研究生組織化學(xué)概論

病理學(xué)技術(shù)-組織化學(xué)病理學(xué)教研室王弦2020/12/181組織切片法

不同的切片制備方法，其切片方法也有較大的差別，組織切片法包括石蠟切片法、冰凍切片法、火棉膠切片法、石蠟包埋半薄切片法、樹脂包埋薄切片法和大組織石蠟切片法等。常用的切片工具包括組織切片機(jī)、切片刀和自動(dòng)磨刀儀器等。2020/12/182石蠟切片法

石蠟切片機(jī)——LeciaRM2235旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)2020/12/1832020/12/184輪轉(zhuǎn)切片機(jī)具體使用及技巧

1.切片機(jī)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)介：

2020/12/1852020/12/1862.安全性能

操作切片機(jī)對(duì)操作者而言具有潛在的危險(xiǎn)性，在更換刀具和樣品的時(shí)候，手很容易被割傷，因此在整個(gè)操作過程中，安全性是非常有必要再三強(qiáng)調(diào)的。

2020/12/187手輪鎖2020/12/188

一般切片機(jī)都會(huì)有手輪安全鎖（3），可以將手輪鎖定在任意位置。防止手輪意外被觸及而帶動(dòng)樣品頭升降。

而有第二手輪鎖（5）的切片機(jī)不僅更能確保安全性，還提高了使用的便利性。第二手輪鎖職能將手輪把手鎖定于最高點(diǎn)，即樣品頭鎖定于距離刀/刀片最遠(yuǎn)的位置，留出足夠空間更換刀具和樣品。操作者在切片過程中，單手就可以將手輪鎖定/解鎖。2020/12/189刀架保護(hù)裝置

無論是鋼刀刀架還是一次性刀片架，刀架上必須配備結(jié)合牢固的護(hù)刀器（7）（9），在更換樣品或者暫時(shí)不進(jìn)行切片的時(shí)候，護(hù)刀器必須蓋在刀架上。好的護(hù)刀器必須跟隨刀架一同側(cè)向移動(dòng)，有效覆蓋刀鋒的全長(zhǎng)。

2020/12/18102020/12/18113.切片機(jī)功能簡(jiǎn)介：回縮功能

回縮功能開啟，切片行程中當(dāng)樣本頭上升到最高點(diǎn)時(shí)，樣品頭向刀架反方向回退200μm，防止刀刃和樣品的互相接觸或摩擦。

2020/12/18122020/12/1813樣品頭定位裝置：

帶有0位指示器（32）的樣品頭定位裝置能以最便捷的方式矯正蠟塊/樣品的平面，直到和刀刃平行。鎖桿（29）用來緊固/放松樣品頭定位器，旋轉(zhuǎn)旋紐（30）可以使定位器作南北向旋轉(zhuǎn)，旋轉(zhuǎn)旋紐（31）可以是定位器作東西向旋轉(zhuǎn)。每個(gè)方向最多旋轉(zhuǎn)8°，旋紐上標(biāo)有刻度，每旋轉(zhuǎn)一圈可控制樣品頭旋轉(zhuǎn)2°。

2020/12/18142020/12/1815刀架（一次性刀片架）

（9）護(hù)刀器，切片時(shí)翻下，更換樣品或結(jié)束切片時(shí)，一定要翻上，覆蓋住刀刃。

（10）壓板控制鎖桿，緊固/放松刀片

（11）刀架側(cè)向移動(dòng)控制鎖桿

2020/12/1816刀架需要定期拆開進(jìn)行清潔以確保切片良好工作狀態(tài)。以下是清潔步驟：

1.翻下護(hù)刀器(9)。

2.向前旋轉(zhuǎn)側(cè)向移動(dòng)鎖桿（11），并向外拉出鎖桿。

3.連同壓板（83）一起，推動(dòng)刀架底盤（86），直到底盤和壓板一起從刀架弧形基座（87）上取下。

4.向下旋轉(zhuǎn)壓板控制鎖桿（10），并將鎖桿向外拉出。

5.取下壓板（83）。

6.擦拭刀架的所有部件。（請(qǐng)不要使用二甲苯或含有酒精的清洗液，比如玻璃清潔液。）

7.擦干所有部件并重新安裝回原樣。

8.清潔所有活動(dòng)部件后，在部件上涂上薄層的機(jī)油。

9.在安裝壓板（83）時(shí)，必須保證壓板上緣和刀架底座的后緣平行且在同一水平。

2020/12/18172020/12/1818調(diào)節(jié)刀架的間隙角

(1)刀架的刻度0、5、10是用來提示刀的間隙角。位于刀架的右側(cè)。

(2)在刀架底座上也有相應(yīng)的刻度，在調(diào)節(jié)間隙角時(shí)候可以參考。

(3)用專用六角扳手?jǐn)Q松螺絲，刀架就可以移動(dòng)。

(4)移動(dòng)刀架，直到刀架底座上刻度線對(duì)準(zhǔn)刀架上指定的讀數(shù)。放大圖示中顯示的間隙角讀數(shù)為5。

(5)保持刀架的位置，然后重新用扳手緊固螺絲。

2020/12/18192020/12/1820樣品夾

常見樣品夾一般分夾蠟塊的標(biāo)準(zhǔn)樣品夾和夾包埋盒的通用樣品夾。

2020/12/1821

標(biāo)準(zhǔn)樣品夾特殊樣品夾如果需要夾圓柱形或球形樣品，可以在標(biāo)準(zhǔn)樣品夾的基礎(chǔ)上配合使用V型插件，可確保樣品固定恰當(dāng)。

