第六部分體外轉錄和翻譯

第六部分體外轉錄和翻譯第一頁，共五十五頁，2022年，8月28日Invitrotranscription第二頁，共五十五頁，2022年，8月28日InVitroTranscription目的:體外得到單一,大量的mRNA意義:探針原位雜交siRNARNAiTranscript體外翻譯,蛋白表達第三頁，共五十五頁，2022年，8月28日InvitroTranscriptionT7T3EcoRIBamHIAntisense:CutwithEcoRIUseT-3polymeraseSense:CutwithBamHIUseT-7polymerase第四頁，共五十五頁，2022年，8月28日第五頁，共五十五頁，2022年，8月28日第六頁，共五十五頁，2022年，8月28日VectorMaps第七頁，共五十五頁，2022年，8月28日InvitroTranscriptionPlasmidwithT3,T7orSP6promotersLinearizationofplasmidDNAbyrestrictionenzymeInvitrotranscription:Plasmid

buffer

NTP

labeledUTPRNApolymeraseDNAsedigestion,Phenol/ChloroformextractionandRNAprecipitataion第八頁，共五十五頁，2022年，8月28日GlovesshouldbewornatalltimesduringpreparationofinvitroRNA.AllsolutionsshouldbeRNase-freei.e.madewithDEPCwaterifhome-madeorboughtspecificallytouseforRNAwork.Invitrotranscriptionreaction第九頁，共五十五頁，2022年，8月28日Youwillneed:

-Ribonucleaseinhibitor(RNasin)

-T7orT3RNAPolymerase-2.5mMrNTPs

-5xT7/T3RNAPolymeraseBuffer(200mMTris.ClpH8.0,125mMNaCl,40mMMgCl2,10mMspermidine)-100mMDTT

-RNase-freeDNaseI-DEPC-treated,autoclavedInvitrotranscriptionreaction第十頁，共五十五頁，2022年，8月28日Linearizetheplasmidat,ornear,theterminusoftheinsertcDNAwithasuitablerestrictionendonuclease.ExtractplasmidDNAwithanequalvolumeofphenol/chloroformandanequalvolumeofchloroformpriortoethanolprecipitation.LinearizedplasmidDNAisresuspendedinDEPC-treated,autoclavedTE,pH7.5ataconcentrationofapproximately200ng/ulpriortouse.Invitrotranscriptionreaction第十一頁，共五十五頁，2022年，8月28日4)Thestandardreactionconditionsaresetupcontainingthefollowingquantities:-2ul(400ng)linearizedplasmidDNA

-20Uribonucleaseinhibitor

-2ul100mMDTT

-4ul5xT3/T7RNApolymerasebuffer

-4ul2.5mMNTPs

-Sterile,DEPCtreatedH2Otoafinalvolumeof19.5ul

25U(0.5ul)T3/T7RNApolymeraseThereactionmixtureisincubatedat37°Cfor60minutes.第十二頁，共五十五頁，2022年，8月28日DNAtemplateisremovedbytheadditionof25URNase-freeDNaseIandafurtherincubationfor30minutesat37°C.Thereactionmixtureisphenol/chloroformextractedtwice,ethanolprecipitated,vacuumdriedandresuspendedin25ulsterile,DEPC-treatedTE,pH7.5.RNAcanbeanalysedbeelectrophoresisusingdenaturingconditionsinanagarose/formaldehydegelsystem.第十三頁，共五十五頁，2022年，8月28日InVitroTranscription探針原位雜交siRNARNAiTranscript體外翻譯,蛋白表達第十四頁，共五十五頁，2022年，8月28日AdvantagesofRNAprobes:RNA-RNAhybridsareverystableTissuecanbedigestedwithRNase(dsRNAisnotdigested)afterthehybridizationreducingthebackgroundHigherspecificactivitycomparedtooligonucleotides第十五頁，共五十五頁，2022年，8月28日InVitroTranscribedsiRNAsInVitroTranscribedsiRNAs

