現(xiàn)代生命科學(xué)與生物技術(shù)基因技術(shù)

現(xiàn)代生命科學(xué)與生物技術(shù)基因技術(shù)第一頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/151本章內(nèi)容7.1基因克隆技術(shù)7.2基因測(cè)序技術(shù)7.3基因重組技術(shù)7.4生物制造第二頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日27.1基因克隆技術(shù)概念：由少量（單拷貝）基因擴(kuò)增產(chǎn)生大量（高拷貝）基因。分子克隆策略：化學(xué)合成－已知序列（60－80bp）;生物合成（基因擴(kuò)增）(已知部分或全部序列)；文庫(kù)篩選應(yīng)用：測(cè)序，功能研究，診斷與檢測(cè)，物質(zhì)生產(chǎn)…7.1.1基因克隆第三頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/1537.1.2PCR原理與技術(shù)1、原理1971，Kleppe等首先描述了基因合成的基本原理PCR技術(shù)發(fā)明人：KaryMullis（Cetus公司）1983，構(gòu)想DNA鏈的合成。1985，Klenow片段擴(kuò)增出哺乳動(dòng)物單拷貝基因1993，獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：Polymerasechainreaction，PCR分子生物學(xué)技術(shù)，生物體外，擴(kuò)增一段DNA片段。通常不超過(guò)10kb,特定方法擴(kuò)增40kb左右。第四頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/154PCR原理：在DNA聚合酶催化下DNA的復(fù)制過(guò)程，利用反復(fù)相同程序，DNA聚合酶在體外擴(kuò)增特定的DNA片段。變性94℃退火55℃延伸72℃第1輪第2輪第3輪指數(shù)增加第五頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/155加熱方式：水加熱，空氣加熱，電熱絲加熱，半導(dǎo)體+電熱絲致冷方式：水致冷，空氣致冷，壓縮機(jī)致冷，半導(dǎo)體致冷溫控系統(tǒng)儀器構(gòu)造：三傳感器，雙區(qū)域溫度--溫度梯度樣品池傳感熱敏元件熱泵熱池2、PCR儀原理計(jì)算機(jī)芯片控制過(guò)程參數(shù)第六頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/156ThePCRJetfromMegaBasegivesfastPCRwithlargesamples.2、PCR儀，熱循環(huán)儀Morereactionsinthesamespacewith1,536wells第七頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/1573、操作過(guò)程PCR反應(yīng)的基本組分：DNA模板：含靶基因的DNA片段引物：1對(duì)人工合成的短寡核苷酸，18－25bp，決定擴(kuò)增的起始和終止位置及擴(kuò)增長(zhǎng)度DNA聚合酶：作用是催化合成復(fù)制擴(kuò)增的區(qū)域底物：4種脫氧核糖核苷酸(dNTPs)，A、T、G、C緩沖體系:提供適合聚合酶行使功能的化學(xué)環(huán)境。石蠟油：防止蒸發(fā)；管蓋（可加熱）封閉反應(yīng)管第八頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/158PCR的條件與循環(huán)參數(shù)第1步：25－40個(gè)循環(huán)，變性(94-96℃，1-2min)——退火（降低溫度使得引物結(jié)合到模板的特定序列上。55℃，1-2min)——延伸（DNA聚合酶由引物的3端開(kāi)始，沿著DNA鏈合成新的互補(bǔ)鏈。72℃，1000bp/min)。第2步：強(qiáng)化延伸，72℃，7－13min第3步：終止反應(yīng)（4℃）PCR反應(yīng)在熱循環(huán)儀（PCR儀）中自動(dòng)化進(jìn)行。反應(yīng)控制：溫度的加熱或冷卻過(guò)程，關(guān)鍵是每步反應(yīng)溫度精確，升溫和降溫的時(shí)間控制。第九頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/159PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果第十頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日107.1.3PCR技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展原理沒(méi)有變，技術(shù)改進(jìn)，派生出多種類(lèi)型和用途?；蚩寺》矫妫悍崔D(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)：以RNA為模板，基因擴(kuò)增多重PCR(multiplexPCR)：同一反應(yīng)中使用多組引物，擴(kuò)增多個(gè)基因第十一頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/1511gcgtacgtacgtagagtgctagtctagtcgtagcgccgtagtcgatcgtgtgggtagtagctgatatgatgcgaggtaggggataggatagcaacagatgagcggatgctgagtgcagtggcatgcgatgtcgatgatagcggtaggtagacttcgcgcataaagctgcgcgagatgattgcaaagragttagatgagctgatgctagaggtcagtgactgatgatcgatgcatgcatggatgatgcagctgatcgatgtagatgcaataagtcgatgatcgatgatgatgctagatgatagctagatgtgatcgatggtaggtaggatggtaggtaaattgatagatgctagatcgtaggtagtagctagatgcagggataatgcgcatta…….7.2基因測(cè)序技術(shù)基因是由A、T、G、C4種堿基組成基因組測(cè)序就是排列出其DNA上所有堿基順序。第十二頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/15127.2.1核酸測(cè)序技術(shù)簡(jiǎn)史1965，HolleyR等：測(cè)定酵母tRNA全部77bp的序列。1971，Wu,Taylor：dNTP，λDNA黏末端12bp。1973，Gilbert和Maxam，RNA聚合逆轉(zhuǎn)錄DNA，RNA測(cè)序。1975,Sanger:加減法測(cè)定了X174DNA的6386bp序列。1977，Sanger：酶法測(cè)序。雙脫氧鏈終止法。PNAS。1977，Maxam和Gilbert：化學(xué)降解法測(cè)序。PNAS。1980，Messing等:測(cè)序優(yōu)化，計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理。1982，Hood等:部分自動(dòng)化，熒光檢測(cè)，PCR測(cè)序。1990，自動(dòng)測(cè)序儀，測(cè)序酶，配套熒光染料，機(jī)器人高通量工具，人類(lèi)基因組測(cè)序啟動(dòng)。2000，毛細(xì)管測(cè)序儀，機(jī)器人使用，加速測(cè)序2005－2007，以GenomeSequencerSystem、GenomeAnalyzersystem、SOLiDSystem為代表的基因組測(cè)序分析系統(tǒng)的誕生，標(biāo)志著進(jìn)入超高通量基因組測(cè)序的新時(shí)代。第十三頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/15137.2.2傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)（1）產(chǎn)生長(zhǎng)度只差1bp的一系列寡核苷酸：固定起點(diǎn)，隨機(jī)終止于特定一種或者多種殘基（A、T、C、G）。長(zhǎng)度由特定堿基在DNA上位置所決定。（2）檢測(cè)長(zhǎng)度只差1bp的一系列寡核苷酸：