2020/12/1822

組織經(jīng)石蠟包埋制成的蠟塊，用切片機(jī)制成切片的過程稱為石蠟切片法。現(xiàn)在病理診斷最常用的制作切片的方法。在切片前應(yīng)先切去標(biāo)本周圍過多的石蠟（修塊），但也不能留的太少，否則易造成組織破壞，連續(xù)切片時(shí)分片困難。一般切4－6um的切片，特殊情況可切1－2um。2020/12/1823

要觀察病變的連續(xù)性可制作連續(xù)切片。除此之外，石蠟包埋的組織便于長(zhǎng)期保存，因此石蠟切片仍是目前各種切片制作方法中最常用、最普遍的一種方法。2020/12/1824一、切片前的準(zhǔn)備1.固定后的標(biāo)本經(jīng)脫水透明浸蠟和包埋以后，制成蠟塊。2.石蠟切片是以石蠟作為組織的支持媒介作用。應(yīng)先將包埋的每塊組織周圍過多的石蠟切去，組織四周留2mm的石蠟邊。3.檢查切片刀是否鋒利。2020/12/18254.待切蠟塊用冰塊冷卻，或置于冰箱中冷卻，以增強(qiáng)其硬度。5.將切片漂烘儀調(diào)至48℃，對(duì)水中的氣泡，礦物質(zhì)雜質(zhì)和殘留的組織碎屑應(yīng)及時(shí)的除去。6.準(zhǔn)備載玻片，毛筆，鑷子，鉛筆。2020/12/1826二、常規(guī)的制片室應(yīng)準(zhǔn)備以下用品清潔的載玻片恒溫烤片機(jī)大、中號(hào)優(yōu)質(zhì)狼毫毛筆眼科彎鑷子，鉛筆展片盆、染色架2020/12/1827三、切片的制作過程⑴將預(yù)先冷卻的組織裝在切片機(jī)固定器上。

⑵切片組織經(jīng)過粗切，待組織充分切完整，右手旋動(dòng)切片機(jī)把，切片帶出來之后，用毛筆輕輕托起，再用眼科鑷輕攝蠟片，以正面放入展片盆中，待攤平整后撈片。

⑶撈片在載玻片上的二分之一以處。

⑷切片附貼后，放在空氣中稍涼干，即可進(jìn)行烤片。

2020/12/1828四、切片的注意事項(xiàng)⑴凡是陳舊、腐敗或干枯的組織不易制好切片。

⑵固定失時(shí)或固定不當(dāng)?shù)慕M織，染色時(shí)常出現(xiàn)核質(zhì)著色較淺、輪廓不清，出現(xiàn)不等的片狀發(fā)白區(qū)。

⑶組織脫水，透明和浸蠟過度，會(huì)造成過硬、變脆，特別是動(dòng)物組織應(yīng)嚴(yán)格控制。

2020/12/1829⑷切片出現(xiàn)橫皺紋常多見于組織固定不牢，或切片刀固定不緊。

⑸切片刀不鋒利，切片時(shí)會(huì)自行卷起或皺起，更不能順利地將切片聯(lián)結(jié)成蠟帶。切片刀如有缺口存在，更易造成切片斷裂、破碎、不完整等現(xiàn)象。

⑹組織切片機(jī)各個(gè)零件和螺絲應(yīng)旋緊，否則將會(huì)產(chǎn)生震動(dòng)，以致切片厚薄不均。2020/12/1830⑺靜電的消除在冬天，靜電是很常見的，如果增加環(huán)境的濕度，靜電很容易被消除（在室內(nèi)燒水）。用干燥紙摩擦工作區(qū)域也會(huì)有所幫助。2020/12/1831冰凍切片法冰凍切片機(jī)——LeciaCM1900雙壓縮機(jī)式冰凍切片機(jī)

2020/12/18322020/12/18332020/12/1834

冰凍切片在組織學(xué)技術(shù)中應(yīng)用范圍較廣，對(duì)病理學(xué)中的臨床手術(shù)的快速診斷其意義更大。冰凍切片不經(jīng)過各級(jí)乙醇的脫水及二甲苯的透明等過程，因此對(duì)于脂肪和類脂的保存較好，在進(jìn)行脂肪染色和神經(jīng)組織髓鞘的染色時(shí)常用。冰凍切片利于一些抗原的檢測(cè)，比如做免疫熒光檢測(cè)，需要利用冰凍切片，因石蠟切片會(huì)使抗原產(chǎn)生交聯(lián)。2020/12/1835一、直接冰凍切片法冰凍切片多用于新鮮組織、低溫冰箱冷藏的組織塊等。組織塊可以不經(jīng)任何的包埋劑或用甲基纖維素（OCT）包埋后，直接放在制冷臺(tái)上冷卻后進(jìn)行切片。2020/12/18361.二氧化碳冰凍切片法2.甲醇制冷器3.半導(dǎo)體制冷冰凍切片法4.恒冷箱切片

