第六章植物基因工程下

第六章植物基因工程下三、改進(jìn)轉(zhuǎn)基因的技術(shù)在轉(zhuǎn)基因研究中經(jīng)常碰到一種引起基因失活的現(xiàn)象稱為基因沉默（genesilencing）?；虺聊梢园l(fā)生在染色體DNA、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后3種不同的層次上：1.發(fā)生在染色體DNA水平上的轉(zhuǎn)基因沉默叫位置效應(yīng)；2.發(fā)生在RNA轉(zhuǎn)錄水平上的轉(zhuǎn)基因沉默叫轉(zhuǎn)錄失活；3.發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平的轉(zhuǎn)基因沉默叫共抑制。（一）轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的沉默1.位置效應(yīng)位置效應(yīng)是指基因受寄主染色體基因組上的插入部位及周圍核苷酸組成的影響。如果整合發(fā)生在轉(zhuǎn)錄活躍的常染色體上，毗鄰寄主基因的調(diào)控系列將影響到外源基因的表達(dá)；如果插入到重復(fù)DNA或異染色體中或旁邊，外源基因可能會(huì)失活。2.DNA甲基化植物DNA甲基化程度是較高的，核基因組中幾乎20%-30%的胞嘧啶處于甲基化狀態(tài)。外源基因編碼區(qū)域的甲基化對(duì)基因表達(dá)的作用不明顯，通常檢測(cè)不到對(duì)轉(zhuǎn)錄的影響；外源基因啟動(dòng)子區(qū)域或5’端非編碼區(qū)域的甲基化會(huì)引起啟動(dòng)子失活或不能起始轉(zhuǎn)錄，在轉(zhuǎn)錄水平上誘導(dǎo)了外源基因的沉默。3.重復(fù)序列誘發(fā)基因沉默通過電擊法等將DNA直接導(dǎo)入植株，外源基因往往以多拷貝串聯(lián)的方式整合在寄主的基因組內(nèi)。重復(fù)序列誘發(fā)的基因沉默（repeatinducedgenesilencing,RIGS）與重復(fù)序列間的異位配對(duì)和DNA的甲基化相關(guān)。一般一個(gè)位點(diǎn)插入的外源基因的拷貝數(shù)越多，失活的程度越高。3.重復(fù)序列誘發(fā)基因沉默解決方案有：對(duì)外源基因及啟動(dòng)子進(jìn)行改造，保證設(shè)計(jì)的序列與植物基因組有很短的同源序列，避免異位配對(duì)的發(fā)生；使用基因槍法及電擊法等直接DNA導(dǎo)入法容易引起多拷貝基因的插入，而使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法可在一定的程度上避免多拷貝基因的插入；在篩選作為育種材料的轉(zhuǎn)基因植物時(shí)，盡量選擇單拷貝插入的個(gè)體，采用RT-PCR法可以篩選到單拷貝插入的個(gè)體。4.共抑制共抑制是一種基因間相互作用引起的沉默現(xiàn)象。當(dāng)引入一個(gè)與植物內(nèi)源基因有部分同源性的DNA時(shí)，不但外源基因不能高效表達(dá)，反而抑制了內(nèi)源基因的表達(dá)。二、提高外源基因表達(dá)水平的策略1.轉(zhuǎn)化方法的影響基因直接轉(zhuǎn)化法容易引起多拷貝轉(zhuǎn)基因在寄主細(xì)胞中的整合，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因沉默，而農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法由于產(chǎn)生的拷貝數(shù)相對(duì)較少，可以在一定的程度上避免這個(gè)問題。2.使用信號(hào)肽植物蛋白質(zhì)分子的定向運(yùn)輸需要特殊多肽信號(hào)的引導(dǎo)作用。為提高轉(zhuǎn)基因在植物的專門組織中的表達(dá)，除使用專門的啟動(dòng)子外，使用特定的信號(hào)肽序列是必需的。3.選擇強(qiáng)啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子選擇合適的植物啟動(dòng)子是增強(qiáng)外源基因表達(dá)的一個(gè)有效手段。通常來源于雙子葉植物的啟動(dòng)子，在雙子葉植物中的表達(dá)效率要比在單子葉植物中高得多，反之亦然。有時(shí)人們并不需要外源基因在受體植物中的高效表達(dá)，而要求其能夠在轉(zhuǎn)基因植物中實(shí)現(xiàn)特異的時(shí)空表達(dá)。這就需要使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其在特定的條件下誘導(dǎo)在某些器官組織中特異性地啟動(dòng)目的基因的表達(dá)。4.強(qiáng)終止子在植物轉(zhuǎn)化的研究中，兩個(gè)常用的終止子是CaMV35S啟動(dòng)子和根瘤土壤桿菌T-DNA的胭脂氨基酸合成酶基因的nos終止子。其PolyA尾巴和其中的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，可有效地抵御核酸酶的水解作用，使mRNA分子保持穩(wěn)定性。5.消除甲基化的影響已知用5-氮胞嘧啶處理植株具有很好的抑制甲基化和脫甲基化作用。人們還試圖在載體上加上去甲基化功能的序列來防止甲基化。6.使用植物偏愛的密碼子轉(zhuǎn)基因的密碼子和植物基因組DNA的不同容易引起甲基化和表達(dá)效率低。在遺傳轉(zhuǎn)化前有必要優(yōu)化轉(zhuǎn)基因的密碼子，盡量使用一些植物偏愛的密碼子。7.使用MAR序列基質(zhì)結(jié)合區(qū)（matrixattachmentregion,MAR）也叫核骨架結(jié)合區(qū)（scaffoldattachmentregion,SAR）長(zhǎng)度一般為300-1000bp，它可以與核骨架結(jié)合，在兩個(gè)MAR間的染色質(zhì)區(qū)域可形成DNA環(huán)，環(huán)的大小為5-200kb，每一個(gè)環(huán)為一個(gè)獨(dú)立的表達(dá)結(jié)構(gòu)。