-EquallyeffectiveaschemicallysynthesizedsiRNAs-DesigneffectivesiRNAAdvantages-Price-Shorterturn-aroundtimeDisadvantages-Morehands-on-Scalability第十六頁，共五十五頁，2022年，8月28日第十七頁，共五十五頁，2022年，8月28日第十八頁，共五十五頁，2022年，8月28日Invitrotranslation第十九頁，共五十五頁，2022年，8月28日測序技術,PCR,RT-PCR技術,芯片技術,RNA干擾技術核酸信息蛋白質功能第二十頁，共五十五頁，2022年，8月28日DNA水平缺失基因,上調下調基因的表達水平對生命過程的影響分離純化蛋白質,研究其基本特性,直接在蛋白質水平進行研究蛋白質功能研究思路第二十一頁，共五十五頁，2022年，8月28日蛋白樣品的獲得收集大量的生物材料純化(材料來源受限)重組表達的方式(費時費力)體外表達(Invitrotranslation,快速,高通量快速篩選)第二十二頁，共五十五頁，2022年，8月28日Invitrotranslation利用體外表達，除了利用載體克隆，更快速的選擇是——在PCR時兩端加上不同的啟動子序列就可以得到體外表達的模板材料了。不利用細胞表達,體外表達不需要花時間轉化轉染細胞、也不需要篩選重組克隆，也不需要培養(yǎng)細胞，加入特定的細胞裂解物，利用其中的核糖體、合成酶、tRNA、翻譯起始、延伸、終止因子、氨基酸等等蛋白質合成的必需元件，在適合的溫度下只需幾個小時就可以得到蛋白質產物，大大節(jié)約了時間和精力，在快速鑒別基因產物上就格外有優(yōu)勢。第二十三頁，共五十五頁，2022年，8月28日體外表達可以避免過量表達對細胞的毒性，或者形成不溶的包含體，以及表達產物在細胞內的降解，因而可以表達一些對細胞具有毒性的或者不穩(wěn)定、容易被降解的蛋白。減少了蛋白變性復性的困擾。體外表達還可以在體系內添加特殊的修飾氨基酸或者標記氨基酸，非常靈活，因而在蛋白質折疊和蛋白質功能研究上都有重要應用。第二十四頁，共五十五頁，2022年，8月28日Cell-FreeExpressionSystems:1:E.colilysate

tolerance2:Rabbitreticulocyte:betterforlargeproteins

3:Wheatgermextract:betterforsmallerproteinscheaperthanrabbitreticulocyte第二十五頁，共五十五頁，2022年，8月28日真核體外表達體系并非只適用于真核基因，原核也并非只限于原核表達——在靈活的體外表達系統(tǒng)中，只要序列滿足啟動子和核糖體結合位點的需求，任何系統(tǒng)均可匹配任何基因。第二十六頁，共五十五頁，2022年，8月28日Allarepreparedascrudeextractscontainingallthemacromolecularcomponents:-70Sor80Sribosomes-tRNAs,aminoacyl-tRNAsynthetases-initiation,elongationandterminationfactors,etc.Toensureefficienttranslation,eachextractmustbesupplementedwith:-aminoacids-energysources(ATP,GTP)-energyregeneratingsystems(creatinephosphateandcreatinephosphokinaseforeukaryoticsystems,andphosphoenolpyruvateandpyruvatekinasefortheE.colilysate)-otherco-factors(Mg2+,K+,etc.).第二十七頁，共五十五頁，2022年，8月28日真核VS

原核滿足啟動子和核糖體結合位點第二十八頁，共五十五頁，2022年，8月28日E.colilysate對大腸桿菌蛋白合成機制十分了解,成本低,不需加帽簡單高效,可偶連體外轉錄和翻譯,不需分步優(yōu)化條件耐受性(在含有其它不同成分雜質時仍可正常工作)-加入特殊添加劑(蛋白酶抑制劑,分子伴侶etc)-特殊的修飾氨基酸或者標記氨基酸獲得帶標記蛋白

彈性大,加入優(yōu)化成份一提高產率和溶解性(例如：修飾過的反應環(huán)境可以變成氧化環(huán)境以幫助蛋白形成正確的二硫鍵，然后正確的折疊。)