SDS－PAGE電泳分離，發(fā)光成像。（3）確定序列：放射性（32P、33P）、熒光（非放射性熒光），直接讀出DNA上的核苷酸順序。產(chǎn)生只差1bp寡核苷酸方法，分兩種：Sanger雙脫氧鏈終止法，Maxam-GilbertDNA化學(xué)降解法。1、基本原理第十四頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/15142、Sanger雙脫氧鏈終止法第十五頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/15152、Sanger雙脫氧鏈終止法第十六頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/15163、Maxam－GilbertDNA化學(xué)降解法開(kāi)始：Gilbert研究lac抑制子與lac操縱基因。發(fā)現(xiàn)：抑制子結(jié)合并保護(hù)操縱子DNA，用Sanger建立的RNA測(cè)序技術(shù)測(cè)定了DNA片段序列。靈感火花：蘇聯(lián)Mirzabekov到訪(fǎng)，午餐討論，是否與DNA的甲基化有關(guān)，產(chǎn)生了化學(xué)測(cè)序技術(shù)。1977：測(cè)序技術(shù)，PNAS，74：560－564DNA片段一端用放射性標(biāo)記，用堿基特異性的化學(xué)反應(yīng)裂解DNA，通過(guò)標(biāo)定末端與斷裂位點(diǎn)之間的距離來(lái)確定堿基的位置第十七頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/1517原理末端標(biāo)記DNA：放射性同位素化學(xué)修飾堿基：硫酸二甲酯甲基化G；甲酸甲基化A和G；肼水解C和T，鹽抑T，哌啶切割：鏈斷裂，一組從1－300bp不等的末端標(biāo)記分子。5組獨(dú)立反應(yīng)：每組特異針對(duì)某一種或某一類(lèi)堿基。生成5組產(chǎn)物，共同起點(diǎn)（放射性標(biāo)記末端）到發(fā)生化學(xué)降解的位點(diǎn)。電泳分離，放射自顯影。讀出序列：比較G、A＋G、C＋T、C和A>C各個(gè)泳道，從測(cè)序凝膠放射自顯影片上讀出DNA序列。第十八頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/1518Maxam-GilbertvsSangerMG法：剛問(wèn)世時(shí)，重現(xiàn)性更高，化學(xué)試劑，易掌握。Sanger法：?jiǎn)捂溎０搴吞禺愐铮哔|(zhì)量DNA聚合酶噬菌體和噬菌粒載體的發(fā)展，聚合酶，標(biāo)記技術(shù)，合成引物及測(cè)序反應(yīng)日臻完善，機(jī)器人等自動(dòng)化。Sanger法：簡(jiǎn)便快速，現(xiàn)今測(cè)序的最佳方案。MG法應(yīng)用:基因功能研究。第十九頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/1519第二十頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/1520………ATGCCGTAGGCCTAGC

