聚β羥丁酸PHB的生產(chǎn)

聚-β-羥丁酸（PHB）的生產(chǎn)一、聚-β-羥丁酸的應(yīng)用前景聚-β-羥丁酸（PHB），作為一種天然高分子聚合物，具有生物相容性、生物可降解性、無(wú)刺激性、無(wú)免疫原性和組織相容性等特殊性能，在組織工程、藥物緩釋控釋系統(tǒng)、骨科以及醫(yī)用手術(shù)縫合線領(lǐng)域獲得成功的應(yīng)用。PHB有良好的生物降解性，其分解產(chǎn)物可全部為生物利用，對(duì)環(huán)境無(wú)任何污染；其熔融溫度為175～180℃，是一種可完全分解的熱塑性塑料。它的物理性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)與聚丙烯（PP）很類似，如摩爾質(zhì)量、軟化點(diǎn)、結(jié)晶度、拉伸強(qiáng)度等，目前主要應(yīng)用于醫(yī)療、工業(yè)、包裝、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。

面對(duì)日益嚴(yán)峻的資源和環(huán)境問題，走可持續(xù)發(fā)展道路，就要研究開發(fā)可自然降解的新材料。PHB是微生物合成型降解材料中的典型代表，具有良好的生物降解性，分解產(chǎn)物可全部為生物利用，目前研究較為深入并初步進(jìn)入商品化階段。二、國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀

對(duì)PHB的研究始于上世紀(jì)初期。1926年,法國(guó)巴斯德研究所Lemoigne首次從巨大芽孢桿菌(Bail2lusmegatheriucm)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)并分離提取了PHB。20世紀(jì)70年代后,因石油危機(jī)和環(huán)保運(yùn)動(dòng),PHB開始受到重視。英國(guó)帝國(guó)化學(xué)公司ICI是世界上最早商品化生產(chǎn)PHB的廠家。1981年該公司采用真養(yǎng)產(chǎn)堿桿(Alcaigeneseutrophus)的一個(gè)突變株,成功地運(yùn)用單細(xì)胞蛋白的發(fā)酵裝置,以糖和丙酸為主要碳源,首先生產(chǎn)出工業(yè)化商品PHBV,命名為Biopol。

此后,日本IshizakiA等報(bào)道利用H2和CO2為底物培養(yǎng)A.eutrophusATCC176967,發(fā)酵40h,細(xì)胞干重85g/L,PHB濃度61.5g/L。

