牛奶中酪蛋白的分離與鑒定

牛奶中酪蛋白的分離與鑒定第一頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1牛奶中水分含量的測(cè)定2牛奶中粗脂肪的提取與測(cè)定3牛奶中酪蛋白的提取4蛋白質(zhì)含量的測(cè)定第二頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日（1）牛奶中水分含量的測(cè)定

水分是食品分析的重要項(xiàng)目之一。水分測(cè)定對(duì)于計(jì)算生產(chǎn)中的物料平衡，和實(shí)行工藝監(jiān)督等方面，有很重要的意義。各種食品水分的含量差別很大。例如，鮮果為69.7%-92.5%，鮮菜為79.7%-97.1%，鮮瘦肉52.6-77.4%，面粉12-14%。面包水分隨品種不同略有差異，一般為32-42%水分測(cè)定法通?？煞譃橹苯臃ê烷g接法兩類。利用水分本身的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)測(cè)定水分的方法，叫做直接法，如重量法，蒸餾法和卡爾.費(fèi)休法等；利用食品的比重，折射率，電導(dǎo)，介電常數(shù)等物理性質(zhì)測(cè)定水分的方法，叫做間接法。測(cè)定水分的方法要根據(jù)食品的性質(zhì)和測(cè)定目的來(lái)選定第三頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日一重量法凡操作過(guò)程中包括有稱量步驟的測(cè)定方法，統(tǒng)稱為重量法，如烘箱干燥法，紅外線干燥法，干燥劑法等。

烘箱干燥法在一定溫度和壓力條件下，將樣品加熱干燥，以排除其中水分的方法，叫做烘箱干燥法。它包括常壓烘箱法和真空烘箱干燥法。這種測(cè)定方法費(fèi)時(shí)長(zhǎng)，但操作簡(jiǎn)便，應(yīng)用范圍較廣。

應(yīng)用本法測(cè)定水分的樣品應(yīng)符合下述條件：

(1)水分是唯一的揮發(fā)物質(zhì)；

(2)水分的排除情況很完全；

(3)食品中其他組分在加熱過(guò)程中由于發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而引起的重量變化可以忽略。第四頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日二材料與儀器材料全脂牛奶

層析濾紙器材常壓電熱烘箱

干燥器

電子分析天平第五頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日三操作步驟

取一張12cm*12cm70℃過(guò)夜烘干的層析濾紙，稱重，記為m1。準(zhǔn)確稱取一定量牛奶m2，滴于濾紙上，70℃烘干后稱重，記為m3。計(jì)算水分含量。干物質(zhì)質(zhì)量m4=m3-m1水分含量（%）=（m2-m4）/m2×100第六頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日（2）粗脂肪的定量測(cè)定─索氏提取法一、目的要求學(xué)習(xí)和掌握粗脂肪的定量測(cè)定法─索氏提取法第七頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日二、原理脂肪是丙三醇(甘油)和脂肪酸結(jié)合成的脂類化合物,能溶于脂溶性有機(jī)溶劑。本實(shí)驗(yàn)用重量法，利用脂肪能溶于脂溶性溶劑這一特性，用脂溶性溶劑將脂肪提取出來(lái)，借蒸發(fā)除去溶劑后稱量。整個(gè)提取過(guò)程均在索氏提取器中進(jìn)行。通常使用的脂溶性溶劑為乙醚或沸點(diǎn)為30oC-60oC的石油醚。用此法提取的脂溶性物質(zhì)除脂肪外，還含有游離脂肪酸、磷酸、固醇、芳香油及某些色素等，故稱為“粗脂肪”。第八頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日

三、適用范圍與特點(diǎn)

適用于脂類含量較高，結(jié)合態(tài)脂類含量少或經(jīng)水解處理過(guò)的，（結(jié)合態(tài)已轉(zhuǎn)變成游離態(tài)），樣品應(yīng)能烘干，磨細(xì)，不易吸濕結(jié)塊。此法經(jīng)典，對(duì)大多數(shù)樣品的測(cè)定結(jié)果比較可靠。但費(fèi)時(shí)長(zhǎng)（8—16h）溶劑用量大，需要專門的儀器,索氏提取器。