利用MAR的這一特性，可創(chuàng)造一個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域，減少了插入位點(diǎn)附近染色質(zhì)的影響，從而可以避免位置效應(yīng)的影響，還可以提高外源基因在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的穩(wěn)定性和表達(dá)水平。8.使用增強(qiáng)子動(dòng)物免疫球蛋白K鏈基因的增強(qiáng)子可在細(xì)胞發(fā)育的特定階段指導(dǎo)該基因區(qū)段的去甲基化，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄。在植物中分離相應(yīng)的增強(qiáng)子，并和外源基因重組，可確保轉(zhuǎn)基因按合適的調(diào)控模式表達(dá)。9.外源基因的修飾和改造（1）避免基因間的同源性；（2）避免重復(fù)序列的出現(xiàn)；（3）在載體上加增強(qiáng)翻譯序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。（1）避免基因間的同源性重復(fù)或同源序列是基因沉默的誘因，在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，應(yīng)盡量降低所設(shè)計(jì)的序列與內(nèi)源基因的同源性，以減少或避免配對(duì)。應(yīng)盡量使外源DNA堿基組成與植物DNA堿基組成一致，避免被植物限制修飾機(jī)制所識(shí)別。也可采用定點(diǎn)插入方法，將外源基因插入到具有與其相似堿基組成的染色體區(qū)域。（2）避免重復(fù)序列的出現(xiàn)在篩選作為育種材料的轉(zhuǎn)基因植物時(shí)，應(yīng)盡量選擇單拷貝插入的個(gè)體，來減少重復(fù)序列的存在。（3）在載體上加增強(qiáng)翻譯序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)基因5’端和3’端非翻譯序列及密碼子周邊序列都影響到基因的高效表達(dá)。起始密碼子周邊序列對(duì)翻譯水平有明顯影響，通常植物起始密碼子周邊序列有如下特征：AACAAUGGC，起始甲硫氨酸后緊跟丙氨酸。10.以葉綠體作為轉(zhuǎn)化受體葉綠體的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制類似于原核生物，在葉綠體內(nèi)的轉(zhuǎn)化有如下優(yōu)點(diǎn)：A.可能大量表達(dá)外源基因；B.葉綠體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，背景清楚，便于體外遺傳操作；C.能更有效的控制外源基因，防止向環(huán)境釋放。11.使用一些病毒編碼蛋白最近研究證明一些病毒能編碼某種抑制寄主基因沉默的蛋白質(zhì)?？寺∵@些蛋白的基因，改造后與目的基因相連，轉(zhuǎn)入植物時(shí)同時(shí)表達(dá)，可在一定程度上抑制基因沉默的出現(xiàn)。12.在有性生殖后代中篩選單拷貝植株可在分子水平和育種過程中篩選單拷貝的轉(zhuǎn)基因植株，通過PCR技術(shù)、Southern雜交等方法進(jìn)行篩選。四、農(nóng)作物基因工程（一）利用轉(zhuǎn)基因植物來生產(chǎn)蛋白藥物哺乳類動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生蛋白藥物極其昂貴，而植物生長(zhǎng)成本較低可換得大量蛋白質(zhì)藥物。在實(shí)驗(yàn)室里進(jìn)行的有：如人的腦腓肽、人血清蛋白、及小鼠的單克隆抗體等。例如將小鼠的抗體輕鏈和重鏈基因分別在兩種煙草植物中表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植物由根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化方法構(gòu)建。然后兩種植物品系雜交，產(chǎn)生的子代植物表達(dá)小鼠的重鏈輕鏈兩種蛋白。從煙草的葉子里可檢測(cè)到完整的抗體分子，含量為葉細(xì)胞蛋白總量的1.5%。（二）抗蟲轉(zhuǎn)基因作物天然的微生物殺蟲劑如蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthurigiensis,Bt），該細(xì)菌能產(chǎn)生晶體毒蛋白，對(duì)許多昆蟲的幼蟲有毒性，但對(duì)成蟲和脊髓動(dòng)物無作用。Bt合成的只是無活性的毒素原蛋白。幼蟲接觸毒素原蛋白后，其消化道中的蛋白酶便將毒素原蛋白水解成毒性片段，并與幼蟲中腸細(xì)胞表面的受體結(jié)合，從而干擾細(xì)胞的正常功能。最近含修飾的Bt毒蛋白的轉(zhuǎn)基因棉花已問世。（三）抗病毒作物轉(zhuǎn)基因植物利用一些病毒包衣蛋白基因構(gòu)建了抗病毒優(yōu)良品種，如：煙草花葉病毒基因組編碼四種多肽：兩個(gè)復(fù)制酶亞基、一個(gè)包衣蛋白、一個(gè)與細(xì)胞結(jié)合有關(guān)的蛋白。由根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化構(gòu)建了表達(dá)。TMV包衣蛋白CP的轉(zhuǎn)煙草植物，該轉(zhuǎn)基因植物在TMV存在時(shí)，能抗病毒感染30天左右，正常植物3~4天之后使被TMV感染。最近的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CP表達(dá)抵御病毒侵襲也在其它谷物中成功，如馬鈴薯、番茄、苜蓿等。（四）抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物