LeciaCM1900｝了解內(nèi)容2020/12/1837二、明膠冰凍切片法明膠包埋法一般用于冰凍切片易碎的組織，特別是某些有樹突狀突起的組織，當(dāng)切片入水以后常引起分散，甚至產(chǎn)生丟失，某些間歇較多的組織，也可因結(jié)構(gòu)散亂而失去固有的聯(lián)系，形成移位。明膠冰凍切片可避免以上情況的發(fā)生。2020/12/1838步驟：參考教科書P212020/12/1839三、冰凍切片粘片法1.蛋白甘油粘片法2.Lillie明膠粘片法3.酒精明膠粘片法2020/12/1840四、冰凍切片注意事項(xiàng)1.所有試劑和機(jī)器都要處于可供使用的狀態(tài)2.切去的組織塊大小適宜，厚度小于2mm，并盡快置于冰凍切片機(jī)上制備切片3.調(diào)節(jié)冰凍程度，試切合適時(shí)便迅速切片，冰凍不足無法切片，冰凍過度切片易碎2020/12/18414.固定：切片后應(yīng)立即投入甲醇中固定，否則會(huì)造成細(xì)胞的退變，固定液有很多種（乙醚＋酒精，酒精＋冰醋酸，甲醇，乙醇，丙酮），但是經(jīng)過實(shí)踐認(rèn)為，甲醇作用快，受縮小，染色較清晰，是最理想的固定劑，如加5%冰醋酸，效果更好。5.包埋劑：可用普通膠水代替，最好加入適量的水（膠水：水＝2：1）2020/12/18426.做冰凍切片應(yīng)帶手套，防止感染，注意不要切到手！7.切片一般在5um.8.切片要完整，不要有皺褶，染色要清晰，防止有冰晶（托盤要放入機(jī)箱待用，OCT盡量少一些，要用冷錘）2020/12/1843

補(bǔ)充要點(diǎn)：關(guān)于切片質(zhì)量

1、冰晶多：這是最普遍的現(xiàn)象，主要原因是冷凍速度慢：（1）將標(biāo)本托盤放在外面，這是錯(cuò)誤的，熱的托盤會(huì)延長(zhǎng)冷凍的時(shí)間，增加冰晶的產(chǎn)生。（2）膠放得太多，同樣也會(huì)延長(zhǎng)冷凍的時(shí)間。

冰晶會(huì)使診斷產(chǎn)生誤診，特別是軟組織腫瘤和含水量較高的組織。2020/12/18442、細(xì)胞退變：切片粘在玻片上要立即固定，固定時(shí)間越快，細(xì)胞退變?cè)缴?，從固定速度上看，甲醇是最快也是最好的?、細(xì)胞收縮：

用電吹風(fēng)吹或用丙酮固定，都會(huì)引起細(xì)胞收縮，但如果沒有對(duì)照，不是很明顯。

2020/12/18454、染色較淺：

主要是蘇木素的染色時(shí)間應(yīng)該用顯微鏡觀察一下5、切片有很多空洞：

主要是肝臟，由于動(dòng)物冷凍后發(fā)脆，粗切時(shí)肝組織呈大塊大塊的粉狀，肝切片上有很多的小白點(diǎn)（即肝組織掉出），這就要求我們多細(xì)切幾下。2020/12/18466、皺折：

主要是選擇展片的方法不一樣造成：有的用毛筆慢慢拉下在切片臺(tái)上，然后用玻片粘；有的用毛筆在組織塊成小卷后拉開，然后用玻片粘；這二種情況在組織好切，心情平各時(shí)，也能做出好片子。但在比賽時(shí)，腎上腺素較高，手多多少少會(huì)顫抖，容易造成拉力不均勻，導(dǎo)致切片出現(xiàn)小皺。還有組織邊上留膠太少，會(huì)造成組織邊緣出現(xiàn)皺折。