TAGGCCTAGCTCGGA……………ATGCCGTAGGCCTAGCTCGGA……基因組DNABAC文庫(kù)根據(jù)物理圖譜正確定位的BAC或contig用于霰彈法測(cè)序的候選克隆用于霰彈法測(cè)序的亞克隆測(cè)序并組裝完整的基因組序列逐步克隆法（ClonebyClone）

全基因組霰彈法（WholeGenomeShot-gun)基因組DNA

霰彈法克隆測(cè)序并進(jìn)行全基因組序列組裝完整的基因組序列第二十一頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/1521毛細(xì)管檢測(cè)：ABI公司的3100凝膠電泳檢測(cè):美國(guó)LI-COR公司的4300系統(tǒng)第二十二頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/15223730XL系列DNA分析儀MegaBACE1000毛細(xì)管測(cè)序儀第二十三頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/1523測(cè)序效率1977：4×50bp（樣品/人/周×可讀平均長(zhǎng)度）1980：20×100bp（熒光標(biāo)記）1985：30×250bp1990:60×300bp（PCR引入）1995：180×500bp1999:500×650bp2000：5000×600bp熒光素標(biāo)記的終止物ddNTP；單向測(cè)序長(zhǎng)度保證700－900bp。1.5kb序列，雙向反應(yīng)，一次讀通，免去引物合成。第二十四頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/15241994：3億美元測(cè)定一個(gè)人類(lèi)基因組(1:10)1984：30億美元測(cè)定一個(gè)人類(lèi)基因組未來(lái)目標(biāo)：1000美元測(cè)定一個(gè)人類(lèi)基因組(1:3x106)2004：3千萬(wàn)美元測(cè)定一個(gè)人類(lèi)基因組(1:100)2006：150萬(wàn)美元測(cè)定一個(gè)人類(lèi)基因組(1:2000)未來(lái)目標(biāo)：100美元測(cè)定一個(gè)人類(lèi)基因組(1:3x107)第二十五頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/1525高通量測(cè)序技術(shù)主要測(cè)序方法：焦磷酸測(cè)序技術(shù)：