加拿大BioventuresAlbertaInc.以重組大腸桿菌生產(chǎn)PHB。目前,除了利用微生物生產(chǎn)PHB外,轉(zhuǎn)基因植物法和化學(xué)合成法生產(chǎn)PHB也成為當(dāng)今研究的方向。國(guó)內(nèi)PHB的研究起步較晚,但進(jìn)步很快,取得了很大的成果。中科院微生物研究所陳琦等1994年報(bào)道通過紫外誘變A.eutrophusH16原始菌株選育出能利用葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)PHB的優(yōu)良菌株65-7、47-5和34-5,搖瓶發(fā)酵水平都達(dá)10g/L,PHB含量77%。清華大學(xué)生物系陳國(guó)強(qiáng)教授采用基因工程菌生產(chǎn)PHB,產(chǎn)品已實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化,市場(chǎng)前景看好。根據(jù)已有試驗(yàn)的生產(chǎn)水平，一個(gè)年產(chǎn)500噸PHB的工廠，50m3的發(fā)酵罐3臺(tái)，配備相應(yīng)的水、電、汽、氣、下游加工設(shè)備及2000m2的生產(chǎn)車間，建廠需一年左右，約需投資2000萬(wàn)元。按國(guó)際上PHB的現(xiàn)行價(jià)格10美元／kg計(jì)算，年產(chǎn)值為4000萬(wàn)元，而依據(jù)我們?cè)囼?yàn)結(jié)果估算的生產(chǎn)成本為40元／kg，企業(yè)每年獲得利稅2000萬(wàn)元。若將用于組織工程材料的共聚體[P（HB-co-HH）]、[P（HB-co-HO）]投入小規(guī)模生產(chǎn)，一個(gè)年產(chǎn)22噸P(HB-co-HH)或P(HB-co-HO)的工廠，需5m3的發(fā)酵罐3臺(tái)，配備相應(yīng)的水、電、汽、氣、下游加工設(shè)備及500m2的生產(chǎn)車間，約需投資170萬(wàn)元左右。倘若產(chǎn)品質(zhì)量達(dá)到美國(guó)FAD規(guī)定的醫(yī)學(xué)組織工程使用的標(biāo)準(zhǔn)，出廠值以125美元/kg計(jì)算，年產(chǎn)值為2200萬(wàn)元人民幣。生產(chǎn)成本不超過為100元／kg，企業(yè)每年獲得利稅1980萬(wàn)元。三、投資、產(chǎn)值、可行性四、生產(chǎn)設(shè)備及條件1.上游技術(shù)階段所需要的儀器：PCR儀、培養(yǎng)箱、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵罐這些設(shè)備條件都容易實(shí)現(xiàn)2.下游技術(shù)階段所需要的儀器：酸度計(jì)、板框壓濾機(jī)、高速冷凍離心機(jī)、細(xì)胞破碎儀、濃縮罐等在生產(chǎn)上均是常見的使用儀器都能實(shí)現(xiàn)3.污水處理設(shè)備：帶式壓濾機(jī)上：立體式發(fā)酵罐下：發(fā)酵生產(chǎn)車間PCR儀板框壓濾機(jī)高速冷凍離心機(jī)

細(xì)胞破碎儀污水處理設(shè)備：帶式壓濾機(jī)五、生產(chǎn)技術(shù)流程構(gòu)建基因工程菌種子培養(yǎng)及發(fā)酵PHB成品制取1.構(gòu)建基因工程菌（1）首先采用分子克隆操作制備大腸桿菌和真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌的感受態(tài)細(xì)胞（CaCl2法）（2）在第一步制備好的感受態(tài)細(xì)胞中加入體積小于10微升、質(zhì)量小于50納克的攜帶透明顫菌血紅蛋白基因的質(zhì)粒pBR322vgb，進(jìn)行質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化（3）從轉(zhuǎn)化后的重組大腸桿菌E．coliJM105（pBR322-vgb）的固體平板上挑取單菌落，接種于裝有1－10毫升的LB液體培養(yǎng)基的試管中，在25－38℃的溫度下于15O－300轉(zhuǎn)／分鐘的搖床上培養(yǎng)6-15小時(shí)；對(duì)收獲的菌體采用試劑盒法提取并純化其中的質(zhì)粒PBR322-vgb，從而得到擴(kuò)增的含透明顫菌血紅蛋白基因（vg）的質(zhì)粒pBR322-vgb構(gòu)建基因工程菌（4）采用限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒pBR322-vgb進(jìn)行透明顫菌血紅蛋白（vgb）基因片段的酶切分離，酶切溫度為25－38℃，時(shí)間為1-5小時(shí)，酶切后的vgb片段用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳回收（5）將酶切收獲的透明顫菌血紅蛋白基因（vgb）與PHB合成基因（phbCAB）及λ噬菌體裂解基因（SRRz）采用常規(guī)克隆操作進(jìn)行基因重組，并引入宿主大腸桿菌和真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌中，構(gòu)建多功能基因工程菌2.種子培養(yǎng)及發(fā)酵（1）在含葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基中對(duì)新構(gòu)建的基因工程菌進(jìn)行培養(yǎng)即種子的擴(kuò)大培養(yǎng)（2）發(fā)酵—即生產(chǎn)上擴(kuò)大培養(yǎng)—（最優(yōu)化培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件為：碳源濃度60g/L，氮源濃度30g/L，C/N為3.76時(shí)PHB含量最高，PHB含量達(dá)到30.57g/L）得到含有PHB量高的菌體預(yù)處理提取精制制取成品3.PHB成品制取