微生物細(xì)胞破碎

微生物細(xì)胞破碎第一頁(yè)，共三十三頁(yè)，2022年，8月28日幾種由大腸桿菌表達(dá)的胞內(nèi)重組藥物藥物名宿主用途胰島素大腸桿菌治療糖尿病人生長(zhǎng)激素大腸桿菌治療侏儒癥干擾素大腸桿菌治療毛狀細(xì)胞白血病和卡波濟(jì)肉瘤第二頁(yè)，共三十三頁(yè)，2022年，8月28日§3、1細(xì)胞壁的組成與結(jié)構(gòu)第三頁(yè)，共三十三頁(yè)，2022年，8月28日

脂蛋白脂多糖脂質(zhì)雙層形態(tài)與結(jié)構(gòu)細(xì)胞壁特殊組分：外膜第四頁(yè)，共三十三頁(yè)，2022年，8月28日一、細(xì)菌肽聚糖：N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰胞壁酸、半乳糖胺氨基酸：D-丙氨酸、L-丙氨酸、D-谷氨酸、L-賴(lài)氨酸磷壁質(zhì)糖脂質(zhì)第五頁(yè)，共三十三頁(yè)，2022年，8月28日G+

菌肽聚糖結(jié)構(gòu):五肽交聯(lián)橋五個(gè)甘氨酸四肽側(cè)鏈L-丙、D-谷、L-賴(lài)、D-丙聚糖骨架G：N-乙酰葡萄胺M：N-乙酰胞壁酸第六頁(yè)，共三十三頁(yè)，2022年，8月28日聚糖骨架：同G+

菌四肽側(cè)鏈：

L-丙、D-谷

DAP、D-丙G-菌肽聚糖結(jié)構(gòu):第七頁(yè)，共三十三頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)胞壁革蘭陽(yáng)性菌革蘭陽(yáng)性菌強(qiáng)度較堅(jiān)韌較疏松厚度20-80nm10-15nm肽聚糖層數(shù)可多達(dá)560層1-2層肽聚糖含量占細(xì)胞壁干重50%-80%占細(xì)胞壁干重5%-20%磷壁酸有無(wú)外膜無(wú)有細(xì)胞壁G+菌與G-菌細(xì)胞壁的比較第八頁(yè)，共三十三頁(yè)，2022年，8月28日項(xiàng)目革蘭陽(yáng)性菌革蘭陰性菌細(xì)胞壁的關(guān)系染色性紫色紅色細(xì)胞壁對(duì)酒精的通透性抗原性主要為磷壁酸主要為外膜細(xì)胞壁的化學(xué)組成不同毒性無(wú)內(nèi)毒素有內(nèi)毒素內(nèi)毒素為陰性菌細(xì)胞壁成分

脂多糖對(duì)青霉素的作用有效無(wú)效青霉素作用部位為肽聚糖五肽交聯(lián)橋?qū)θ芫傅淖饔糜行o(wú)效溶菌酶作用部位為肽聚糖

聚糖骨架細(xì)胞壁G+菌與G-菌的差別及與細(xì)胞壁的關(guān)系第九頁(yè)，共三十三頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)胞膜位于細(xì)胞壁內(nèi)緊包細(xì)胞質(zhì)，結(jié)構(gòu)與真核細(xì)胞基本相同。功能細(xì)胞膜電鏡照片分泌呼吸載體蛋白脂質(zhì)雙層細(xì)胞膜模式結(jié)構(gòu)圖物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)生物合成第十頁(yè)，共三十三頁(yè)，2022年，8月28日特殊結(jié)構(gòu)莢膜化學(xué)組成：功能：肺炎鏈球菌肺炎鏈球菌Capsule多糖或多肽抗吞噬作用粘附作用抗有害物質(zhì)損傷作用產(chǎn)汽莢膜桿菌第十一頁(yè)，共三十三頁(yè)，2022年，8月28日二、真菌和酵母糖及其氨基衍生物氨基酸脂質(zhì)三、藻類(lèi)

