微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)()

微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)()第一頁，共三十二頁，2022年，8月28日【目標(biāo)導(dǎo)航】

1.學(xué)會培養(yǎng)基的制備方法。2.掌握大腸桿菌的純化方法。第二頁，共三十二頁，2022年，8月28日一、制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基1．用文字和箭頭寫出制備流程：

。2．溶化環(huán)節(jié)中先加入

，取出稱量紙后再加入蛋白胨和

，再加入瓊脂，最后補(bǔ)加蒸餾水。3．對牛肉膏蛋白胨進(jìn)行滅菌的方法是

。計(jì)算→稱量→溶化→滅菌→倒平板牛肉膏氯化鈉高壓蒸汽滅菌法第三頁，共三十二頁，2022年，8月28日4．倒平板是制備牛肉膏蛋白胨的重要環(huán)節(jié)，下圖為倒平板的操作示意圖。

(1)請用文字和箭頭寫出正確的倒平板操作流程：

。

(2)甲、乙、丙中的滅菌方法是

。

(3)丁中的操作需要等待

才能進(jìn)行。丙→乙→甲→丁灼燒滅菌平板冷卻凝固第四頁，共三十二頁，2022年，8月28日二、純化大腸桿菌1．接種微生物的方法最常用的有

和

。2．下圖中甲為平板劃線法中最重要的環(huán)節(jié)，乙為操作的結(jié)果。每一次劃線后要將接種環(huán)

，除第一次劃線外，每一次劃線的起點(diǎn)是

，最后一次劃線不要和

相連。平板劃線法稀釋涂布平板法灼燒上一次劃線的末端第一區(qū)域第五頁，共三十二頁，2022年，8月28日3．稀釋涂布平板法則是將菌液進(jìn)行一系列的

，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到

的表面進(jìn)行培養(yǎng)。只要

，就能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落。梯度稀釋瓊脂固體培養(yǎng)基稀釋度足夠高第六頁，共三十二頁，2022年，8月28日判斷正誤：(1)在制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的過程中，所用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌法(

)(2)將培養(yǎng)基從干熱滅菌箱內(nèi)取出立即就可以倒平板(

)(3)平板劃線法和稀釋涂布平板法都要在固體培養(yǎng)基上操作(

)答案(1)×

(2)×

(3)√第七頁，共三十二頁，2022年，8月28日一、培養(yǎng)基的制備1．制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基步驟如下：

計(jì)算：依據(jù)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方比例計(jì)算配制100mL 的培養(yǎng)基時，各種成分的用量 ↓ 稱量：牛肉膏比較黏稠，可用稱量紙稱取，牛肉膏和蛋白 胨都易吸潮，稱取時動作要迅速，稱后要及時蓋上瓶蓋↓第八頁，共三十二頁，2022年，8月28日第九頁，共三十二頁，2022年，8月28日2．注意事項(xiàng) ①天平稱量時，注意放等大的稱量紙，防止牛肉膏粘在托盤上。 ②在溶化時要用玻璃棒不斷攪拌，防止瓊脂糊底而導(dǎo)致燒杯破裂。 ③培養(yǎng)基滅菌后，需冷卻至50℃左右時才能倒平板，原因是瓊脂在44℃以下凝固。 ④培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，不要完全打開。第十頁，共三十二頁，2022年，8月28日⑤整個操作過程要在酒精燈火焰旁進(jìn)行，避免雜菌污染。⑥平板冷凝后要倒置的原因：防止皿蓋上的冷凝水落入培養(yǎng)基，造成污染。⑦若倒平板時，培養(yǎng)基濺在皿蓋和皿底之間的部位，易滋生雜菌，這個平板應(yīng)丟棄。第十一頁，共三十二頁，2022年，8月28日1．請簡述制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基過程中的幾次滅菌。 答案(1)對培養(yǎng)皿進(jìn)行干熱滅菌；(2)對制備成的培養(yǎng)基進(jìn)行高壓蒸汽滅菌；(3)倒平板過程中的灼燒滅菌(酒精燈火焰進(jìn)行操作)。第十二頁，共三十二頁，2022年，8月28日2．等平板冷卻凝固后要將平板倒置，請簡述倒置的原因。 答案因?yàn)槠桨謇鋮s后，皿蓋上會有凝結(jié)的水滴，且培養(yǎng)基表面的濕度較高，平板倒置后，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好的揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水滴滴入培養(yǎng)基造成污染。第十三頁，共三十二頁，2022年，8月28日1．制備各種牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，關(guān)于倒平板的具體描述正確的是(