第二十九頁，共五十五頁，2022年，8月28日E.coliT7S30S30原核體外翻譯系統(tǒng)的E.coliT7S30提取物是由OmpT內切蛋白酶和Lon蛋白酶缺陷的E.coliB菌株制備,因此可增加穩(wěn)定性,尤其適用于在體外表達時易被蛋白酶降解的蛋白質.也適合那些在體內表達由于宿主編碼的抑制酶作用而表達水平低的蛋白質,使其能高表達.還可用于轉錄和翻譯調控的研究可合成少量標記蛋白質用于蛋白純化中作為示蹤物質以及在蛋白質中摻入非天然的氨基酸用于研究蛋白質的結構功能第三十頁，共五十五頁，2022年，8月28日S30體外翻譯系統(tǒng)(Promega)靈活,能使用含有T7啟動子和一個核糖體結合位點的任何克隆進行翻譯穩(wěn)定,減少所表達蛋白質被降解的機會簡便,包含和所有偶聯(lián)的轉錄/翻譯所需要的組份低背景,系統(tǒng)合成的內源蛋白質水平低缺少一種氨基酸的氨基酸混合物以備標記需要使用方便混合好需要的各組分和模板,37度保溫1-2小時后置冰上5分鐘PAGE電泳,western檢測,或TCA沉淀純化第三十一頁，共五十五頁，2022年，8月28日S30的應用合成放射性同位素標記的蛋白質在E.coli體內表達蛋白質之前核實克隆的基因用蛋白質進行轉錄和翻譯調控的研究用蛋白質作為蛋白純化的示蹤物在蛋白質中摻入非天然氨基酸作結構研究第三十二頁，共五十五頁，2022年，8月28日RocheRTSE.Coli偶聯(lián)反應:連續(xù)交換無細胞(CECF)系統(tǒng)反應高產率(HY)生化體系第三十三頁，共五十五頁，2022年，8月28日RocheRTSE.Coli第三十四頁，共五十五頁，2022年，8月28日Rabbitreticulocyte(兔網(wǎng)織紅細胞系統(tǒng))兔網(wǎng)織紅細胞用活大白兔制備,通過純化除去兔網(wǎng)織紅細胞以外的污染細胞.兔網(wǎng)織紅細胞裂解后,提取物用微球菌核酸酶破壞內源mRNA,最大限度降低翻譯背景裂解物包含了蛋白質合成所必需的細胞內組分(tRNA,核糖體,氨基酸,起始,延伸,終止因子)添加了磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶的能量生成系統(tǒng),以及氯化高鐵血紅素防止翻譯起始的抑制添加了tRNAs混合物用于擴大mRNA翻譯范圍第三十五頁，共五十五頁，2022年，8月28日網(wǎng)織紅細胞無細胞核,保留高效翻譯各種核酸信息的能力由紅細胞分化而來,在體內主要負責合成大量血紅蛋白以及球蛋白(90%以上).內源的核酸酶很少,有助于長鏈RNA的穩(wěn)定,可以合成較大的蛋白有內源球蛋白mRNA,可通過鈣離子依賴的核酸酶除去,并通過EDTA處理使核酸酶失活第三十六頁，共五十五頁，2022年，8月28日Wheatgermextract(麥胚提取物系統(tǒng))cheaperthanrabbitreticulocyte麥胚芽提取物經(jīng)在提取物緩沖液中碾碎麥胚芽，再經(jīng)離心除去細胞碎片制得。上清夜經(jīng)過了層析，將抑制翻譯的內源氨基酸和植物色素從提取物分開。提取物用微球菌核酸酶處理過，破壞了內源mRNA，以把背景翻譯減到最小。麥胚芽提取物包含蛋白合成所必需的細胞組分（tRNA，核糖體，起始、延伸和終止因子）.使用前透析,提取物中添了磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶的能量生成系統(tǒng),以及增加鏈延伸效率的亞精胺,以及一定量的乙酸鎂氯化高鐵血紅素防止翻譯起始的抑制第三十七頁，共五十五頁，2022年，8月28日由于內源的mRNA很少，這個系統(tǒng)可用于各種病毒、酵母、高等植物乃至哺乳動物蛋白的合成。當表達產物較難與球蛋白區(qū)分（12—15kD）、或者表達產物正好可能是哺乳動物細胞中富含而植物中沒有的調控因子一類的蛋白時、或者是不明原因表達不出時，就不妨嘗試麥芽提取物體系?？煞€(wěn)定表達一些在兔網(wǎng)織紅細胞系統(tǒng)中翻譯受到抑制的DNA,如那些含有低濃度的雙鏈mRNA的模板要求RNA有帽子結構才能更好的翻譯在合成分子量較大的蛋白質時常提前終止

