚后可以請導胸朦和法氏囊淋巴細胞凋亡，同時引起雞胸腺和法氏囊淋巴細胞壞曩，造成淋巴細胞數(shù)量裁減，導致免疫抑制．關鍵詞t斷城疲病毒胸朦法氏囊細胞凋亡新城痰Newcast]eD1sesse,刀是由副牯病毒科新城疫病毒Newcast]eDiseaseVirus,徹n引起的烈性傳染性疾病。NDV能夠引起胸腺和法氏囊淋巴細胞大量壞死，導致嚴重的免疫抑制。對NDv引起ND的病理學入們已經作過較細致的研究，但對NDV引起胸腺和法氏囊淋巴細胞凋亡的研究較少。最近研究說明，NDV可在體外誘導淋巴細胞凋亡，使淋巴細胞數(shù)量裁減，導致免疫抑制，但NDV在體內誘導淋巴細胞凋亡尚未見報道。本試驗通過對人工感染NDV的雞脾腺和法氏囊舉行光鏡和電鏡查看，直接查看至0胸腺和法氏囊淋巴細胞呈現(xiàn)細胞凋亡的典型特征．為表明NDV引起免疫抑制的機理供給了直接證據(jù)。

1，材料和方法1．1材料1．1．1雞北海風翔畜禽有限公司供給。30只，品種中麻雞。

L1．2NDV毒株F48F．8株，廣西大學動科院禽病研究室供給。

1．2方法1．2．1檢測母源抗體血清學試驗，呈陰性。

．124i．2．2測驗雞分組，攻毒，飼養(yǎng)測驗雞隨即分為兩組感染組和對照組，每組15只，隔離飼養(yǎng)。25日齡攻毒將新城疫標準強毒F48E8舉行l(wèi)10稀釋，每只雞肌肉注射0．5ml。

1．2．3取材攻毒后ld，2d，3d，4d，5d連續(xù)取材。每天剖殺6只，對照組和感染紐各3只。取雞的肝，脾，胸腺，法氏囊舉行姐清學試驗。取雞的胸腺和法氏囊舉行如下固定】光鏡查看的材料用lo％的福爾馬林溶液固定。

2電鏡查看的材料用3％的戊二醛固定。

l2。4新城疫病毒的檢測血清學試驗，呈陽性。

1．2．5光鏡制樣，查看常規(guī)石蠟切片，HE染色，光鏡查看，拍照。

1．2．6電鏡制樣，查看1％鋨酸固定，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，透射電鏡查看，拍照。

1．2．7凋亡指數(shù)％的計算光學顯微鏡下查看，隨機選擇10個視野，計數(shù)凋亡細胞，并計算凋亡指數(shù)。

凋亡指數(shù)％該范圍內凋亡細胞數(shù)／該范圍細胞總數(shù)*100％2．結果2．1光鏡查看對照組胸腺和法氏囊凋亡淋巴細胞數(shù)量較少；

感染組胸腺和法氏囊淋巴細胞展現(xiàn)了明顯的細胞凋亡。無論是對照組還是感染組，凋亡細胞的數(shù)量在皮質多于髓質，而且在皮質與髓質交界處最多。凋亡早期的淋巴細胞嗜堿性鞏固，體積縮小，胞漿濃縮，并與周邊淋巴細胞脫離。隨后細胞核染色質凝集，邊集，裂解成致密的球形染色質團塊凋亡小體，結果被巨噬細胞吞噬。感染后期，在胸腺和法氏囊組織中察覺有細胞變性、壞死。

2．2電鏡查看在電鏡下可以領會地查看到了細胞凋亡過程及形成的凋亡小體。由于在同一組織中細胞凋亡并不是同時發(fā)生的，所以處在不同凋亡階段的凋亡細胞均可見到。細胞凋亡早期，染色質濃縮，邊集，核膜和胞膜完整，線粒體，高爾基復合體等細胞器無明顯變化，但數(shù)量裁減。細胞凋亡中期，細胞變形，細胞膜仍完整。凋亡細胞的細胞核展現(xiàn)各種各樣的形態(tài)新月形、半月形、“c”形、花瓣狀、圓環(huán)狀或圓斑狀等。后期細胞核碎裂，細胞膜出泡，芽生形成膜包裹的凋亡小體。凋亡小體常包含濃染的染色質團塊及片面胞漿成分。最后凋亡細胞和凋亡小體被巨噬細胞吞噬、除掉。個別凋亡細胞的細胞器和胞漿內展現(xiàn)空泡，還有些凋亡細胞發(fā)生繼發(fā)性壞死。

．125．2．3統(tǒng)計分析，計算凋亡率，繪制曲線圖2．3．1對胸腺和法氏囊凋亡細胞計數(shù)舉行統(tǒng)計分析。

表1胸腺淋巴細胞平均凋亡率％Groupld2d3d4d5dControl0．169-士0．10l0．246士0．0710．408士0．1850．462士0．1660．685t0．147TreatmenI1．139-0．2681．315￡-0．3003．8390．2523．339-I-0．3562．915士O．559PpO．OlpO．Olp0．01p0．01D0．01表2法氏囊淋巴細胞平均凋亡率％Group1d2d3d4d5dContr011．23士0．2631．61￡-0．2862．26t0．3072．6l士o．4322．80士o．477Treatment2．03i-0．3423．8IL-0．6324．64t0．5924．13t9．8123．73士-0．499Pp0．01p0．01p0．01pO．01pO．01從表1、表2可以看出，胸腺和法氏囊淋巴細胞的凋亡率感染組與對照組對比呈極顯著差異pO．01。感染后第三天細胞凋亡率達成最高。對照組凋亡率隨著天數(shù)的增加而增大。法氏囊無論是對照組還是感染組，其淋巴細胞的平均凋亡率都高于胸腺。