第九頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日四材料、試劑與器材材料：全脂牛奶試劑：乙醚器材：索氏提取器、干燥箱、電子分析天平第十頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日索氏提取器構(gòu)造第十一頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日五、操作方法

1抽提筒的準(zhǔn)備

2抽提

將測(cè)定完水分帶有干物質(zhì)的濾紙折成小包放入抽提筒，再放入索氏抽提器內(nèi)，連接已干燥至恒重（m5）的脂肪接受瓶，由冷凝管上端加入無(wú)水乙醚，加量為接受瓶的2／3體積，于60℃水浴上加熱，使乙醚不斷的回流提取，一般視含油量高低提取6—12小時(shí)，至抽提完全為止（用濾紙?jiān)嚕?。第十二?yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日3

稱重取下接受瓶，回收乙醚，待接受瓶?jī)?nèi)乙醚剩1～2ml時(shí)，在水浴上蒸干，再于100～105℃干燥2小時(shí)，取出放干燥器內(nèi)冷卻30分鐘，稱重，并重復(fù)操作至恒重（m6）。取出濾紙包，于戶外晾至無(wú)乙醚味，置入恒溫箱內(nèi)，烘干，然后移入干燥缸內(nèi)冷卻后稱重，重復(fù)操作至恒重（m7）。第十三頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日六

結(jié)果處理方法一脂肪(％)＝(m6-m5)/m4×100m6——接受瓶和脂肪的質(zhì)量，g；m5——接受瓶的質(zhì)量，g；m4——樣品的質(zhì)量(如為測(cè)定水分后的樣品質(zhì)量計(jì))，g。

方法二脂肪(％)＝(m3-m7)/m4×100m3——未抽提濾紙包的質(zhì)量，g；m7——抽提后濾紙包的質(zhì)量，g；m4——樣品的質(zhì)量(如為測(cè)定水分后的樣品質(zhì)量計(jì))，g。第十四頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日七、注意事項(xiàng)乙醚為易燃有機(jī)溶劑，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保持通風(fēng)并禁止任何明火。抽提用的乙醚或石油醚要求無(wú)水、無(wú)醇、無(wú)過(guò)氧化物，揮發(fā)殘?jiān)康?。因水和醇可?dǎo)致水溶性物質(zhì)溶解，如水溶性鹽類、糖類等，使得測(cè)定結(jié)果偏高，被測(cè)樣品也要事先烘干。過(guò)氧化物會(huì)導(dǎo)致脂肪氧化，在烘干時(shí)也有引起爆炸的危險(xiǎn)。裝樣品的濾紙筒一定要嚴(yán)密，不能往外漏樣品，也但不要包得太緊影響溶劑滲透。放入濾紙筒時(shí)高度不要超過(guò)回流彎管，否則超過(guò)彎管的樣品中的脂肪不能提盡，造成誤差。第十五頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日八、思考題(1)

本實(shí)驗(yàn)制備得到的是粗脂肪,若要制備單一組分的脂類成分,可用什么方法進(jìn)一步處理？(2)

本實(shí)驗(yàn)樣品制備時(shí)烘干為什么要避免過(guò)熱第十六頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日（3）酪蛋白的提取一、目的要求掌握一種提取酪蛋白的方法掌握一種檢測(cè)牛乳質(zhì)量的方法第十七頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日二實(shí)驗(yàn)原理酪蛋白是乳蛋白質(zhì)中最豐富的一類蛋白質(zhì)，占乳蛋白的80%~82%，酪蛋白不是單一的蛋白質(zhì)，是一類含磷的復(fù)合蛋白質(zhì)混合物，以一磷酸酯鍵與蘇氨酸及絲氨酸的羥基相結(jié)合。它還含有胱氨酸和蛋氨酸這兩種含硫氨基酸，但不含半胱氨酸。它在牛乳中的含量約為35g/L，比較穩(wěn)定，利用這一性質(zhì)可以檢測(cè)牛乳中是否摻假。酪蛋白在其等電點(diǎn)時(shí)由于靜電和為零，同種電荷間的排斥作用消失，溶解度很低，利用這一性質(zhì)，將牛乳調(diào)到pH4.6，酪蛋白就可從牛乳中分離出來(lái)。酪蛋白不溶于乙醇，這個(gè)性質(zhì)被用來(lái)從酪蛋白粗制劑中將脂類雜志除去。第十八頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日三儀器、原料和試劑儀器：溫度計(jì)、布氏漏斗、pH試紙、抽濾瓶、水浴鍋、燒杯、量筒、表面皿、天平、離心機(jī)等原料：市售全脂牛奶試劑：無(wú)水乙醇、無(wú)水乙醚