2020/12/18477、組織發(fā)脆：冰凍切片機(jī)冷凍室的溫度冬天一般設(shè)在－19℃，夏天設(shè)在－22℃

不同的組織，對(duì)溫度要求不一樣，肝臟和甲狀腺－15℃，脂肪組織－35℃

如果遇到組織有很多的裂痕，說明溫度過低，可用手指稍微去摸一下

2020/12/1848冰脆：2020/12/1849核退變：2020/12/1850冰晶多冰晶少2020/12/1851大組織石蠟切片法

制備大組織塊可觀察完整的組織病變情況，以及保持結(jié)構(gòu)上的連續(xù)性。有時(shí)在病理診斷上有重要的意義。因?yàn)橛行┎∽冊(cè)谌庋凵蠠o法分辨正常組織和病變組織的界限，尤其像甲狀腺組織腫瘤，觀察有無胞膜浸潤(rùn)或胞膜是否完整，如不用大塊組織，則必須將一完整腫瘤的斷面分成若干小組織塊，如果包埋不當(dāng)或者切面不正，則無法全面觀察病變組織的分布情況2020/12/1852而影響診斷。因此制備大組織石蠟切片很有必要。2020/12/1853制備方法：1.固定后取材2.沖洗3.脫水，透明，浸蠟表格參考P174.包埋5.切片：大塊組織切片較難，可采用以下方法較少阻力2020/12/1854（1）包埋可采用52－54℃的石蠟，以減少一些硬度。（2）切片前蠟塊不需要冰箱內(nèi)冷卻，防止過硬（3）切片刀要鋒利，組織蠟塊稍傾斜，以較少阻力。6.展片和烘片7.染色8.觀察2020/12/1855其它切片法1.塑料切片法塑料包埋組織的切片方法與常規(guī)切片方法相同?？赏瑫r(shí)進(jìn)行光鏡和電鏡的檢測(cè)，定位準(zhǔn)確。塑料包埋切片的厚度可達(dá)0.5－2um（半薄切片）。塑料切片主要用于免疫電鏡的超薄切片前定位。包埋前染色的標(biāo)本，切半薄切片后不需染色，直接在相差顯微鏡下觀察。免疫反應(yīng)部位成黑點(diǎn)狀，定位后進(jìn)一步做超薄切片，這樣可明顯提高免疫電鏡陽性檢出率。2020/12/18562.碳蠟（PEG）切片按石蠟切片法切片，但在操作中注意碳蠟塊盡量不要接觸水和冰塊，儲(chǔ)存應(yīng)密封干燥冷藏該方法的缺點(diǎn)是夏季室溫高時(shí)，切片困難，連續(xù)切片不如石蠟切片容易，碳蠟吸水性較強(qiáng)，也不易長(zhǎng)期保存。2020/12/18573.超薄切片用于電鏡標(biāo)本的制備4.石蠟包埋半薄切片法同常規(guī)方法，但切片刀要鋒利，最好用一次性刀片，氣溫高時(shí)，可將蠟塊和切片刀冷卻后切片。2020/12/1858HE染色

蘇木精—伊紅染色法(hematoxylin-eosinstaining)，簡(jiǎn)稱HE染色法，石蠟切片技術(shù)里常用的染色法之一。蘇木精染液為堿性，主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核糖體著紫藍(lán)色；伊紅為酸性染料，主要使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色。HE染色法是組織學(xué)、胚胎學(xué)、病理學(xué)教學(xué)與科研中最基本、使用最廣泛的技術(shù)方法。2020/12/1859試劑配置A：0.5~1%的伊紅酒精溶液：稱取伊紅Y0.5~1g，加少量蒸餾水溶解后，再滴加冰醋酸直至漿糊狀。以濾紙過濾，將濾渣在烘箱中烤干后，以95%酒精（即工業(yè)酒精，如果不怕浪費(fèi)，用無水乙醇配制也可）100毫升溶解。

B：蘇木素染液配方：蘇木精2g無水乙醇250ml硫酸鋁鉀17.6g蒸餾水750ml碘酸鈉0.2g冰醋酸20ml

2020/12/1860配制方法：將蘇木素溶于無水乙醇，再將硫酸鋁鉀溶于蒸餾水.兩溶液溶解后將其混合，加入碘酸鈉，最后加入冰醋酸。C：1%鹽酸酒精分化液：將1毫升濃鹽酸加入99毫升70%酒精中即可。2020/12/1861分化：用某些試劑，將過度染色或者不需要著色的組織成分上的顏色除去。藍(lán)化：用明礬蘇木素液深染細(xì)胞核后，通過鹽酸乙醇的分化，切片從酸性環(huán)境中（此時(shí)，切片呈紅褐色）轉(zhuǎn)移至流水中使之變藍(lán)的過程。明礬蘇木素液這種紅變藍(lán)的現(xiàn)象，本質(zhì)上是染料蘇木紅加鋁（藍(lán)色色精）之間的結(jié)合或者中斷關(guān)系。一般來講，在酸性環(huán)境中，使深藍(lán)色的色精處于離子狀態(tài)，此時(shí)為紅色，這種現(xiàn)象稱色精形成中斷。相反，紅色離子狀態(tài)的色精，在堿性環(huán)境中（相對(duì)地說）處于結(jié)合狀態(tài)，這種現(xiàn)象稱色精形成，并呈藍(lán)色。2020/12/1862染色流程