Roche公司的GSFLX系統(tǒng)（454系統(tǒng)）；橋擴(kuò)增測(cè)序技術(shù)：

Illumina公司的GenomeAnalyzer系統(tǒng)（Solexa系統(tǒng)）；連接測(cè)序技術(shù)：

ABI公司的SOLiD系統(tǒng)；第二十六頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/1526高通量測(cè)序技術(shù)主要應(yīng)用領(lǐng)域：未知物種基因組的從頭測(cè)序已知物種的重新測(cè)序環(huán)境基因組測(cè)序基因轉(zhuǎn)錄組和表達(dá)調(diào)節(jié)sRNA分析染色質(zhì)免疫共沉淀SNP等多個(gè)領(lǐng)域。第二十七頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/15271、焦磷酸測(cè)序技術(shù)2005年底，羅氏診斷公司和454公司推出了基于焦磷酸測(cè)序法的超高通量基因組測(cè)序系統(tǒng)——GenomeSequencer20System(GS20)。2007年推出了通量更大，讀長(zhǎng)更長(zhǎng)，準(zhǔn)確性更高的第二代基因組測(cè)序系統(tǒng)——GenomeSequencerFLXSystem(GSFLX)。第二十八頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/1528PPiATPPyrosequencing技術(shù)原理每延伸1個(gè)核苷酸，釋放出1個(gè)焦磷酸焦磷酸在磺?；缸饔孟律葾TP熒光素酶利用ATP把無(wú)熒光的分子轉(zhuǎn)化為熒光物質(zhì)，化學(xué)發(fā)光，監(jiān)測(cè)。1、焦磷酸測(cè)序技術(shù)第二十九頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/1529Nucleotidesdispensedsequentially12345678910110-1AAGCTGThesequenceinthispyrogram?isAGGCAGAGGCAG無(wú)需加ddNTP，隨著反應(yīng)的進(jìn)行而同步讀出序列。第三十頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/1530SingleimageDNA聚合酶APSATPPPiLight+OxyluciferinsulfurylaseluciferaseEmulsionBasedClonalAmplification第三十一頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/1531OpenMachine、SequenceGenome光學(xué)系統(tǒng)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)微流體系統(tǒng)多道吸口試劑泵、閥CCD照相機(jī)pl板第三十二頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/1532The454Tech2007年3月Roche公司收購(gòu)了454公司，推出了新一代高通量測(cè)序儀GSFLX系統(tǒng)。10小時(shí)內(nèi)完成一個(gè)測(cè)序反應(yīng)，單反應(yīng)讀長(zhǎng)由100bp擴(kuò)展到400bp，準(zhǔn)確性達(dá)99％產(chǎn)出數(shù)據(jù)量達(dá)1億堿基對(duì)。每次運(yùn)行可分析16個(gè)非混合的獨(dú)立樣品。的基因組的測(cè)序。第三十三頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/1533GenomeAnalyzer

Illumina公司于2007年推出。讀序原理：可逆性末端終結(jié)反應(yīng)。在橋擴(kuò)增過(guò)程，四種堿基底物分別標(biāo)記四種不同熒光，每個(gè)堿基末端被保護(hù)基團(tuán)封閉。單次反應(yīng)只能加入一個(gè)堿基，經(jīng)過(guò)掃描，讀取該次反應(yīng)顏色。然后，除去該保護(hù)基團(tuán)，以使下一個(gè)堿基的延伸反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行。反復(fù)多輪反應(yīng)，按順序可排出DNA的序列。2、橋擴(kuò)增測(cè)序技術(shù)（Solexa）第三十四頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/15342、橋擴(kuò)增測(cè)序技術(shù)原理：基因組DNA片段化，兩端添加接頭；單鏈DNA片段被固定在特殊芯片上形成單鏈橋，以芯片引物擴(kuò)增，形成雙鏈橋。30多輪擴(kuò)增，每個(gè)單鏈DNA分子擴(kuò)增形成單克隆DNA簇；檢測(cè)，讀出序列。