雜草的存在可使農(nóng)作物減產(chǎn)10%。（1）強(qiáng)化表達(dá)除草劑的靶蛋白（酶）基因：

5-烯醇式丙酮莽草酸－3－磷酸鹽合成酶（EPSPS），是植物葉綠體中芳香族必需氨基酸生物合成中的一個(gè)酶，而除草劑glyphosate通過抑制該酶而殺死植物的。很少的劑量就能殺滅廣譜雜草。將來自矮牽?；ǖ腅PSPScDNA轉(zhuǎn)入植物中，轉(zhuǎn)基因酶活比非轉(zhuǎn)基因植物提高了20倍，使得轉(zhuǎn)基因植物較好地耐受glyphosate的存在。

（2）表達(dá)除草劑的突變靶蛋白（酶）基因：溴腈衍生物（Bromoxynil）是一種抑制光合成反應(yīng)的除草劑，Klebsiellaozaenae有一基因編碼一種腈水解酶，能將Bromoxynil降解為3,5-二溴-4-羥-苯甲酸。將該基因轉(zhuǎn)入煙草中已獲成功。（四）抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物

環(huán)境大氣層中的氧自由基（超氧化物負(fù)離子）對(duì)植物的損傷是嚴(yán)重的。在生理狀況下，植物體內(nèi)的超氧化歧化酶（SOD）將之轉(zhuǎn)化為過氧化氫，后者經(jīng)過過氧化氫酶作用后，分解釋放出水和氧氣。但過量的氧自由基則對(duì)植物的某些組織如花卉的壽命有所影響。將SOD基因轉(zhuǎn)入花卉植物中，可以節(jié)省氧氣的需求量，以增加鮮花的保存期。另外，抗鹽、抗堿、抗寒、抗旱抗熱的轉(zhuǎn)基因植物也在研究中。（五）抗環(huán)境壓力的轉(zhuǎn)基因作物五、轉(zhuǎn)基因植物的安全性

從20世紀(jì)70年代重組DNA技術(shù)創(chuàng)建到1983年第一株轉(zhuǎn)基因煙草獲得以來，國(guó)際上對(duì)轉(zhuǎn)基因作物就存在著截然不同的觀點(diǎn)。

有人認(rèn)為轉(zhuǎn)基因作物造福于人類；有人認(rèn)為轉(zhuǎn)基因作物可能給人類帶來環(huán)境、健康與生態(tài)的危險(xiǎn)；

基因工程技術(shù)在整個(gè)世界引起極大的關(guān)注與爭(zhēng)議，并且隨著轉(zhuǎn)基因作物的成功獲得、商品化、負(fù)面現(xiàn)象頻繁出現(xiàn)等，甚至有完全拒絕轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)入市場(chǎng)的舉措.（一）轉(zhuǎn)基因植物的安全性評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)相關(guān)事件①紐約大學(xué)研究人員發(fā)現(xiàn)，在室內(nèi)種植的轉(zhuǎn)基因B2玉米植株中的殺蟲毒素可以滲入到土壤中，在玉米根系周圍土壤提取物中仍含有Bt毒素，可以