(1)二甲苯（Ⅰ）10min

(2)二甲苯（Ⅱ）10min

(3)100%乙醇（Ⅰ）1min

(4)100%乙醇（Ⅱ）1min

(5)80%乙醇2min

(6)蒸餾水1-2min

(7)蘇木精液染色5min

(8)流水稍洗去蘇木精液1-3s

(9)1%鹽酸乙醇1-3s

2020/12/1863

(11)流水沖洗10min

(12)0.5%伊紅液染色1-3min

(13)蒸餾水稍洗1-2s

(14)80%乙醇稍洗1min

(15)95%乙醇（Ⅰ）1min

(16)95%乙醇（Ⅱ）1min

(17)無水乙醇1min

(18)無水乙醇1min

(19)二甲苯（Ⅰ）1min

(20)二甲苯（Ⅱ）1min

(21)二甲苯（Ⅲ）1min

(22)中性樹膠封固

2020/12/1864冷凍切片HE染色步驟：（1）冰凍切片固定10～30s（2）稍水洗1～2s（3）蘇木精液染色（60℃）3min（4）流水洗去蘇木精液5～10s（5）1%鹽酸乙醇1～3s（6）稍水洗1～2s（7）促藍(lán)液返藍(lán)5～10s（8）流水沖洗15～30s（9）0.5%曙紅液染色30s（10）蒸餾水稍洗1～2s（11）80%乙醇10s（12）95%乙醇10s（13）無水乙醇10s（14）無水乙醇10s（15）二甲苯（Ⅰ）10s（16）二甲苯（Ⅱ）10s（17）中性樹膠封固。2020/12/1865染色結(jié)果：細(xì)胞核藍(lán)色，胞質(zhì)、肌纖維、膠原纖維和紅細(xì)胞呈深淺不一的紅色2020/12/1866注意事項(xiàng)：1.脫蠟2.烤片溫度和時(shí)間3.染色時(shí)間，根據(jù)試劑新鮮程度4.鹽酸乙醇分化必須控制時(shí)間，分化可以選擇溫水5.脫水必須充分6.透明必須充分，封片盡量濕封2020/12/1867常用的特殊染色一、特殊染色的意義1.顯示HE染色切片中看不到的目的物2.區(qū)別HE染色切片中一些難以鑒別的病變3.使HE染色切片中不明顯或容易被忽略的目的物變得明顯易見2020/12/1868二、特殊染色的分類結(jié)締組織、肌肉組織、神經(jīng)組織、脂類物質(zhì)、糖類、色素類、病理的內(nèi)源性沉著物、病原微生物、內(nèi)分泌、單種細(xì)胞、性染色質(zhì)、骨、血液、造血組織、核酸、酶類等2020/12/1869三、特殊染色的命名1、按發(fā)明者的姓名命名2、按所用染色劑命名3、按顯示的目的物命名4、采用混合性命名2020/12/1870四、學(xué)習(xí)特染技術(shù)應(yīng)掌握的重點(diǎn)

（注意事項(xiàng)）

（1）染色方法的成敗，應(yīng)該在溫度、濃度、時(shí)間和PH值等方面找原因。

（2）注意特染的應(yīng)用范圍，如某種病變應(yīng)用什么方法染色才能達(dá)到目的，一般先在HE切片所見的要求去選擇適當(dāng)?shù)奶厝痉椒?，一種或多種。2020/12/1871

（3）必須掌握各種特殊染色的結(jié)果，避免導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)論或嚴(yán)重的誤診，如在網(wǎng)染時(shí)把膠元纖維誤以為網(wǎng)狀纖維。

（4）盡量要陽性切片作對(duì)照，便于選擇特染方法，并與HE切片作對(duì)照。

（5）特染的組織，在其固定、脫水根據(jù)要求選擇。所用的器皿都必須化學(xué)清洗。

2020/12/1872三、玻璃器皿的清潔

在病理實(shí)驗(yàn)室可用的玻璃器皿，都必須經(jīng)過清洗干凈才能使用，清洗的方法依玻璃器皿的新舊而不同。2020/12/18731、新購(gòu)玻璃器皿的處理

對(duì)于新購(gòu)買的玻璃器皿應(yīng)先用洗衣粉浸泡洗刷，自來水沖洗后再用1—2%鹽酸水溶液浸泡數(shù)小時(shí)后，用自來水沖洗干凈，必要時(shí)可用少量蒸餾水洗2次。

2020/12/18742、使用后玻璃器皿的處理

每次使用后的玻璃器皿都必須及時(shí)徹底清洗干凈，以供下次實(shí)驗(yàn)之用，如輕視這一步驟，可用的玻璃器皿不夠干凈，則會(huì)影響染色效果，甚至導(dǎo)致染色失敗，特別在酶組化和銀離子反應(yīng)操作過程中更有嚴(yán)格的要求，使用后的玻璃器皿在一般清洗后，還要求用硫酸清洗液浸泡。2020/12/1875硫酸清洗液配制

重鉻酸鉀80g

自來水1000ml

濃硫酸（工業(yè)用）120m

新配制的清潔液為紅褐色，反復(fù)使用一段時(shí)間后，慢慢變成綠色，說明清潔液已失敗，不能繼續(xù)使用應(yīng)重新配制。2020/12/18763、玻璃器皿的清洗方法