pH4.7乙酸鈉緩沖液0.2mol/L

乙醇、乙醚混合液：乙醇:乙醚=1:1（體積比）第十九頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日四實(shí)驗(yàn)步驟1、酪蛋白等電點(diǎn)沉淀將100mL牛乳放到500mL燒杯中，加熱到40℃，加入到同樣40℃的乙酸鈉緩沖液中，調(diào)pH達(dá)4.7。此時(shí)有絮狀的蛋白質(zhì)沉淀析出。將懸浮液冷卻至室溫，室溫放置分層，3000r/min離心15min，收集沉淀。2、水洗將pH4.7醋酸-醋酸鈉緩沖溶液用蒸餾水稀釋10倍，洗滌粗制品三次，分別離心10分鐘，得到沉淀蛋白。3、去脂將粗制品中加入10ml無(wú)水乙醇，攪拌片刻，將全部懸濁液轉(zhuǎn)移至布氏漏斗中，用乙醚-乙醇混合液洗滌沉淀兩次，最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。將沉淀從布氏漏斗中移去，在表面皿上攤開(kāi)以除去乙醚，干燥后得到的是酪蛋白純品。準(zhǔn)確稱重后，計(jì)算出每100mL牛乳所制備出的酪蛋白質(zhì)量（g/100mL），并與理論產(chǎn)量（3.5g/100mL）相比較，求出實(shí)際獲得百分率。第二十頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日五思考題用乙醇、乙醇-乙醚和乙醚洗滌蛋白質(zhì)的順序是否可以變換？為什么？試設(shè)計(jì)一個(gè)利用蛋白質(zhì)其他性質(zhì)提取蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)第二十一頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日六離心機(jī)的使用及注意事項(xiàng)離心機(jī)的工作原理：在離心力場(chǎng)的作用下，可加速懸浮液中固體顆粒沉降或漂浮的速度，從而將不同的物質(zhì)分離。它是生化實(shí)驗(yàn)中提取、分離、純化的常用設(shè)備，操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是平衡。注意事項(xiàng)

1.檢查內(nèi)、外套管應(yīng)完整不漏，洗凈離心管；

2.待離心的物質(zhì)裝入離心管的量不應(yīng)超過(guò)離心內(nèi)套管體積的2/3；

3.將一對(duì)離心管（含內(nèi)、外套管）放在臺(tái)秤上平衡；

4.檢查離心機(jī)正常后，將平衡好的離心管對(duì)稱的放在離心機(jī)中；

5.蓋好離心機(jī)蓋，打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，設(shè)置轉(zhuǎn)速與時(shí)間，開(kāi)始離心。注意一定不能超過(guò)離心機(jī)的最大離心速度！離心結(jié)束后，待離心機(jī)停止運(yùn)轉(zhuǎn)后，再打開(kāi)機(jī)蓋，取出離心管，不許用手強(qiáng)行使離心機(jī)停止轉(zhuǎn)

