微生物培養(yǎng)篩選與保存

微生物培養(yǎng)篩選與保存第一頁，共六十頁，2022年，8月28日1.微生物菌種的保藏為什么要進(jìn)行菌種保藏菌種保藏的目的菌種保藏的原理菌種保藏的方法2第二頁，共六十頁，2022年，8月28日

斜面低溫保藏法石蠟油封藏法砂土管保藏法麩皮保藏法甘油懸液保藏法冷凍真空干燥保藏法液氮超低溫保藏法宿主保藏法第三頁，共六十頁，2022年，8月28日2、菌種的復(fù)壯

狹義的復(fù)壯－－消極的措施指在菌種已經(jīng)發(fā)生衰退的情況下，通過純種分離和測定典型性狀、生產(chǎn)性能等指標(biāo)，從已衰退的群體中篩選出少數(shù)尚未退化的個體，以達(dá)到恢復(fù)原菌株固有性狀的相應(yīng)措施。

廣義的復(fù)壯－－積極的措施指在菌種的典型特征或生產(chǎn)性狀尚未衰退前，就經(jīng)常有意識地采取純種分離和生產(chǎn)性狀測定工作，以期從中選擇到自發(fā)的正突變個體。第四頁，共六十頁，2022年，8月28日菌種復(fù)壯的主要方法1、純種分離法

菌落純（“菌種純”）細(xì)胞純（“菌株純”）

通過純種分離,可將衰退菌種細(xì)胞群體中一部分仍保持原有典型性狀的單細(xì)胞分離出來,經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng),就可恢復(fù)原菌株的典型性狀。平板表面涂布法平板劃線分離法瓊脂培養(yǎng)基澆注法用分離小室進(jìn)行單細(xì)胞分離用顯微操作器進(jìn)行單細(xì)胞分離菌絲尖端切割進(jìn)行單細(xì)胞分離第五頁，共六十頁，2022年，8月28日二、生長曲線的測定第六頁，共六十頁，2022年，8月28日任務(wù)一：認(rèn)識生長曲線的概念任務(wù)二：為生長曲線的繪制設(shè)計實驗方案7第七頁，共六十頁，2022年，8月28日任務(wù)一：什么是生長曲線第八頁，共六十頁，2022年，8月28日什么是微生物的生長曲線將少量單細(xì)胞的純培養(yǎng)，接種到一恒定容積的新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)，每隔一定時間取樣，測菌細(xì)胞數(shù)目。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，以細(xì)菌增長數(shù)目的對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制所得的曲線。9第九頁，共六十頁，2022年，8月28日10第十頁，共六十頁，2022年，8月28日

將一定量的細(xì)菌轉(zhuǎn)入新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜的條件下培養(yǎng)細(xì)胞要經(jīng)歷延遲期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期四個階段。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，以細(xì)菌數(shù)目的對數(shù)或生長速率為縱坐標(biāo)作圖所繪制的曲線稱為該細(xì)菌的生長曲線。不同的細(xì)菌在相同的培養(yǎng)條件下其生長曲線不同，同樣的細(xì)菌在不同的培養(yǎng)條件下所繪制的生長曲線也不相同。11第十一頁，共六十頁，2022年，8月28日12第十二頁，共六十頁，2022年，8月28日哪些情況下需要測定微生物的生長曲線？1.工業(yè)發(fā)酵中往往要接入處于對數(shù)期(特別是中期)的菌體，以盡量縮短停滯期。2.分子生物學(xué)實驗中，選擇對數(shù)期的菌體，制備感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行基因工程實驗13第十三頁，共六十頁，2022年，8月28日任務(wù)二：設(shè)計實驗方案第十四頁，共六十頁，2022年，8月28日1.任選大腸桿菌或酵母菌2.結(jié)合實驗室實際情況，設(shè)計實驗方案，要求包括：（1）實驗原理（2）材料與方法（3）預(yù)期結(jié)果15第十五頁，共六十頁，2022年，8月28日接下來請大家匯報實驗方案第十六頁，共六十頁，2022年，8月28日本次的作業(yè)：請大家設(shè)計實驗方案，要求包括：（1）實驗原理（2）材料與方法（3）預(yù)期結(jié)果A4紙打印上交第十七頁，共六十頁，2022年，8月28日四、食品微生物檢測第十八頁，共六十頁，2022年，8月28日一、食品微生物的檢驗流程二、食品微生物樣品采集與制備三、食品微生物檢驗1.食品中菌落總數(shù)檢測2.食品中霉菌和酵母菌檢測四、制定實驗方案19第十九頁，共六十頁，2022年，8月28日食品檢驗的目的1.便于食品衛(wèi)生質(zhì)量監(jiān)督管理；2.鑒別食品中是否存在有毒有害物質(zhì)3.為新產(chǎn)品、新資源利用、新食品等進(jìn)行衛(wèi)生鑒定第二十頁，共六十頁，2022年，8月28日一.食品微生物檢驗的一般步驟樣品采集樣品處理樣品保存選擇參考菌群檢驗前的準(zhǔn)備菌落總數(shù)大腸菌群致病菌分離培養(yǎng)分離培養(yǎng)增菌純化染色鏡檢生化試驗血清學(xué)試驗動物試驗結(jié)果報告第二十一頁，共六十頁，2022年，8月28日二、食品微生物樣品采集與制備取樣：代表性微生物檢驗的取樣過程中，避免操作引起污染。一個無菌樣品的采集，應(yīng)該通過這樣一種方式，即：在收集過程中，本身應(yīng)避免污染，然后放入消毒容器中。22第二十二頁，共六十頁，2022年，8月28日（一）