第三十五頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/1535Solexa測(cè)序通量單端讀序長(zhǎng)度已經(jīng)大于36個(gè)堿基，雙端讀序?qū)⑹箿y(cè)序提高1倍，讀序長(zhǎng)度達(dá)2×36堿基。讀取的準(zhǔn)確性在99％以上。每次可平行分析8個(gè)非混合獨(dú)立樣品。單次實(shí)驗(yàn)可得到15－30億堿基的數(shù)據(jù)。第三十六頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/15363.連接測(cè)序技術(shù)（SOLiD系統(tǒng)）2007年，ABI公司推出新一代高通量基因測(cè)序儀－SOLiD系統(tǒng)。第三十七頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/15373.連接測(cè)序技術(shù)（SOLiD系統(tǒng)）引物與微珠接頭序列配對(duì)，在連接酶催化下，探針與測(cè)序引物發(fā)生連接反應(yīng)。可視化檢測(cè)連接產(chǎn)物發(fā)光，第5位堿基顏色。除去末端，完成一輪測(cè)序。重新開(kāi)始連接、成像、切割。第三十八頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/1538SOLiD系統(tǒng)ABI，2007年推出四色熒光探針連接反應(yīng)（1）基因組片段與接頭連接，構(gòu)建文庫(kù)。（2）油包水的微反應(yīng)器中擴(kuò)增，變性，雜交，富集PCR產(chǎn)物。修飾，共價(jià)鍵結(jié)合到樣品板上。（3）磁珠沉積，并分割成不同的小室。（4）連接過(guò)程中讀序，進(jìn)行拼接和分析。第三十九頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/1539測(cè)序效率每輪運(yùn)行可產(chǎn)生超過(guò)40億堿基對(duì)的數(shù)據(jù)；準(zhǔn)確率能達(dá)到99.94％；可用于檢測(cè)基因組序列變異，如SNP、基因拷貝數(shù)變化、重復(fù)序列、倒位、插入和缺失，特別適合個(gè)體基因組測(cè)序、比較基因組學(xué)、基因表達(dá)譜分析、染色質(zhì)免疫共沉淀位點(diǎn)和蛋白調(diào)控因子-DNA結(jié)合部位等研究。

第四十頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/1540三種高通量測(cè)序技術(shù)的比較454SolexaSOLiD讀長(zhǎng)（bp）300-50036-7225-35準(zhǔn)確率>99％>99％>99％每輪可產(chǎn)生數(shù)據(jù)（億堿基對(duì)）115-3040所屬公司Roche