第十二頁(yè)，共三十三頁(yè)，2022年，8月28日四、細(xì)胞結(jié)構(gòu)與細(xì)胞破碎細(xì)胞聲波攪拌液壓冷凍壓力動(dòng)物細(xì)胞7777G-芽孢桿菌和球菌6566G+芽孢桿菌5（4）54酵母3.5342.5G+球菌3.5(2)325孢子2(1)21菌絲16(1)5細(xì)胞對(duì)破碎的敏感度第十三頁(yè)，共三十三頁(yè)，2022年，8月28日§3、2細(xì)胞壁的破碎一、破碎率的評(píng)價(jià)破碎率：被破碎細(xì)胞的數(shù)量占原始細(xì)胞數(shù)量的百分比數(shù)，即：1、直接計(jì)數(shù)法平板計(jì)數(shù)法血球細(xì)胞計(jì)數(shù)器2、間接計(jì)數(shù)法產(chǎn)物測(cè)定法電導(dǎo)法

第十四頁(yè)，共三十三頁(yè)，2022年，8月28日第十五頁(yè)，共三十三頁(yè)，2022年，8月28日二、細(xì)胞破碎方法的分類(lèi)細(xì)胞破碎機(jī)械非機(jī)械液體剪切固體剪切超聲波：超聲波機(jī)械攪拌：振動(dòng)器壓力：Chaikoff擠壓機(jī)研磨：研棒、研缽、珠磨壓力：X-壓濾機(jī)干燥溶胞物理：滲透沖擊化學(xué)：陰、陽(yáng)離子洗滌劑酶：溶菌酶、酶噬菌體溶胞真空干燥空氣干燥冷凍干燥溶劑干燥第十六頁(yè)，共三十三頁(yè)，2022年，8月28日1、固體剪切方法（珠磨）原理：進(jìn)入珠磨機(jī)的細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑小于1mm）一齊攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細(xì)胞之間的相互剪切、碰撞，使細(xì)胞破碎，釋放出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被留在破碎室內(nèi)，漿液流出從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作。第十七頁(yè)，共三十三頁(yè)，2022年，8月28日設(shè)備第十八頁(yè)，共三十三頁(yè)，2022年，8月28日破碎率的動(dòng)力學(xué)方程破碎作用遵循一級(jí)動(dòng)力學(xué)定律：Rm能使放出的蛋白質(zhì)最大數(shù)量(mg/g)R為t時(shí)間內(nèi)釋放的蛋白質(zhì)數(shù)量(mg/g)k破碎的比速度第十九頁(yè)，共三十三頁(yè)，2022年，8月28日影響反應(yīng)常數(shù)K的因數(shù)：轉(zhuǎn)盤(pán)外緣速度細(xì)胞濃度珠粒大小溫度流量提高破碎率的方法：延長(zhǎng)研磨時(shí)間增加珠體裝量提高攪拌速度提高操作溫度第二十頁(yè)，共三十三頁(yè)，2022年，8月28日2、液體剪切法（高壓勻漿法）原理：利用高壓使細(xì)胞破碎。不宜采用高壓勻漿的破碎的微生物細(xì)胞：已造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌；較小的革蘭氏陽(yáng)性菌；含有包含體的基因工程菌

高達(dá)20,000PSI(約138MPA)以上的壓縮氣體，可以有效的將細(xì)胞膜打破。第二十一頁(yè)，共三十三頁(yè)，2022年，8月28日包含體形成的可能性：可溶蛋白的集聚超過(guò)溶解度；蛋白合成太快，導(dǎo)致分子間疏水相互作用聚合而不溶；高表達(dá)的蛋白沒(méi)有形成正常的二硫鍵連接；蛋白的助溶物缺乏；包含體的形成與蛋白的穩(wěn)定性有關(guān)。包含體:蛋白相互交聯(lián)在一起形成不溶性的聚集物