第三十八頁，共五十五頁，2022年，8月28日Twoapproachestoinvitroproteinsynthesisbasedonthestartinggeneticmaterial:RNAorDNA.Standardtranslationsystems,suchasreticulocytelysatesandwheatgermextracts,useRNAasatemplate.Becausethetranscriptionandtranslationreactionsareseparate,eachcanbeoptimizedtoensurethatbotharefunctioningattheirfullpotential.Whereas"coupled“systemsstartwithDNAtemplates,whicharetranscribedintoRNAthentranslated.第三十九頁，共五十五頁，2022年，8月28日SchematicofIn-vitroTranslationRNAgeneratedinvitroutilizesT7,SP6orT3RNApolymeraseinaseparateuncoupledreaction第四十頁，共五十五頁，2022年，8月28日InVitroTranscriptionandTranslationProcedureUsingRabbitReticulocyteLysate.第四十一頁，共五十五頁，2022年，8月28日CoupledTranscription:TranslationUnlikeeukaryoticsystemswheretranscriptionandtranslationoccursequentially,inE.coli,transcriptionandtranslationoccursimultaneouslywithinthecell.InvitroE.colitranslationsystemsarethusperformedthesameway,coupled,inthesametubeunderthesamereactionconditions.Duringtranscription,the5'endoftheRNAbecomesavailableforribosomalbindingandundergoestranslationwhileits3'endisstillbeingtranscribed.ThisearlybindingofribosomestotheRNAmaintainstranscriptstabilityandpromotesefficienttranslation.Thisbacterialtranslationsystemgivesefficientexpressionofeitherprokaryoticoreukaryoticgeneproductsinashortamountoftime.Forthehighestproteinyieldandthebestinitiationfidelity,makesuretheDNAtemplatehasaShine-Dalgarnoribosomebindingsiteupstreamoftheinitiatorcodon.CappingofeukaryoticRNAisnotrequired.UseofE.coliextractalsoeliminatescross-reactivityorotherproblemsassociatedwithendogenousproteinsineukaryoticlysates.Also,theE.coliS30extractsystemallowsexpressionfromDNAvectorscontainingnaturalE.colipromotersequences(suchaslacortac).第四十二頁，共五十五頁，2022年，8月28日CoupledinVitroTranscription:TranslationProcedureUsingE.coliExtract.

第四十三頁，共五十五頁，2022年，8月28日mRNA設計要求用原核和真核細胞的mRNA轉錄本有明顯的區(qū)別。通常真核mRNA帶有轉錄后加工的5‘-7methyl-GTPcap和3’poly(A)tail，有助于增加mRNA的穩(wěn)定性，防止降解。同時5‘帽子結構有助于核糖體與mRNA的結合和AUG起始密碼的正確識別。對應不同的體外表達系統(tǒng)，在設計RNA模版的時候就要區(qū)別對待。原核生物中，核糖體受一段富含嘌呤的SD序列引導從而識別AUG起始密碼。這段位于AUG上游的序列和30S核糖體亞基的16srRNA一段序列互補，保守區(qū)5‘-UAAGGAGGUGA-3’，核糖體結合位點RBS和起始密碼AUG之間的距離以及堿基的組成對翻譯的效率有顯著影響。而真核生物的那段保守序列成為Kozak序列（5‘-GCCACCAUGG-3’），要高效翻譯，+1G和-3A就很重要。不過如果mRNA沒有這段Kozak序列而有一段適當長度5‘UTR也能夠有效地在無細胞體系中得到翻譯。有數(shù)據(jù)提示，大腸桿菌的核糖體通常只認得SD序列，而真核比如網(wǎng)織紅細胞的核糖體能識別Kozak序列，也能識別SD序列。第四十四頁，共五十五頁，2022年，8月28日The+1isthefirstbaseoftheAUGinitiatorcodon(shaded)responsibleforbindingoffMet-tRNAfMet.Theunderlineindicatestheribosomalbindingsitesequence,whichisrequiredforefficienttranslation.第四十五頁，共五十五頁，2022年，8月28日體外翻譯的應用第四十六頁，共五十五頁，2022年，8月28日第四十七頁，共五十五頁，2022年，8月28日第四十八頁，共五十五頁，2022年，8月28日第四十九頁，共五十五頁，2022年，8月28日mRNA定量分析NorthernBlotRT-PCR實時熒光定量PCR（real-timequantitativePC