Illumina

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第四十一頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/15417.3基因重組技術(shù)基因重組概念：在體外，將不同的基因通過(guò)切割、連接，重組形成雜合分子。插入到合適的載體分子上，轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中。隨著細(xì)胞繁殖，基因得以真實(shí)復(fù)制擴(kuò)增和表達(dá)。應(yīng)用：測(cè)序，修飾和改造基因，表達(dá)編碼產(chǎn)物。第四十二頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/15427.3.1傳統(tǒng)的重組技術(shù)酶切反應(yīng)載體目標(biāo)基因可連接的末端連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化重組分子重組子第四十三頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/15431、DNA片段的酶切限制性?xún)?nèi)切酶催化雙鏈DNA分子斷裂，形成相應(yīng)的片段。反應(yīng)體系組成：雙鏈DNA、限制性?xún)?nèi)切酶、緩沖液組成反應(yīng)條件：一般在37℃反應(yīng)1小時(shí)。第四十四頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/15442、DNA片段的連接DNA連接酶催化兩條斷開(kāi)的DNA雙鏈分子，形成3,5-磷酸二酯鍵，得到重組DNA分子。反應(yīng)體系組成：2個(gè)DNA片段（具有可連接的末端）、連接酶、緩沖液條件：一般在10－26℃下，反應(yīng)0.5-8小時(shí)第四十五頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/15453、重組DNA分子的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化；將重組DNA分子導(dǎo)入到宿主細(xì)胞過(guò)程。Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化：重組分子與宿主細(xì)胞在CaCl2中混合，冰浴30min，42℃熱擊（90s），冷卻3min。PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，電穿孔轉(zhuǎn)化,基因槍轉(zhuǎn)化，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化等。第四十六頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/15464、轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)宿主細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)化后立即進(jìn)行短時(shí)間的培養(yǎng)，使細(xì)胞增殖達(dá)到一定數(shù)目，以利于篩選和鑒定。第四十七頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/15475、重組子的篩選與鑒定從混合體系中把期望重組子（只含有目標(biāo)基因的重組子）分離出來(lái)，去除其他非期望重組子和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞。載體遺傳標(biāo)記篩選：抗生素抗性篩選，營(yíng)養(yǎng)缺陷性篩選，α互補(bǔ)篩選法，噬菌斑篩選法目標(biāo)基因序列的檢測(cè)：菌落原位雜交，測(cè)序測(cè)定，產(chǎn)物檢測(cè)。第四十八頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/15487.3.2Shuffling技術(shù)反復(fù)重組和篩選的循環(huán)過(guò)程:一組相關(guān)基因的隨機(jī)片段（來(lái)自不同種類(lèi)生物，具有相關(guān)功能的基因）無(wú)引物PCR方式重新組合，裝配新功能重組基因。酶切這些基因成片段，再一次重組成新組合基因，重復(fù)這一過(guò)程，一直到具有高品質(zhì)的蛋白質(zhì)產(chǎn)生第四十九頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/1549DNA改組過(guò)程模擬示意圖第五十頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/1550hybridprotoplastprogenyhybridcellGenomeshuffling第五十一頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/15517.4.1概述7.4生物制造第五十二頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/15527.4生物制造生物制造（Bio-Manufacturing）是基因技術(shù)的具體產(chǎn)品應(yīng)用和工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)，包括生物制造的新產(chǎn)品、新工藝、新技術(shù)。三個(gè)方面，仿生設(shè)計(jì)、生物制造工程和生物過(guò)程加工工程。2004年成立中國(guó)機(jī)械工程學(xué)會(huì)生物制造工程分會(huì)，其應(yīng)用在醫(yī)學(xué)界和生物界。第五十三頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/15531、仿生設(shè)計(jì)仿生學(xué)，借鑒生物某些特殊功能，改善機(jī)器設(shè)計(jì)。研究生物、模仿生物的各種特征，生物的自組織、自生長(zhǎng)、遺傳等特性和規(guī)律，啟迪制造，形成新的制造技術(shù)原理。仿生原理的應(yīng)用促進(jìn)制造技術(shù)的變革。用思維控制的假肢:大腦與機(jī)器融為一體,智能的手臂

第五十四頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/1554永久性人造心臟--25萬(wàn)美元4個(gè)部分組成:金屬鈦制成的心臟本體、一個(gè)微型鋰電池、一個(gè)計(jì)算機(jī)操縱系統(tǒng)以及外接電池組。微型鋰電池和操縱系統(tǒng)植入患者腹腔，提供動(dòng)力。外接電池組通過(guò)安裝在腹部皮膚下能量傳輸裝置對(duì)微型鋰電池進(jìn)行充電。美國(guó)丹佛無(wú)機(jī)醫(yī)藥公司制造，重約兩磅，大小與葡萄柚相仿.美國(guó)，每年約有4000多人需要心臟移植，但捐贈(zèng)者只有2000人第五十五頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/15552、生物制造工程（機(jī)械與材料）生命體的人工制造，制造類(lèi)生物或生物體。組織器官就是各種功能細(xì)胞按特定結(jié)構(gòu)裝配成的復(fù)雜機(jī)器。按照加工材料的生物學(xué)特性分為四個(gè)層次。第一層次：非生物相容性的材料，制造組織或器官的模型，手術(shù)規(guī)劃、模擬及假肢輔助設(shè)計(jì)加工。第二層次：較好的生物相容性但非生物可降解性的材料，在體內(nèi)長(zhǎng)期存在，人工器官或植入物。第三層次：良好生物相容性、生物可降解性的材料，在人體內(nèi)分解、吸收并排出，特定形狀和結(jié)構(gòu)支架。第四層次：細(xì)胞為材料，進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)、定位和三維受控組裝，制造人工活性器官。第五十六頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/15563、生物過(guò)程加工工程

