醫(yī)學微生物學課件：實驗課4 腸道桿菌

實驗四腸道桿菌一、了解腸道桿菌的形態(tài)及染色性二、熟悉腸道桿菌的培養(yǎng)特性三、掌握腸道桿菌的生化反應特點

四、掌握血清學試驗（玻片凝集、Widaltest）腸道桿菌的形態(tài)（革蘭染色）糞便標本中沙門菌的分離與鑒定

糞便標本分離培養(yǎng)（SS、EMB/MAC、BAP）可疑菌落初步鑒定：TSI、KIA/MIU、IMViC多價血清（A-F分群）最后鑒定全套生化反應藥敏試驗報告結(jié)果說明：BAP，血瓊脂平板；EMB，伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基；MAC，麥康卡瓊脂；TSI，三糖鐵瓊脂；KIA/MIU，克氏雙糖/動力試驗,吲哚、尿酶試驗管伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基（簡稱EMB）成分：肉膏湯瓊脂（pH7.6）100ml磷酸氫二鉀0.2g

乳糖 1g2%伊紅水溶液（滅菌） 2ml0.5%美蘭水溶液（滅菌 1ml功能：金黃色葡萄球菌不生長；大腸埃希菌菌落呈紫紅色，有時呈現(xiàn)金屬光澤；傷寒沙門菌菌落呈灰白色或無色。大腸桿菌（EMB培養(yǎng)基）腸道致病菌（EMB培養(yǎng)基）SS瓊脂培養(yǎng)基成份：肉膏湯瓊脂 100ml

乳糖 1g

膽鹽 0.85g

枸椽酸鈉0.85g

硫代硫酸鈉 0.85g10%枸椽酸鐵水溶液1ml1％中性紅水溶液 0.25ml1％煌綠水溶液0.033ml功能：抑制大腸埃希菌的生長；傷寒沙門菌、福氏志賀菌生長良好。腸道致病菌（SS培養(yǎng)基）腸道非致病菌（SS培養(yǎng)基）鐵質(zhì)雙糖瓊脂培養(yǎng)基（簡稱KIkligleriron）成份：蛋白胨 2g

氯化鈉0.5g

葡萄糖0.1g

乳糖 1g

枸椽酸鐵銨0.05g

硫代硫酸鈉0.075g

瓊脂1.5g 0.2%酚紅 1.25ml

蒸餾水100ml

腸道桿菌在KI培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特性說明：C對照組；1腸道非致病菌；2志賀菌；3沙門菌；4/4A大腸桿菌；5變形桿菌。該培養(yǎng)基有助于腸道可疑細菌的初步鑒定，酚紅為指示劑。當細菌分解乳糖大量產(chǎn)酸，會使培養(yǎng)基變黃色。如果只分解葡萄糖，產(chǎn)酸量少，只是試管底部變黃。如果產(chǎn)生硫化氫，與鐵反應，生成黑色沉淀，培養(yǎng)基變?yōu)楹谏?。如果產(chǎn)酸產(chǎn)氣，在試管底部產(chǎn)生氣泡，可將培養(yǎng)基頂起。生化反應-單糖發(fā)酵(sugarfermentation)如：葡萄糖及乳糖發(fā)酵實驗目的了解糖發(fā)酵試驗方法

實驗材料

菌種：大腸桿菌、傷寒桿菌、痢疾桿菌培養(yǎng)物

培養(yǎng)基：乳糖及葡萄糖發(fā)酵管

實驗方法用接種環(huán)將大腸桿菌、傷寒桿菌分別接種于葡萄糖及乳糖發(fā)酵管中。

37℃孵育18~24小時，取出觀察結(jié)果。溴甲酚紫[pH5.2（黃色）～6.8（紫色）]，當發(fā)酵產(chǎn)酸時，可使培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色。

