二細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖消毒與滅菌

細(xì)

菌

感

染

的

檢測(cè)試驗(yàn)二細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖、消毒與滅菌一、探討：1、消毒滅菌的方法、試驗(yàn)室生物平安2、細(xì)菌的人工培育：培育基、細(xì)菌培育技術(shù)、細(xì)菌生長(zhǎng)現(xiàn)象二、示教：1、消毒滅菌的常用方法2、藥敏試驗(yàn)3、培育基制備、種類、用途4、細(xì)菌生長(zhǎng)現(xiàn)象視察三、操作：細(xì)菌的接種（液體、半固體、固體培育基）(一）消毒滅菌方法、試驗(yàn)室生物平安1.常用術(shù)語消毒(disinfection)：利用理化因素殺死物體或環(huán)境中病原微生物的措施。并不確定能殺死含芽胞的細(xì)菌或非病原微生物滅菌(sterilization)：利用理化因素殺死物體上全部微生物的過程，包括芽胞。無菌操作（aseptictechnique)：防止細(xì)菌進(jìn)入人體或其他物品的操作技術(shù)。（2）常用方法物理消毒滅菌法：

熱力滅菌法：干熱滅菌法、濕熱滅菌法輻射殺菌法：電離輻射--X、β、γ射線非電離輻射--紫外線、日光、微波濾過除菌法：濾過除菌法干燥低溫抑菌法：抑菌和滅菌化學(xué)消毒滅菌法：生物消毒滅菌法熱力滅菌法干熱滅菌焚燒、燒灼、紅外線干烤（160~170℃/2h）熱力滅菌法濕熱滅菌巴氏消毒法：62℃30min或72℃30sec煮沸法30min流淌蒸氣消毒法間歇蒸氣滅菌法高壓蒸氣滅菌法：121℃,1.05Kg/cm2(15個(gè)大氣壓),20min輻射殺菌法①電離輻射：X、β、γ射線原理:通過產(chǎn)生OH－、O2等活性游離基進(jìn)行殺菌；通過破壞DNA的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致菌體死亡②非電離輻射：紫外線、微波、超聲波、日光輻射殺菌法：非電離輻射ⅰ.紫外線：200～300nm日光(最佳：265～266nm)原理：導(dǎo)致DNA分子構(gòu)型變更DNA復(fù)制出現(xiàn)差錯(cuò)用途：只用于空氣和物品表面的消毒（留意防護(hù)）ⅱ.微波：細(xì)菌體內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等分子在微波場(chǎng)下高速旋轉(zhuǎn)、振動(dòng)，細(xì)菌蛋白質(zhì)凝固、核酸變性而死亡。常用于對(duì)非金屬器械的消毒，優(yōu)點(diǎn)是無污染而且快速。ⅲ.超聲波是指頻率大于20kHz的聲波，其頻率高，波長(zhǎng)短，定向性好，穿透力強(qiáng)。原理：空化作用用途：液體或可放置液體中不影響其性能的物品濾過除菌法貝克菲濾器蔡氏濾器玻璃濾器膜濾器孔徑0.22um-0.45um除菌空氣過濾器:無菌棉花、活性炭及細(xì)玻璃纖維等可對(duì)空氣進(jìn)行過濾除菌2、化學(xué)消毒滅菌法常用消毒劑(disinfectants)的殺菌機(jī)制使菌體蛋白變性或凝固干擾微生物酶系統(tǒng)和影響其代謝損傷細(xì)胞壁、細(xì)胞膜環(huán)氧乙烷消毒設(shè)備醫(yī)學(xué)上常用消毒劑類型作用機(jī)制及種類類別作用機(jī)制常用種類酚類蛋白變性，細(xì)胞膜損傷石炭酸醇類蛋白變性乙醇氧化劑氧化、蛋白沉淀高錳酸鉀、過氧乙酸、碘酒重金屬鹽氧化、蛋白酶變性紅汞、硫柳汞表面活性劑蛋白變性，細(xì)胞膜損傷新潔而滅染料干擾氧化、抑制繁殖龍膽紫酸堿類破壞膜、壁，蛋白凝固醋酸、生石灰烷化劑蛋白質(zhì)、核酸烷基化環(huán)氧乙烷醛類與氨基結(jié)合,蛋白變性甲醛、戊二醛化學(xué)消毒滅菌法高效消毒劑high-level中效消毒劑intermediate-level低效消毒劑