(化工、輕工、材料、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè))利用生物體的合成過(guò)程和生命機(jī)能、活動(dòng)特性進(jìn)行生產(chǎn)制造：化合物（食品、藥物、化學(xué)品、能源、材料）小型器械和元件：制備、加工和信號(hào)檢測(cè)。第五十七頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/15577.4.2藥品與食品制造目前正處于生物醫(yī)藥技術(shù)大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化開(kāi)始階段。研制中藥物超過(guò)2200種，1700余種進(jìn)入臨床試驗(yàn)。2020年之后快速發(fā)展期，成為世界經(jīng)濟(jì)主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)。

藥品市場(chǎng)中，美、歐、日的份額超過(guò)了80%。大跨國(guó)公司主導(dǎo)了世界專(zhuān)利藥市場(chǎng)，20強(qiáng)企業(yè)收入：1994年占50%，2002年到66%。重磅炸彈藥物：2002年全球最暢銷(xiāo)的10種藥物的總銷(xiāo)售額近400億元，占全球藥品銷(xiāo)售額的1/10第五十八頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/15587.4.2微生物發(fā)酵技術(shù)發(fā)酵：利用微生物的生長(zhǎng)繁殖，得到目標(biāo)產(chǎn)物。基本過(guò)程：制備培養(yǎng)基(原料)，發(fā)酵罐中，滅菌。發(fā)酵培養(yǎng)：接種，控制溫度、pH、溶解氧、攪拌、通氣、培養(yǎng)基成分。微生物生長(zhǎng)，同時(shí)生產(chǎn)產(chǎn)品提煉：進(jìn)行分離提取，從發(fā)酵液中獲得相應(yīng)產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)室規(guī)模：罐2-100L第五十九頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/1559工業(yè)規(guī)模發(fā)酵設(shè)備：發(fā)酵罐100T自控室第六十頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/1560發(fā)酵技術(shù)產(chǎn)品藥物：100多種抗生素，10余種氨基酸，維生素，核苷酸和核苷，激素酶、酶抑制劑，核苷酸和核苷，免疫調(diào)節(jié)劑和受體拮抗劑，疫苗。大腸桿菌：干擾素，胰島素，生長(zhǎng)素酵母：乙肝疫苗工業(yè)產(chǎn)品：有機(jī)溶劑和有機(jī)酸，酶制劑，糖類(lèi)、單細(xì)胞蛋白、生物轉(zhuǎn)化、工業(yè)酶類(lèi)。食品：飲料、調(diào)味品第六十一頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/15617.4.3動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)昆蟲(chóng)細(xì)胞：診斷試劑哺乳動(dòng)物細(xì)胞：干擾素，紅細(xì)胞生成素，集落刺激因子，病毒疫苗雜交瘤細(xì)胞：抗體雞胚細(xì)胞：疫苗單細(xì)胞培養(yǎng)：皮膚移植。第六十二頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/1562動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器蛋白質(zhì)藥物疫苗第六十三頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/1563轉(zhuǎn)基因技術(shù)在細(xì)胞、組織或整體水平上，利用物理、化學(xué)或生物學(xué)等手段導(dǎo)入外源基因或外源DNA，從而使受體基因組發(fā)生改變的一種方式。將人工分離和修飾過(guò)的基因?qū)氲缴矬w基因組中，由于導(dǎo)入基因的表達(dá)，引起生物體的性狀的可遺傳的修飾。轉(zhuǎn)基因是通過(guò)基因的操作，將一種基因（來(lái)源于植物、動(dòng)物、微生物或人工合成物）運(yùn)送到另一種生物上，因而使后者獲得新的特征。這種技術(shù)可突破物種界限，從DNA分子水平上有目的地、有效地改造生物。第六十四頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/1564為了得到需要的物種，將一種物種的基因植入另外一種物種后獲得的新物種+耐寒草莓=45