①任何玻璃器皿都必須用自來水沖洗，然后把殘余藥液或染液洗去。

②用毛刷沾洗衣粉擦干凈。

③自來水沖洗，蒸餾水洗2次。

④把晾干的器皿輕輕置入清潔液浸泡數(shù)日。

⑤取出器皿，用自來水把器皿內(nèi)外徹底沖洗干凈，最后用蒸餾水洗2次。

⑥把玻璃器皿倒置于有孔架上自然晾干或溫箱中烤干，最后存放櫥內(nèi)備用。2020/12/1877糖類

單糖糖類雙糖淀粉植物界多糖→纖維素糖原→動(dòng)物組織（動(dòng)物淀粉）中性粘多糖粘多糖酸性粘多糖2020/12/1878一、糖原㈠糖原的分布㈡糖原染色的應(yīng)用1、診斷糖原累積病2、糖尿病的診斷及研究3、證明與鑒別細(xì)胞內(nèi)空泡狀變性4、用于某些腫瘤的診斷與鑒別2020/12/1879㈢糖原染色的種類1、過碘酸—Schiff反應(yīng)（PAS）2、碘染色3、胭脂紅染色法㈣糖原染色原理㈤糖原染色法、過碘酸—Schiff反應(yīng)（PAS）2020/12/1880二、粘多糖㈠分類與分布1、分類：中性粘多糖氨基已糖游離已糖基

酸性粘多糖氨基已糖各種酸根2020/12/1881分布:中性粘多糖胃粘膜表面上皮十二指腸腸腺等酸性粘多糖呼吸道的杯狀細(xì)胞

消化道的杯狀細(xì)胞

2020/12/1882（二）粘液物質(zhì)染色的應(yīng)用1、證實(shí)及鑒別胃粘膜的腸上皮化生2、研究胃癌的組織發(fā)生3、粘液病和粘液肉瘤4、軟骨粘液樣纖維瘤、粘液胚胎性橫紋肌肉瘤5、鑒別粘液表皮樣癌與鱗狀細(xì)胞癌6、鑒別粘液腺癌與未分化鱗癌2020/12/1883（三）粘液物質(zhì)染色方法阿利新蘭過碘酸雪夫氏反應(yīng)（AB/PAS）

(四)粘液物質(zhì)染色原理（五）粘液物質(zhì)染色2020/12/1884脂類染色一、脂類的定義脂類是油脂、類脂以及它們的衍生物的總稱。脂類物質(zhì)簡(jiǎn)稱脂質(zhì)。二、脂類的性質(zhì)

1.化學(xué)性質(zhì)脂類中最多是真正的脂肪（油），是脂肪酸和甘油形成的。在性質(zhì)上它通常是三個(gè)脂肪酸分子（飽和或不飽和的）與一個(gè)甘油分子相結(jié)合形成的甘油三酯。絕大多數(shù)自然存在的甘油三酯是混合的甘油三酯，就是說它們是含有兩個(gè)或三個(gè)不相同的脂肪酸。還有少部分的簡(jiǎn)單甘油三酯，它們是含有同一種脂肪酸的甘油三酯。2020/12/18852.物理性質(zhì)脂類的比重小于1，所以比水輕，根據(jù)室溫及其熔點(diǎn)呈固態(tài)或液態(tài)。熔點(diǎn)取決于兩個(gè)因素：一是脂肪酸的鏈長(zhǎng)（增加而升高）；另外就是脂類的飽和程度（增加而升高）。3.存在形式（1）.儲(chǔ)存脂質(zhì)：大量存在于脂肪細(xì)胞中，廣泛分布于皮下、大網(wǎng)膜、腸系膜、腎和胰等臟器周圍以及肌間組織等處。儲(chǔ)存脂質(zhì)具有支持、保護(hù)、維持體溫等作用，并參與能量代謝，故又稱為能量庫。（2）.基本脂質(zhì)：存在于細(xì)胞內(nèi)，是細(xì)胞原生質(zhì)的組成部分或形成某種特殊的結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞膜、線粒體、髓鞘。脂質(zhì)往往和組織的蛋白質(zhì)結(jié)合而形成脂蛋白。2020/12/1886三、脂類的類型脂類分為油脂、類脂及其衍生物。油脂（單純脂）就是油和脂肪的統(tǒng)稱。1.中性脂肪（脂肪）：又稱甘油三酯，是甘油和脂肪酸所形成的脂。脂肪又分為簡(jiǎn)單甘油三酯和混合甘油三酯。2.類脂（復(fù)合脂）：磷脂、糖脂、膽固醇及其酯。3.衍生脂類：上述脂類的水解產(chǎn)物，包括脂肪酸及其衍生物、甘油、鞘氨醇等。2020/12/1887蘇丹III染色法一、原理蘇丹染料對(duì)脂肪染色的機(jī)制一般認(rèn)為是物理學(xué)上的溶液作用或吸附作用，借溶液作用使脂肪染色，即先把蘇丹染料溶于有機(jī)溶劑中，這種染料在冰凍切片內(nèi)脂質(zhì)的溶解度較在原有溶劑中的溶解度更大，所以在染色時(shí)染料就從有機(jī)溶劑中轉(zhuǎn)移入脂質(zhì)中而使脂肪顯示顏色。二、固定

