2023年實(shí)驗(yàn)新版質(zhì)粒DNA的提取及檢測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

實(shí)驗(yàn)一、質(zhì)粒DNＡ的提取及檢測(cè)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?、掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的原理和環(huán)節(jié)2、掌握瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的方法和技術(shù)3、學(xué)會(huì)PCＲ操作的基本技術(shù)第一部分質(zhì)粒DNA的提取一、實(shí)驗(yàn)原理：堿裂解法提取質(zhì)粒是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DＮA與線性染色體DＮA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來(lái)分離它們。在pＨ值介于1２.0～12.5這個(gè)狹窄的范圍內(nèi),線性的DＮＡ雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性,盡管在這樣的條件下，共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNＡ的氫鍵會(huì)被斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此互相盤繞，仍會(huì)緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入ｐH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復(fù)pＨ至中性時(shí),共價(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒ＤＮA的兩條互補(bǔ)鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，而線性的染色體DNA的兩條互補(bǔ)鏈彼此已完全分開，復(fù)性就不會(huì)那么迅速而準(zhǔn)確,它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),通過(guò)離心,染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RＮA,蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去。二、儀器與試劑1、儀器恒溫?fù)u床、臺(tái)式離心機(jī)2、試劑溶液=１＼*RＯMANI、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、無(wú)水乙醇、ＴE緩沖液、胰RNＡ酶、酚、氯仿三、實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)將2mL含相應(yīng)抗生素（Amｐ:5０μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基加入到試管中，接入含pＵC19質(zhì)粒的大腸桿菌,37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取1.5mL培養(yǎng)物倒入微量離心管中,4000r/ｍin離心2min。吸去培養(yǎng)液,使細(xì)胞沉淀盡也許干燥。將細(xì)菌沉淀懸浮于１0０μL溶液=1\*ＲOＭＡNI中,充足混勻，室溫放置１0min。加200μL溶液Ⅱ（新鮮配制）,蓋緊管皿，混勻內(nèi)容物,將離心管放冰上5min。加入15０μＬ溶液Ⅲ（冰上預(yù)冷),蓋緊管口，顛倒數(shù)次使混勻。冰上放置１5miｎ。12023r/min，離心1５mｉn,將上清轉(zhuǎn)至另一離心管中。向上清中加入等體積酚：氯仿(1：1）（去蛋白)，反復(fù)混勻，1２023r/ｍin，離心5miｎ，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。向上清加入2倍體積無(wú)水乙醇,混勻后,室溫放置5～１0min。12023r/mｉｎ，離心５ｍｉn。倒去上清液,把離心管倒扣在吸水紙上,吸干液體。10、用1mＬ７0℅乙醇洗滌質(zhì)粒ＤNA沉淀,振蕩并離心，倒去上清液,真空抽干或空氣中干燥。１1、加2０μＬTE緩沖液，其中具有20μg/mL的胰RNA酶，使DNA完全溶解,-2０℃保存。第二部分瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DＮA一、實(shí)驗(yàn)原理：DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷,在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的反復(fù)性質(zhì),相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DＮA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即ＤNA分子自身的大小和構(gòu)型。具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段泳動(dòng)速度不同樣,可進(jìn)行分離。DＮA分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳不僅可分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的DＮA，也可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子。如實(shí)驗(yàn)提取的pUＣ１9質(zhì)粒,有3種構(gòu)型：超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DＮA,開環(huán)質(zhì)粒DNＡ,即共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNＡ1條鏈斷裂，線狀質(zhì)粒ＤNＡ,即共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒ＤNA2條鏈發(fā)生斷裂。這3種構(gòu)型的質(zhì)粒DNＡ分子在凝膠電泳中的遷移率不同。因此電泳后呈3條帶,超螺旋質(zhì)粒DNA泳動(dòng)最快，另一方面為線狀DＮA，最慢的為開環(huán)質(zhì)粒DＮA。二、儀器與試劑1、儀器瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)、紫外線透射儀、電爐子2、試劑5×TBE、凝膠加樣緩沖液(６×）、瓊脂糖、溴化乙錠溶液（EB）三、實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)制備瓊脂糖凝膠稱取0.１g瓊脂糖，放入錐形瓶中,加入10mL０.5×ＴBE緩沖液，加熱至完全溶化(加EB)，搖勻,則為1℅瓊脂糖凝膠液。膠板的制備取有機(jī)玻璃內(nèi)槽，洗凈，晾干。將有機(jī)玻璃內(nèi)槽放置于一水平位置，并放好樣品梳子。將冷到6０℃左右的瓊脂糖凝膠液，緩緩倒入有機(jī)玻璃內(nèi)槽,直至有機(jī)玻璃板上形成一層均勻的膠面（注意不要形成氣泡）。待膠凝固后，取出梳子，放在電泳槽內(nèi)。加入電泳緩沖液至電泳槽中。加樣用移液槍將已加入上樣緩沖液的DNA樣品加入加樣孔(記錄點(diǎn)樣順序及點(diǎn)樣量)。電泳接通電泳槽與電泳儀的電源（注意正負(fù)極，DNＡ片段從負(fù)極向正極移動(dòng))。當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動(dòng)到距凝膠前沿1~2cｍ處,停止電泳。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果在紫外燈(２5４nm）下觀測(cè)染色后的電泳凝膠。DNA存在處應(yīng)顯出桔紅色熒光條帶。第三部分PCR擴(kuò)增制備目的基因一、實(shí)驗(yàn)原理：是將待擴(kuò)增的DNA模板加熱變性,與其兩側(cè)互補(bǔ)的寡聚核苷酸引物復(fù)性,然后通過(guò)耐熱的DNA聚合酶延伸。通過(guò)變性—復(fù)性—延伸的ｎ次循環(huán)后，ＤNA可被擴(kuò)增２n倍。二、儀器與試劑１、儀器ＰＣＲ儀2、試劑模板DNA、ＴａqDNA聚合酶、引物、10×Buｆfer、DNAＭarker三、實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)(1)加樣:在０.２ｍlPCＲ微量離心管中配制2５μl反映體系。

ｄｄH2O１５．２5μl

10×PCＲbufｆer2．5μｌ?dNＴP（2.５ｍＭ)３.0μl?10μmol／LＰrimeｒ1（2μM)1．0μl

１0μmol/Lｐrｉｍer2(2μM）1．0μl

模板DNA（含質(zhì)粒)2.0μl

Tａq酶（5U/μｌ）0．25μｌ?總體積2５μl

（２)將PＣR反映體系混勻,按以下循環(huán)條件在基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行ＰＣR循環(huán):

預(yù)變性94℃５min?變性９4℃45s

退火56℃