low-level可殺死包括細(xì)菌芽胞在內(nèi)所有微生物不能殺死芽胞，可殺死細(xì)菌繁殖體、真菌、大多數(shù)病毒可殺死大多數(shù)細(xì)菌繁殖體，對(duì)真菌、病毒殺滅力弱1.含氯消毒劑2.過氧化物消毒劑3.醛類消毒劑4.環(huán)氧乙烷1.含碘消毒劑2.醇類消毒劑1.季銨鹽類2.氯已定3.高錳酸鉀醫(yī)療器械物品的消毒滅菌高危器械物品需進(jìn)入無菌組織的物品。全部這些物品都應(yīng)當(dāng)滅菌。中危器械物品不進(jìn)入無菌組織但接觸黏膜的器械。接受消毒即可。低危器械物品只接觸未損傷皮膚但不進(jìn)入無菌組織和不接觸黏膜的物品。一般用后清洗、消毒即可?？焖僦苻D(zhuǎn)的醫(yī)療器械室內(nèi)空氣消毒滅菌a.物理消毒法紫外線照射（1.5W/m3，1h）最常用；濾過除菌：空氣通過孔徑小于0.2μm的高效過濾裝置以除去細(xì)菌和帶菌塵埃b．化學(xué)消毒法包括化學(xué)消毒劑噴霧和熏蒸過氧乙酸噴霧、熏蒸；過氧化氫噴霧；二氧化氯溶液噴灑；中草藥點(diǎn)燃煙熏手和皮膚的消毒用肥皂和流淌水常常并正確洗手病原微生物污染時(shí)應(yīng)用消毒劑消毒消毒滅菌的方法熱力滅菌法輻射殺菌法濾過除菌法干燥與低溫抑菌法干熱滅菌法濕熱滅菌法物理消毒滅菌法化學(xué)消毒滅菌法高效消毒劑中效消毒劑低效消毒劑3、試驗(yàn)室生物平安生物平安（biosafety）是生物技術(shù)平安的簡(jiǎn)稱狹義的指現(xiàn)代生物技術(shù)的探討、開發(fā)、應(yīng)用及轉(zhuǎn)基因生物可能對(duì)生物多樣性、生態(tài)環(huán)境和人類健康產(chǎn)生潛在的危害。廣義的指與生物有關(guān)的各種因素對(duì)社會(huì)、經(jīng)濟(jì)、人類健康及生態(tài)環(huán)境所產(chǎn)生的危害或潛在風(fēng)險(xiǎn)。（1）生物平安的內(nèi)容轉(zhuǎn)基因生物、外來入侵物種、環(huán)境污染病原微生物（感染性疾病、人畜共患疾病、動(dòng)物疾病、食源性疾病、醫(yī)院感染）試驗(yàn)室泄漏：生物武器、生物恐怖遺傳資源疼惜合成生物技術(shù)轉(zhuǎn)基因及其它新型生物技術(shù)事故引發(fā)的生物危害