生化反應——吲哚試驗（indoletest）原理：有些細菌具有色氨酸酶，能夠分解色氨酸生成吲哚，吲哚再與對二甲基氨基苯甲醛作用，形成玫瑰吲哚，呈現(xiàn)紅色。方法：將待檢菌接種至蛋白胨水培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)1-2天，沿管壁徐徐加入柯凡克0.5ml，即刻觀察結(jié)果。結(jié)果觀察：液面交界處呈紅色著為陽性，無紅色者為陰性。菌名葡萄糖甘露醇乳糖靛基質(zhì)甲基紅VP試驗枸椽酸鹽硫化氫尿素分解動力福氏志賀菌++－－/++－－－－－傷寒沙門菌++－－+－－/++－+乙型副傷寒沙門菌⊕⊕－－+－－++－+大腸桿菌⊕⊕⊕++－－－－+產(chǎn)氣桿菌⊕⊕⊕－－++－－+普通變形桿菌⊕－－++－－/+++++常見腸道桿菌的生化反應鑒別表動力檢測血清學鑒定-玻片凝集

(一)實驗目的與原理用已知抗體（診斷血清）鑒定未知抗原（待檢病原菌）(二)實驗材料1、抗體1:10稀釋的痢疾桿菌診斷血清。2、抗原:待檢病原菌24小時斜面培養(yǎng)物。3、其它:生理鹽水、載玻片、接種環(huán)等(三)實驗方法玻片凝集試驗操作程序與結(jié)果方法：取一潔凈載玻片，用接種環(huán)取待檢菌培養(yǎng)物，分別與診斷血清和生理鹽水混勻，輕輕晃動玻片數(shù)次。1-3分鐘后觀察結(jié)果。結(jié)果觀察：陽性—待檢菌明顯凝集，對照菌均勻渾濁；陰性—待檢菌與對照菌均渾濁。試管凝集-Widaltest(一)實驗目的與原理用已知的傷寒桿菌O、H抗原和甲、乙、丙型副傷寒桿菌H抗原，與患者血清作定量凝集試驗，以檢測患者血清中有無相應抗體，根據(jù)抗體含量及增長情況，可輔助診斷傷寒及副傷寒。(二)實驗材料試管，吸管。生理鹽水，病人血清，傷寒桿菌O抗原和H抗原，甲型、乙型、丙型副傷寒桿菌H抗原。(三)實驗方法

取小試管30支，于試管架上排成5排，每排6支，并分別標記血清稀釋度及種類于試管上。每支試管中分別加入生理鹽水0.5ml。吸取1:10稀釋血清2.5ml分別加入各排第1管中，每管0.5ml。于第1排第1管內(nèi)用1ml吸管吸吹三次充分混勻，再吸出0.5ml到第2管作等倍稀釋，并依次類推直至第5管為止。再從第5管吸出0.5ml棄去。后4排稀釋方法相同。每排各管的血清稀釋度分別為1:20，1:40，1:80，1:160，1：320。每排第6管不加血清，作為對照。加入抗原第1排各管加傷寒桿菌O抗原0.5ml；第2排各管加傷寒桿菌H抗原0.5ml；第3排各管加甲型副傷寒桿菌（A）抗原0.5ml；第4排各管加乙型副傷寒桿菌（B）抗原0.5ml；第5排各管加丙型副傷寒桿菌（C）抗原0.5ml。此時各管的病人血清稀釋度又增加一倍，依次為1:40，1:80，1:160,1:320，1:640，每管總量1.0ml。輕輕振蕩混勻，置37℃溫箱中18～24h，取出觀察并記錄結(jié)果。觀察結(jié)果：先觀察對照管，應無凝集現(xiàn)象。再從各排第1～5管依次觀察，以能出現(xiàn)明顯凝集現(xiàn)象（＋＋）的血清最高稀釋度，即為該血清對某種抗原的凝集效價。“H”抗原呈絮狀凝集，“O”抗原呈顆粒狀凝集。分別記錄結(jié)果，并進行分析。O凝集價≥

1：80H凝集價≥

1：160副傷寒H凝