) ①待培養(yǎng)基冷卻至40℃左右時，在酒精燈火焰附近倒平板②將滅過菌的培養(yǎng)皿放在桌面上，左手拔出棉塞③右手拿錐形瓶，使瓶口迅速通過火焰④用左手的拇指和食指完全打開皿蓋⑤右手將錐形瓶中培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，左手立即蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋⑥等待平板冷卻5～10s，將平板倒過來放置，使皿蓋在下，皿底在上

A．①③④⑤ B．④⑤⑥

C．③⑤ D．①②④⑥第十四頁，共三十二頁，2022年，8月28日【問題導(dǎo)析】(1)培養(yǎng)基滅菌后，需冷卻至

左右時才能倒平板，原因是瓊脂在44℃以下凝固。(2)倒平板的過程要在

附近進(jìn)行。50℃酒精燈火焰第十五頁，共三十二頁，2022年，8月28日解析瓊脂是一種多糖，在98℃以上可溶解于水，在44℃以下凝固，倒平板時高于50℃則會燙手，低于50℃時若不能及時操作，瓊脂會凝固。無菌操作應(yīng)貫穿于操作的全過程，皿蓋全打開則空氣中的微生物會進(jìn)入培養(yǎng)基。答案C第十六頁，共三十二頁，2022年，8月28日【一題多變】倒平板的過程需要進(jìn)行無菌操作，在培養(yǎng)基的制備過程中，還有哪些環(huán)節(jié)需要進(jìn)行無菌操作？答案要對培養(yǎng)基進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，對培養(yǎng)皿進(jìn)行干熱滅菌第十七頁，共三十二頁，2022年，8月28日二、微生物分離與純化技術(shù)1．原理 微生物的分離與純化就是將待檢測微生物樣品通過劃線或涂布接種在固體培養(yǎng)基上，樣品中的每一個細(xì)胞或孢子都可以生長繁殖形成單個菌落。將單個菌落接種到斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)后，即可得到一個微生物的純種。第十八頁，共三十二頁，2022年，8月28日2．方法步驟 微生物的分離包括樣品稀釋、劃線或涂布及培養(yǎng)三個步驟