10%甲醛溶液三、試劑配制蘇丹III染液：蘇丹0.15g，60%~70%乙醇100ml。將蘇丹60%~70%乙醇或60%~70%乙醇與丙酮的等量飽和混合液，此溶液配制完畢后應(yīng)充分溶解，形成飽和沉淀液作為備用液。若臨時(shí)配制需過濾后才能使用。注意事項(xiàng)：

1、使用備用液時(shí)不能搖動(dòng)試劑瓶，應(yīng)緩慢傾倒。

2、盛放此溶液的容器需塞緊蓋嚴(yán)，防止揮發(fā)導(dǎo)致染色時(shí)沉淀。2020/12/1888四、染色步驟1.冰凍切片厚8--18um2.蒸餾水稍洗3.Harris蘇木素液中染約1min4.自來水洗后，用0.5%鹽酸乙醇分化，再水洗直至細(xì)胞核返藍(lán)為止5.蒸餾水洗后移入70%乙醇內(nèi)浸洗一下6.浸入蘇丹III染液中約30min或更長(zhǎng)時(shí)間。若置于56℃溫箱中可適當(dāng)縮短時(shí)間7.在70%乙醇中分化數(shù)秒鐘8.將切片浸于蒸餾水里，待組織片上的乙醇洗凈，然后用玻璃棒挑撈切片貼在載玻片上9.待切片在空氣中稍晾干或用冷風(fēng)機(jī)吹稍干10.及時(shí)用甘油明膠封片五、染色結(jié)果脂肪呈紅色，胞核呈藍(lán)色2020/12/1889油紅O染色法一、原理利用染料易溶于脂質(zhì)的性質(zhì)證明組織脂質(zhì)含量的多少二、固定10%甲醛、甲醛—鈣固定液三、試劑配制油紅O染色原液：油紅O0.5g,異丙醇（含量98%以上）100mL充分溶解后作為儲(chǔ)存液（染色原液）。臨用時(shí)取染色原液6mL加蒸餾水4mL，稀釋，靜置5-10min后過濾，次液保存不得超過1-2h2020/12/1890四、染色步驟1.冰凍切片厚8--18um，后進(jìn)行水洗2.置于密封容器盛裝的脂肪染色劑內(nèi)（稀釋后的油紅染液）10-15min3.用60%的乙醇分色4.水洗5.在Harris或其他蘇木素淡染30s6.用水或者1%的磷酸氫二鈉沖洗至變藍(lán)7.附貼與載玻片上，稍干8.用甘油明膠封固五、染色結(jié)果脂肪呈紅色，胞核呈藍(lán)色2020/12/18912020/12/1892網(wǎng)狀纖維染色1、定義網(wǎng)狀纖維（reticularfiber）是一種纖細(xì)的纖維。它穿行于網(wǎng)狀細(xì)胞體和突起分支，并互相交織成網(wǎng)，因而被稱為網(wǎng)狀纖維，又因這種纖維對(duì)銀的浸染著色特別顯著。故又稱為嗜銀纖維。2020/12/18932、形成它的形成主要是在纖維母細(xì)胞的粗面內(nèi)漿網(wǎng)中，合成可溶性膠原。在醛糖、類脂的作用下，形成可溶性膠原，隨后它被分泌到細(xì)胞外，在基質(zhì)中（或在細(xì)胞的表面）通過原膠原蛋白分子間的交聯(lián)，聚合成為不溶性的膠原原纖維即網(wǎng)狀纖維。2020/12/18943、特點(diǎn)網(wǎng)狀纖維纖細(xì)，直徑0.2-1μm,沒有彈性，而有韌性，能抵抗胃液的消化和弱酸的腐蝕。它的主要成分也是膠原蛋白，在電鏡下也有膠原原纖維特有的周期性橫帶。因此，網(wǎng)狀纖維在分子結(jié)構(gòu)上可能和膠原纖維相似，只不過膠原原纖維補(bǔ)蛋白質(zhì)和多糖的基質(zhì)粘聚成束，形成膠原纖維后，從而失去嗜銀性。所以膠原纖維銀染色呈陰性而網(wǎng)狀纖維則呈陽性，網(wǎng)狀纖維的原纖維上包有一層糖蛋白，據(jù)稱這是導(dǎo)致它有嗜銀性的原因。

2020/12/18954、分布網(wǎng)狀纖維的分布很廣泛，常以兩種形式存在。一種是以網(wǎng)狀結(jié)締組織形式分布，即有網(wǎng)狀纖維和網(wǎng)狀細(xì)胞同時(shí)存在。多分布于造血器官和淋巴網(wǎng)狀器官,如紅骨髓、脾、淋巴結(jié)、肝、扁桃體和胸腺,消化管和呼吸道管壁的淋巴組織內(nèi),并成為這些器官的網(wǎng)狀支架。另一種是以網(wǎng)狀纖維單獨(dú)存在,沒有網(wǎng)狀細(xì)胞伴隨,見于上皮的基底膜,還有平滑肌,脂肪細(xì)胞,毛細(xì)血管和神經(jīng)纖維都有網(wǎng)狀纖維包裹。我們?nèi)粘ＫQ的網(wǎng)狀纖維染色,主要是顯示淋巴網(wǎng)狀組織的網(wǎng)狀纖維,因?yàn)檫@些組織網(wǎng)狀纖維的增多或減少,崩解成斷裂,都有助于病理組織上的診斷。