極地魚(yú)基因草莓第六十五頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日7.4.4轉(zhuǎn)基因植物

（1）轉(zhuǎn)基因植物的培育過(guò)程：構(gòu)建植物表達(dá)的載體：基因工程技術(shù)。外源DNA導(dǎo)入植物：花粉管通道法，基因槍?zhuān)r(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化篩選與培育：形成植株外植體愈傷組織細(xì)胞系植株第六十六頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/1566(2)基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法利用火藥爆炸或高壓氣體加速（這一加速設(shè)備被稱(chēng)為基因槍?zhuān)?，將包裹了帶目的基因的DNA溶液的高速微彈直接送入完整的植物組織和細(xì)胞中，然后通過(guò)細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出植株，選出其中轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株即為轉(zhuǎn)基因植株。第六十七頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日（2）轉(zhuǎn)基因植物的發(fā)展1983年首例轉(zhuǎn)基因植物煙草120多種植物獲得轉(zhuǎn)基因植株。

農(nóng)戶(hù)：10.3million；國(guó)家：22第六十八頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/1568GlobalAreaofBiotechCropsin2006:byCountry(MillionHectares)RCountryArea(mh)BiotechCrops1*USA54.6Soybean,maize,cotton,canola,squash,papaya,alfalfa2*Argentina18.0Soybean,maize,cotton3*Brazil11.5Soybean,cotton4*Canada6.1Canola,maize,soybean5*India3.8Cotton6*China3.5Cotton7*Paraguay2.0Soybean8*SouthAfrica1.4Maize,soybean,cotton使用基因：抗蟲(chóng);抗除草劑第六十九頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/1569美國(guó)No1加拿大No4阿根廷No2巴西No3中國(guó)No6印度No5第七十頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/1570Goldenrice：

vitaminA轉(zhuǎn)基因小麥轉(zhuǎn)基因水稻正常稻金稻1金稻2

第七十一頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日2023/2/1571轉(zhuǎn)基因技術(shù)大事記（1）1981年，第一次成功地將外源基因?qū)雱?dòng)物胚胎，創(chuàng)立了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)。1982年獲得轉(zhuǎn)基因小鼠。此后相繼培育成功了轉(zhuǎn)基因兔、綿羊、豬、魚(yú)、昆蟲(chóng)、牛、雞、山羊、大鼠等轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

第七十二頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日轉(zhuǎn)基因技術(shù)大事記（2）1983年世界首例轉(zhuǎn)基因植物－含有抗生素藥類(lèi)抗體的煙草培育成功，標(biāo)志著人類(lèi)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良農(nóng)作物的開(kāi)始。第七十三頁(yè)，共八十五頁(yè)，2022年，8月28日轉(zhuǎn)基因技術(shù)大事記(3)1986年抗病毒棉花試驗(yàn)成功，在美國(guó)進(jìn)入田間試驗(yàn)。1987年抗蟲(chóng)基因、耐除草劑基因和番茄成熟控制基因相繼成功地轉(zhuǎn)入作物。1992年美國(guó)建立轉(zhuǎn)基因安全性評(píng)估體系。1993年美國(guó)授予第一個(gè)轉(zhuǎn)基因作物專(zhuān)利。1994年美國(guó)Calgene公司培育的延熟保鮮的轉(zhuǎn)基因番茄被批準(zhǔn)商品化生產(chǎn)