第二十二頁(yè)，共三十三頁(yè)，2022年，8月28日外源蛋白在大腸桿菌中的積累蛋白產(chǎn)物占菌體總蛋白/%外源蛋白的積累人胰島素50%形成包含體-丙酰胺酶20%在細(xì)胞區(qū)間-人體干擾素25%形成包含體凝乳酶原形成包含體牛生長(zhǎng)激素〉30%形成包含體-內(nèi)酰胺酶形成區(qū)間包含體人胰島素原6%~26%形成包含體第二十三頁(yè)，共三十三頁(yè)，2022年，8月28日破碎的動(dòng)力學(xué)方程：R：蛋白質(zhì)釋放量；Rm：蛋白質(zhì)最大的釋放量；p：操作壓力；k：速率常數(shù)；：與微生物種類(lèi)有關(guān)的常數(shù)第二十四頁(yè)，共三十三頁(yè)，2022年，8月28日Doulach理論：Z：常數(shù)P：破碎壓力P0：臨界壓力：細(xì)胞濃度參數(shù)第二十五頁(yè)，共三十三頁(yè)，2022年，8月28日3、超聲波破碎法（液相剪切的一種方法）原理：超聲波引起空穴，在相當(dāng)高的輸入聲能下，液體各部分會(huì)形成許多小氣泡，在聲波膨脹相中，這些氣泡會(huì)增大，而在壓縮相中氣泡會(huì)被壓縮，直到不能在壓縮時(shí)，氣泡破破裂，釋放出猛烈的陣。這種震波通過(guò)介質(zhì)傳播。在氣泡發(fā)生空穴現(xiàn)象的破碎期間，大量身能轉(zhuǎn)化成彈性形式的機(jī)械能，引起局部的剪切梯度使細(xì)胞破碎。第二十六頁(yè)，共三十三頁(yè)，2022年，8月28日蛋白釋放的動(dòng)力學(xué)方程：蛋白釋放常數(shù)k取決于輸入的聲能。破碎效果:桿菌>球菌;革蘭氏陰性>革蘭氏陽(yáng)性;細(xì)菌>酵母.第二十七頁(yè)，共三十三頁(yè)，2022年，8月28日超聲波破碎過(guò)程中的影響參數(shù)：振幅；細(xì)胞懸浮液的粘度；表面張力；被處理懸浮液的體積；探頭的形狀和材料；細(xì)胞懸浮液的流速；第二十八頁(yè)，共三十三頁(yè)，2022年，8月28日機(jī)械放破碎的缺點(diǎn)：需要高的能量并且生產(chǎn)高溫和高的剪切力，易使不穩(wěn)定產(chǎn)品變性失活；破碎非專(zhuān)一性；碎片尺寸分布廣泛。第二十九頁(yè)，共三十三頁(yè)，2022年，8月28日4、酶溶法原理：利用酶分解細(xì)胞壁上特殊的化學(xué)鍵使之破壁的一種方法。優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)品的選擇性高；抽提的速率和收率高；產(chǎn)品破壞最少；對(duì)pH和溫度等外界條件要求底；不留細(xì)胞殘片。缺點(diǎn)：酶的費(fèi)用高；通用性差；產(chǎn)物抑制分類(lèi)：外加酶法；自溶法第三十頁(yè)，共三十三頁(yè)，2022年，8月28日重要微生物細(xì)胞壁的降解酶生物體酶水解鍵的類(lèi)型細(xì)菌糖苷酶N-乙酰胞壁?；?L-丙氨酸酰胺酶多肽酶肽聚糖中AGA和AAM之間的（1、4）-鍵殘基；某些糖肽中的N-乙酰胞壁酰基殘基和L-氨基酸殘基之間的鍵；甘氨酸-甘氨酸，丙氨酸-甘氨酸等的肽鍵。真菌、酵母-（1，3）-葡聚糖酶-（1，6）-浦聚糖酶甘露聚糖酶甲殼素酶蛋白酶聚糖中隨機(jī)（1，3）-鍵聚糖中隨機(jī)（1，6）-鍵（1，2）-或（1，3）-或（1，6）--D甘露糖苷鍵甲殼糖和殼糊精中的N-乙酰-6-D-氨基葡萄糖基（1，4）-B-鍵藻類(lèi)纖維素酶纖維素中的（1，4）-鍵第三十一頁(yè)，共三十三頁(yè)，2022年，8月28日5、化學(xué)法原理：用某些化學(xué)試劑溶解細(xì)胞壁或抽提細(xì)胞中某些組分的方法。優(yōu)點(diǎn)：對(duì)產(chǎn)物有選擇性細(xì)胞外形保持完整，碎片少。缺點(diǎn)：通用性差時(shí)間長(zhǎng)有些化學(xué)試劑有毒性用于化學(xué)法的試劑種類(lèi)：酸堿調(diào)節(jié)有機(jī)溶劑表面活性劑