(1)梯度稀釋操作(如圖1)圖1微生物分離操作流程圖第十九頁，共三十二頁，2022年，8月28日a．將分別盛有9mL水的6支試管滅菌，并按101～106的順序編號。b．用移液管吸取1mL培養(yǎng)的菌液，注入101倍稀釋的試管中。用手指輕壓移液管上的橡皮頭，吹吸三次，使菌液與水充分混勻。c．從101倍稀釋的試管中吸取1mL稀釋液，注入102倍稀釋的試管中，重復(fù)第2步的操作。以此類推，直到完成最后一支試管的稀釋。注意：移液管需要經(jīng)過滅菌。操作時，試管口和移液管應(yīng)在離火焰1～2cm處。第二十頁，共三十二頁，2022年，8月28日(2)劃線或涂布平板劃線分離法：在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑取大腸桿菌培養(yǎng)液在平板上劃線，常用的劃線方法有平行劃線和連續(xù)劃線兩種。平行劃線時，每轉(zhuǎn)一個角度燒一次接種環(huán)。劃線完畢后，蓋上培養(yǎng)皿蓋，做好標(biāo)記。圖2劃線示意圖第二十一頁，共三十二頁，2022年，8月28日涂布分離法：取3個平板，底面分別用記號筆寫上10－4、10－5和10－6三種稀釋度，然后用無菌吸管分別吸取相應(yīng)稀釋度的稀釋液各0.1mL，放入已標(biāo)記好的平板上，用無菌玻璃涂棒在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻，室溫下靜置5～10min，使菌液吸附進(jìn)培養(yǎng)基(圖3)。第二十二頁，共三十二頁，2022年，8月28日(3)培養(yǎng)將劃線或涂布接種的平板倒置于培養(yǎng)箱或溫室中37℃培養(yǎng)16～24h，即可長出單菌落(圖4)圖3涂布法示意圖圖4斜面接種法第二十三頁，共三十二頁，2022年，8月28日(4)結(jié)果分析①確認(rèn)培養(yǎng)基制備是否合格為確認(rèn)培養(yǎng)基制備是否合格，需設(shè)置對照實(shí)驗(yàn)，即接種后的培養(yǎng)基和一個未接種的培養(yǎng)基都放入37℃恒溫箱中，培養(yǎng)12h和24h，觀察現(xiàn)象并記錄——如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則實(shí)驗(yàn)失敗需要重新制備。第二十四頁，共三十二頁，2022年，8月28日②接種操作成功的標(biāo)準(zhǔn)如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合該菌菌落的特點(diǎn)，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中無菌操作還未達(dá)到要求，實(shí)驗(yàn)失敗，需要分析原因，再次制備。第二十五頁，共三十二頁，2022年，8月28日1．稀釋涂布平板法要求菌液的稀釋度要足夠大，平板劃線法要求連續(xù)多次劃線，且除了第一次劃線外，每一次劃線的起點(diǎn)是上一次劃線的末端，兩種操作方法雖然不同，但目的相同，該目的是什么？ 答案目的是將菌種充分地分散，保證菌落是由一個細(xì)胞或孢子繁殖而成，所獲得的菌落中的菌種是單一的純種。第二十六頁，共三十二頁，2022年，8月28日2．平板劃線法中的接種環(huán)要進(jìn)行多次灼燒(取菌液前的灼燒、每一次劃線后的灼燒及劃線結(jié)束后的灼燒)，請簡述每次灼燒的目的。 答案取菌液前的灼燒的目的是避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每一次劃線后的灼燒的目的是殺死上次劃線結(jié)束后接種環(huán)上殘留的菌種，使每次劃線的菌種來自上次劃線末端；劃線結(jié)束后的灼燒殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。第二十七頁，共三十二頁，2022年，8月28日2．下圖中甲是稀釋涂布平板法中的部分操作，乙是平板劃線法操作結(jié)果。 第二十八頁，共三十二頁，2022年，8月28日下列敘述中，錯誤的是(

)A．甲圖中的涂布前要將涂布器灼燒，冷卻后才能取菌液B．對于濃度較高的菌液，如果甲中的稀釋倍數(shù)僅為102，則所得的菌落不是由單一的細(xì)胞或孢子繁殖而成C．乙中培養(yǎng)皿中所得的菌落都符合要求D．乙中的連續(xù)劃線的起點(diǎn)是上一次劃線的末端第二十九頁，共三十二頁，2022年，8月28日【問題導(dǎo)析】(1)對菌液進(jìn)行稀釋時，如果菌液中的菌體的濃度越高，則稀釋的倍數(shù)也要

，菌體的濃度很低，則稀釋的倍數(shù)不必

。(2)高溫會殺死菌體，所以一些經(jīng)過高溫或灼燒滅菌的器材需要

后才能接觸菌種。(3)平板劃線法中的多次劃線中，菌體的

，即不同劃線處的

不同，所以形成的菌落并非全部是由單個菌體繁殖而成的。越高太高冷卻越來越少菌體數(shù)目第三十頁，共三十二頁，2022年，8月28日解析灼燒后的接種環(huán)如果沒有冷卻就接觸菌種，會將菌體殺死，A正確。稀釋倍數(shù)過低，會導(dǎo)致多個菌體聚集在一起繁殖成菌落，B正確。平板劃線法中最后一次劃線的末端處形成的菌落才是由單一的細(xì)胞或孢子繁殖而成，這種菌落才符合要求，C錯誤。連續(xù)劃線中，除了第一次劃線外，每一次劃線的起點(diǎn)是上一次劃線的末端，目的是使得菌體密度越來越小，保證最后劃線末端處的菌落是由單一的細(xì)胞或孢子繁殖而成。答案C第三十一頁，共三十二頁，2022年，8月28日【