是由進(jìn)行病原體探討、教學(xué)、診斷、治療、生物制品研發(fā)和生產(chǎn)等機(jī)構(gòu)的事故導(dǎo)致病原體泄漏，引發(fā)了傳染病暴發(fā)的生物災(zāi)難。這類生物災(zāi)難往往影響較大，危害范圍小，造成局部災(zāi)難大，持續(xù)短1979年，蘇聯(lián)國防微生物與病毒探討所炭疽芽孢干粉制劑車間的加壓系統(tǒng)爆炸，約10公斤芽孢粉劑泄漏，造成斯維爾德洛夫斯克城數(shù)百人傷亡。2003年9月新加坡國立衛(wèi)生探討院BSL－3試驗(yàn)室發(fā)生探討人員感染SRAS病毒的事故。2003年12月我國臺(tái)灣省一試驗(yàn)室也發(fā)生了探討人員感染SRAS病毒的事故，2004年4月我國國家CDC的專業(yè)試驗(yàn)室發(fā)生了SARS的試驗(yàn)室人員感染。（2）如何實(shí)現(xiàn)試驗(yàn)室生物平安？加強(qiáng)管理，規(guī)范行為，消退隱患，確保平安如何管？依法、規(guī)范管理管那些？病原微生物、試驗(yàn)室設(shè)立、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、試驗(yàn)活動(dòng)、試驗(yàn)裝備、廢棄物、人員類別根據(jù)傳染性、感染后對(duì)個(gè)體或者群體的危害程度，第一類能夠引起人類或者動(dòng)物非常嚴(yán)重疾病的微生物，以及我國尚未發(fā)現(xiàn)或者已經(jīng)宣布消滅的微生物。第二類能夠引起人類或者動(dòng)物嚴(yán)重疾病，比較容易直接或者間接在人與人、動(dòng)物與人、動(dòng)物與動(dòng)物間傳播的微生物。第三類能夠引起人或動(dòng)物疾病，但一般情況下對(duì)人、動(dòng)物或環(huán)境不構(gòu)成嚴(yán)重危害，傳播風(fēng)險(xiǎn)有限，實(shí)驗(yàn)室感染后很少引起嚴(yán)重疾病，并且具備有效治療和預(yù)防措施的微生物第四類在通常情況下不會(huì)引起人或動(dòng)物疾病的微生物。如小鼠白血病病毒等病原微生物分類管理病原微生物試驗(yàn)室的分級(jí)管理（二）細(xì)菌的人工培育：培育基的概念、種類、用途細(xì)菌培育技術(shù)細(xì)菌生長(zhǎng)現(xiàn)象1.培育基的概念、種類、用途、制備培育基（culturemedium):是由人工方法配制而成的，專供微生物生長(zhǎng)繁殖運(yùn)用的混合養(yǎng)分物制品?；A(chǔ)培育基增菌培育基選擇培育基鑒別培育基厭氧培育基依據(jù)物理性狀：液體、固態(tài)、半固體依據(jù)用途牛肉膏3.0g

蛋白胨10.0g

氯化氯化鈉（NaCL）5.0g

磷酸二氫鉀（KH2PO4）1.0g

瓊脂15.0g

蒸餾水1000mL

混勻，加熱溶解，調(diào)PH至7.6分裝，112kPa高壓滅菌15min，冷卻至45℃傾注滅菌平板。一般瓊脂平板制備2.細(xì)菌的培育方法分別培育：劃線接種在固體培育基的表面，因劃線的分散作用，使很多原混雜的細(xì)菌在固體培育基表面上散開。純培育：挑取一個(gè)菌落，移種到另一培育基中，可生長(zhǎng)出來的大量的純種細(xì)菌。發(fā)酵培育：在適宜的條件下，發(fā)酵罐中大量培育微生物（細(xì)菌、真菌等）細(xì)胞和生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的工藝過程。分別培育：純培養(yǎng)(pureculture)液體培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基菌落(colony)純培育：菌種篩選搖瓶試驗(yàn)發(fā)酵罐中試驗(yàn)發(fā)酵培育—由試驗(yàn)室探討到產(chǎn)業(yè)化的過程發(fā)酵生產(chǎn)3.培育基中生長(zhǎng)現(xiàn)象：液體培育基菌膜生長(zhǎng)

沉淀生長(zhǎng)

混濁生長(zhǎng)