6．用完后，將內(nèi)外套管洗凈，倒立放置，使其干燥，并在使用的登記薄簽名。

7.使用過(guò)程中，如出現(xiàn)故障，一定請(qǐng)本室的實(shí)驗(yàn)員排除，不許擅自處理第二十二頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日（4）蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定—考馬斯亮藍(lán)染色法一實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)會(huì)用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度第二十三頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日考馬斯亮藍(lán)能與蛋白質(zhì)的疏水微區(qū)結(jié)合，這種結(jié)合具有高敏感性?？捡R斯亮藍(lán)G250的磷酸溶液呈棕紅色，最大吸收峰在465nm。當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物時(shí)呈藍(lán)色，最大吸收峰改變?yōu)?95nm,考馬斯亮藍(lán)G250-蛋白質(zhì)復(fù)合物的高消光效應(yīng)導(dǎo)致了蛋白質(zhì)定量測(cè)定的高敏感度（比Lowry法靈敏4倍）在一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料考馬斯亮藍(lán)結(jié)合符合比爾定律，因此可以通過(guò)測(cè)定染料在595nm處光吸收的增加量得到與其結(jié)合的蛋白質(zhì)量。

二實(shí)驗(yàn)原理

第二十四頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日CoomassieDye-Based蛋白質(zhì)定量PROTEIN+Amax=595nmBLUEAcidCoomassieG-250Protein-DyeComplexOCH2CH3NHCCH3CH3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH2CH3SO3Na+第二十五頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日三實(shí)驗(yàn)試劑與器材

試劑

0.9%NaCl溶液標(biāo)準(zhǔn)蛋白液：牛血清白蛋白（0.1mg/ml）染液：考馬斯亮藍(lán)G250（0.01%）樣品液：酪蛋白溶液器材

漩渦混合器試管吸管容量瓶量筒電子分析天平比色皿

722型分光光度計(jì)第二十六頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日四、操作方法

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取14支試管，分兩組按下表平行操作。試管編號(hào)0123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液(mL)00.10.20.30.40.50.60.9%NaCl溶液（mL）1.00.90.80.70.60.50.4考馬斯亮藍(lán)試劑(mL)4444444蛋白質(zhì)濃度(g/mL)0102030405060A595nm搖勻，1h內(nèi)以0號(hào)試管為空白對(duì)照，在595nm處比色OD595nm以O(shè)D595nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

第二十七頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日2.酪蛋白濃度的測(cè)定

稱取一定量的酪蛋白，用0.9%NaCl溶液溶解定容至一定體積（使其測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線范圍內(nèi)）。測(cè)定方法同上，根據(jù)所測(cè)定的OD595nm值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量，從而計(jì)算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度(g/mL)。第二十八頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日五注意事項(xiàng)（1）如果測(cè)定要求很嚴(yán)格，可以在試劑加入后的5-20min內(nèi)測(cè)定光吸收，因?yàn)樵龠@段時(shí)間內(nèi)顏色最穩(wěn)定。（2）測(cè)定中，蛋白-染料復(fù)合物會(huì)有少部分吸附于比色杯壁上，但此復(fù)合物的吸附量可以忽略。測(cè)定完后可用乙醇將藍(lán)色的比色杯洗干凈。（3）一些陽(yáng)離子如K+、Na+、Mg2+、乙醇等物質(zhì)對(duì)測(cè)定無(wú)影響，而大量的去污劑如SDS等會(huì)嚴(yán)重干擾測(cè)定。第二十九頁(yè)，共三十二頁(yè)，2022年，8月28日六

722型分光光度計(jì)使用方法

1．調(diào)整（1）將靈敏度旋鈕調(diào)至“1”檔（放大倍率最?。?。調(diào)波長(zhǎng)調(diào)節(jié)器至所需波長(zhǎng)。（2）開(kāi)啟電源開(kāi)關(guān)，指示燈亮，選擇開(kāi)關(guān)置于“T”，調(diào)節(jié)透光率[100%T]旋鈕使數(shù)字顯示[100.0]左右，預(yù)熱20min.2．校正（1）打開(kāi)吸收池暗室蓋（光門自動(dòng)關(guān)閉），調(diào)節(jié)[0%T]旋鈕，使數(shù)字顯示為“00.0”，蓋上吸收池蓋，將參比溶液置于光路，使光電管受光，調(diào)節(jié)透光率[100%T]旋鈕，使數(shù)學(xué)顯示為“100.0”。（2）如果顯示不到“100”，則可適當(dāng)增加電流放