2020/12/18962020/12/1897

顯示網(wǎng)狀纖維主要是用銀浸染法。銀浸染技術(shù)最初是由Bielschowsky氏于1904年設(shè)計(jì)用于神經(jīng)原纖維的研究,后經(jīng)Maresch氏于1905年發(fā)展應(yīng)用于網(wǎng)狀纖維染色。以后,網(wǎng)狀纖維染色技術(shù)就在此基礎(chǔ)上逐步發(fā)展為各種銀氨液浸染法。例如Perdrau氏法,Foot氏法,Gomori氏法,Wilder氏法,Gorden-Sweets氏法,James氏法,Naounenko-Feigin氏法等十多種。2020/12/1898

在這些方法中,他們主要不同點(diǎn),一是所使用的氧化劑不同,如有些用高錳酸鉀氧化,有些用高錳酸鉀和硫酸氧化,有些用高碘酸氧化。目的是要增強(qiáng)氧化的效果,使網(wǎng)狀纖維的染色加強(qiáng),背景更為清晰。二是所使用的銀氨液不同,如硝酸銀氨液,碳酸銀氨液,醋酸銀氨液以及氫氧化銀氨液等。這些都是配位化合物,簡(jiǎn)稱配合物(舊稱絡(luò)合物)。它們都有一共性,即是每種銀氨液都處于離子狀態(tài),即離解成帶有正電荷的Ag(NH3)2+和帶有負(fù)電荷的N03-、CO3-、CH3C00-、0H-等。

一般來說,氧氧化銀氨液(又稱氫氧化二氨合銀液)是銀氨液中最易被還原,容易和組織結(jié)合的一種,故一般多采用。但該液較不穩(wěn)定,對(duì)光的敏感性強(qiáng),故配制后容易形成沉淀，不易保存。2020/12/1899原理：組織經(jīng)過氧化劑的氧化使網(wǎng)狀纖維對(duì)銀離子具有選擇性的親和力，并在媒染劑的作用下，氨銀液被組織吸咐與組織中的蛋白結(jié)合，經(jīng)甲醛還原成黑色的金屬銀沉積于組織內(nèi)及表面。用氯化金調(diào)色后，再用硫代硫酸鈉液洗去未還原的銀鹽，從而將組織內(nèi)的網(wǎng)狀纖維清晰地顯示出來。2020/12/18100染色的應(yīng)用：（一）、用于顯示和鑒別腫瘤的性質(zhì)和來源1）顯示和區(qū)分癌和肉瘤癌巢周圍存在網(wǎng)狀纖維，肉瘤網(wǎng)狀纖維包繞每個(gè)細(xì)胞2020/12/181012)顯示和區(qū)分血管內(nèi)皮瘤與血管外皮瘤血管內(nèi)皮瘤的瘤細(xì)胞在網(wǎng)狀纖維膜內(nèi)，而血管外皮瘤則在網(wǎng)狀纖維膜外，血管內(nèi)皮肉瘤的瘤細(xì)胞呈泡巢狀，周圍多被網(wǎng)狀纖維包繞；而血管外皮肉瘤的瘤細(xì)胞可見較多的網(wǎng)狀纖維。3）用以鑒別淋巴細(xì)胞肉瘤與網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤前者瘤細(xì)胞間的網(wǎng)狀纖維比正常稍減少，后者則比正常時(shí)增多。2020/12/181024）區(qū)分骨尤文氏肉瘤與骨網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤5）顯示與鑒別骨異常增生與骨化性纖維瘤6）區(qū)分軟骨粘液纖維瘤與粘液肉瘤7）鑒別腦膜瘤與星行細(xì)胞瘤腦膜瘤有網(wǎng)狀纖維2020/12/18103（二）用于某些腫瘤的診斷1）平滑肌肉瘤瘤細(xì)胞間可見大量平行分布的網(wǎng)狀纖維2）纖維肉瘤大量網(wǎng)狀纖維密集包繞細(xì)胞3）滑膜肉瘤其梭形細(xì)胞產(chǎn)生網(wǎng)狀纖維少4）惡性神經(jīng)鞘瘤網(wǎng)狀纖維與梭形細(xì)胞平行排列，不包繞細(xì)胞兩端注：大多被免疫組化取代，很少用2020/12/18104（三）用于觀察和研究癌組織的發(fā)生、發(fā)展及其惡性程度（四）顯示與觀察基底膜的變化如：原位癌，可見有完整的基底膜，而浸潤(rùn)性癌則可見到被破壞的基底膜。（五）用于識(shí)別壞死組織的結(jié)構(gòu)及類型1）凝固性壞死2）肺結(jié)核干