混濁：大多數(shù)細(xì)菌沉淀：鏈狀生長(zhǎng)的細(xì)菌菌膜：專性需氧菌，如結(jié)核桿菌、枯草桿菌。

有鞭毛的細(xì)菌：試管中沿穿刺線呈羽毛狀或云霧狀混濁生長(zhǎng)；平皿中遷徙樣生長(zhǎng)無鞭毛細(xì)菌：沿穿刺線線狀生長(zhǎng)或無擴(kuò)散生長(zhǎng)現(xiàn)象用于細(xì)菌的動(dòng)力試驗(yàn)無動(dòng)力有動(dòng)力遷徙生長(zhǎng)3.培育基中生長(zhǎng)現(xiàn)象：半固體培育基菌落colony：在固體培育基上，一般經(jīng)18～24小時(shí)培育后，單個(gè)細(xì)菌即可繁殖成一堆肉眼可見的細(xì)菌集團(tuán)。不同細(xì)菌菌落在大小、形態(tài)、顏色、氣味、透亮度、表面光滑/粗糙、潮濕/干燥、邊緣整齊、溶血性不同3.培育基中生長(zhǎng)現(xiàn)象：固體培育基細(xì)菌的菌落一般可分為三種：光滑型菌落(smoothcolony，S型菌落）：新分別的細(xì)菌大多呈光滑型菌落，表面光滑、潮濕、邊緣整齊。粗糙型菌落(roughcolony，R型菌落）：菌落表面粗糙、干燥、呈皺紋或顆粒狀，邊緣大多不整齊。黏液型菌落（mucoidcolony，M型菌落）：菌落黏稠、有光澤，似水珠樣。細(xì)菌多有厚莢膜或豐富粘液層。粗糙型菌落黏液型菌落光滑型菌落水溶性色素（如銅綠假單胞菌）脂溶性色素（如金黃色葡萄球菌）銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌4.人工培育細(xì)菌的用途醫(yī)學(xué)感染性疾病的病原學(xué)診斷細(xì)菌學(xué)探討生物制品的制備工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)基因工程中應(yīng)用二、示教：1、消毒滅菌的常用方法:物理--熱力（干、濕熱各兩個(gè)）過濾器（3-4種）、冰箱、紫外線（兩個(gè)）、超生波化學(xué)--高、中、低效消毒劑各類型2-3個(gè)代表；2、藥敏試驗(yàn)：紙片法3、培育基的種類：見前說明、視察實(shí)物4、細(xì)菌生長(zhǎng)現(xiàn)象視察：見前、視察實(shí)物藥敏試驗(yàn)：紙片法ZoneInterpretiveCriteria(mm)DrugDiskcontent(ug)ResIntSusccefazolin301415-1718gentamicin101213-1415三、操作：細(xì)菌的接種培育液體培育基固體斜面培育基半固體培育基固體平皿培育基1.固體平皿培育基分別接種方法右手執(zhí)筆式握持接種環(huán)，在酒精燈火焰上燒灼接種環(huán)，待冷，取待測(cè)菌液一環(huán)。左手抓握瓊脂培育基平皿，用手掌將平皿的底固定，用手指將平皿的蓋略抬起一些，進(jìn)行接種。持接種環(huán)在瓊脂表面的1區(qū)涂布，劃線時(shí)接種環(huán)與瓊脂表面呈30°～40°的角度輕輕接觸，利用腕力，切忌劃破瓊脂表面。燒灼接種環(huán)，待冷后，將接種環(huán)在2區(qū)、3區(qū)劃線數(shù)次，各線條間隔要小，但不能重疊。劃完3區(qū)不需燒灼接種環(huán)，在4區(qū)作連續(xù)劃線，如此反復(fù)至劃完整個(gè)平皿（如圖3）。圖1接種環(huán)的握持方法圖2平皿的握持方法1區(qū)4區(qū)3區(qū)2區(qū)圖3劃線分離的方法左：分區(qū)右：培養(yǎng)后的結(jié)果接種完畢，蓋好平皿蓋，在平皿底玻璃上用記號(hào)筆注明標(biāo)本名稱、接種時(shí)間、接種者等。然后將平皿的底朝上，放置在37℃孵箱內(nèi)孵育24h。取出后視察瓊脂表面的菌落分布狀況，留意視察最終1～2區(qū)內(nèi)是否分別出單個(gè)菌落，并視察記錄菌落特征（如菌落大小、形態(tài)、透亮度、色素等狀況）。2.固體斜面培育基接種方法3.半固體培育基接種方法右手持接種針，滅菌冷卻以