2．3．2凋亡率及其曲線圖．126．圖1胸腺淋巴緬胞平均凋亡率變化曲線圖圖2法氏囊淋巴細胞平均凋亡率變化曲線圖從瞌線圈可以看出胸腺和法氏囊淋巴細胞的凋亡率變化規(guī)律的一樣的。

1感染組的凋亡率顯著高于對照組；

2對照組凋亡率隨著天數(shù)的增加而增大；

3感染組的凋亡率隨著天數(shù)的增加而增大，并于第三天達成最大，以后逐步回落。

3．議論3．1測驗結果說明，對照組和感染組的胸腺和法氏囊的淋巴細胞都發(fā)生了細胞凋亡。胸腺和法氏囊的皮質和髓質，在光鏡下可以查看到染色質凝集形成的圓形，半月形等外形的凋亡細胞及細胞核裂解形成的凋亡小體；

在電鏡下除查看到多種外形的凋亡細胞外，還可以查看到凋亡小體的形成和消亡過程細胞皺縮，胞質電子密度增大一染色質凝集并裂解為數(shù)個圓形團塊，然后散開一細胞膜內陷，逐步將含有致密染色體團塊和片面胞漿的凋亡小體釋放出去，結果被巨噬細胞吞噬。光鏡與電鏡查看結果～致，從不同角度顯示了胸腺和法氏囊的淋巴細胞發(fā)生細胞凋亡的形態(tài)變化過程。

3．2NDV能在體內同時引起雞胸腺，法氏囊淋巴細胞壞死和凋亡。這與LamKM報道的雞新城疫病毒感染在導致細胞凋亡的同時又伴隨著細胞壞死的結果是一致的?。細胞凋亡與細胞壞死是細胞死亡的兩種不同形式，兩者的超微布局變化明顯不同細胞發(fā)生壞死時，細胞器的變化早于細胞核的交化，細胞胞質腫脹，細胞體積增大，胞膜破損，線粒體、內質網明顯擴張；

當細胞核壞死時，染色質嗜堿性減弱，呈稀疏細顆粒狀，分布無規(guī)律，邊界不清；

細胞急速展現(xiàn)腫脹和溶解。而細胞發(fā)生凋亡時，細胞皺縮，胞膜完整，胞漿內的細胞器變化發(fā)生較遲且變化不明顯，細胞核染色質早期即發(fā)生凝集、邊集、嗜堿性鞏固、細胞核固縮、碎裂成數(shù)個圓形顆粒。

3．3凋亡細胞的數(shù)量，在皮質多于髓質，而且在皮質和髓質的交界處凋亡細胞的數(shù)量最多。這是由于皮質和皮髓交界處為淋巴細胞舉行陽性選擇和陰性選擇的部位”1，所以在皮質或皮髓交界處展現(xiàn)細胞凋亡的幾率就大一些。未成熟的淋巴細胞是～種雙陽性細胞，即．127CD4--CDa雙陽性細胞，與胸腺上皮細胞的姍IC分子相互作用，發(fā)育成單陽性細胞，這一過程為淋巴細胞的陽性選擇。未成熟的淋巴細胞與自身憫c分子和自身抗原共同作用，啟動細胞凋亡程序，導致細胞被除掉，此過程即為陰性選擇。淋巴細胞的陽性選擇，導致了CD4域Cm細胞的展現(xiàn)和正常發(fā)育，而陰性選擇導致了凋亡”1。李玉谷、辛朝安等，通過對鴨胸腺細胞自然凋亡的電鏡查看，察覺鴨自然凋亡的胸腺細胞多位于胸腺皮質“’，這與本測驗結果好像。

3．4從胸腺、法氏囊的淋巴細胞平均凋亡率變化曲線圖可以看出，人工感染新城疫病毒后的第三天，感染組的細胞凋亡率達U最大值，以后逐步回落，這可能與NDv誘導的時間有緊密關系。劉勝旺、陳洪巖等，在新城痰F48E9病毒體外誘導雞T細胞程序性死亡的試驗中，用流式細胞儀檢測，隨著誘導時間的增加，凋亡細胞的數(shù)目也明顯增加“3。以后逐漸回落可能與細胞壞死有關。病毒感染除了能引起細胞凋亡，還引起細胞壞死。細胞凋亡是病毒損傷細胞的最直接機制，而有些細胞為了抗爭病毒誘導的凋亡而以壞死形式發(fā)生死亡，因而在病毒感染的早期，壞死細胞不多見，但隨著病程的延長，細胞壞死的程度也隨之增加”1。

陳志勝、王丙云、潘患雄等，通過對鴨肝炎病毒誘導雛鴨細胞凋亡的研究。察覺DttV強毒株在接種后24h即可誘導免疫器官有明顯的細胞凋亡，而接種后72h凋亡處境逐步停【上。脾、胸膿、法氏囊凋亡率在36h達顛峰。然后逐步被壞死代替，透露了雛鴨發(fā)病過程中，免疫細胞的凋亡先于病理性損傷發(fā)生。DIN可誘導胸腺、法氏囊細胞及脾臟胸腺憑借及非憑借區(qū)淋巴細胞均發(fā)生