檢驗前的準(zhǔn)備準(zhǔn)備好所需的各種儀器，如冰箱、水浴鍋、培養(yǎng)箱等。按技術(shù)要求將各種玻璃儀器進(jìn)行清洗、烘干、包扎、滅菌，冷卻后送無菌室備用。準(zhǔn)備好所用的各種試劑，制備營養(yǎng)瓊脂或其他培養(yǎng)基。做好無菌室或超凈工作臺的滅菌工作，提前滅菌30~50min.準(zhǔn)備好采樣必需的工具和器材，如剪刀、鑷子、勺子等。采樣后樣品運(yùn)輸、保存相關(guān)準(zhǔn)備。第二十三頁，共六十頁，2022年，8月28日（二）樣品的采集第二十四頁，共六十頁，2022年，8月28日采樣的步驟采樣前調(diào)查→現(xiàn)場觀察→確定采樣方案→采樣→樣品封存→開具采樣證明第二十五頁，共六十頁，2022年，8月28日采樣的原則1、根據(jù)檢驗?zāi)康?、食品特點(diǎn)、批量、檢驗方法、微生物的危害程度等確定采樣方案2、應(yīng)采用隨機(jī)原則，確保所采樣品必須具有代表性。3、采樣操作必須遵循無菌原則，要防止污染，防止變質(zhì)、損壞、丟失。嚴(yán)格遵守樣品采集的操作規(guī)程。4、樣品在保存和運(yùn)輸過程中，應(yīng)采取措施防止樣品中原有微生物數(shù)量的變化，不得加入防腐劑、固定劑等。5、樣品采集和現(xiàn)場測定必須有二人以上參加。第二十六頁，共六十頁，2022年，8月28日食品微生物檢驗的采樣方案微生物檢驗的特點(diǎn)是一個以小份樣品的檢測結(jié)果來說明一大批食品衛(wèi)生質(zhì)量，因此，用于分析的樣品的代表性至關(guān)重要，也即樣品的數(shù)量、大小和性質(zhì)對結(jié)果判定產(chǎn)生重大影響。要保證樣品的代表性首先要有一套科學(xué)的抽樣方案，其次使用正確的抽樣技術(shù)，并在樣品的保存和運(yùn)輸過程中保持樣品的原有狀態(tài)。目前最為流行的抽樣方案為ICMSF推薦的抽樣方案和隨機(jī)抽樣方案。無論采取何種方法抽樣，每批貨物的抽樣數(shù)量不得少于5件。對于需要檢驗沙門氏菌的食品，抽樣數(shù)量應(yīng)適當(dāng)增加，最低不少于8件。第二十七頁，共六十頁，2022年，8月28日樣品的種類大樣，就是一整批；中樣，是從樣品中各部分取得的混合樣品，一般每批抽樣數(shù)量不少于5件，一般為200g；小樣，也稱檢樣，直接進(jìn)行分析用的，一般為25g。第二十八頁，共六十頁，2022年，8月28日食品微生物檢驗的采樣方案ICMSF取樣方案；美國FDA的取樣方案；世界糧農(nóng)組織（FAO）取樣方案；我國的食品取樣方案。ICMSF(TheIntermationalCommitteeonMicrobiologicalSpecificationforFood)國際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會第二十九頁，共六十頁，2022年，8月28日食品微生物檢驗采樣方法采樣原則：

能采取完整包裝的樣品就不拆開取樣，必須拆開包裝取樣的應(yīng)按無菌操作進(jìn)行取樣.第三十頁，共六十頁，2022年，8月28日1、液體樣品采樣方法

充分混勻后，無菌操作打開包裝，用100mL無菌注射器抽取,注入無菌盛樣容器.第三十一頁，共六十頁，2022年，8月28日2、半固體樣品采樣方法無菌操作打開包裝，用無菌勺子從幾個部位挖取樣品，放入無菌容器。

第三十二頁，共六十頁，2022年，8月28日3、固體樣品采樣方法大塊整體食品用無菌刀具和鑷子從不同的部位割取，并注意其代表性；小塊大包裝食品應(yīng)從不同部位的小塊上切取樣品，放入無菌容器。若為檢驗食品的污染情況，可取表層樣品；若為檢驗食品品質(zhì)的情況，應(yīng)從深部取樣。

第三十三頁，共六十頁，2022年，8月28日4、冷凍食品采樣方法大包裝小塊冷凍食品按小塊個體采??；大塊冷凍食品可用無菌刀從不同部位削取或用無菌手鋸從凍塊上鋸取樣品，放入無菌容器。若為檢驗食品污染情況，可取表層樣品；若為檢驗食品品質(zhì)情況，應(yīng)從深部取樣。第三十四頁，共六十頁，2022年，8月28日5、生產(chǎn)工序監(jiān)測采樣車間用水：從車間各龍頭采樣；車間臺面、用具、及加工售貨員手的衛(wèi)生監(jiān)測：用5cm2孔無菌采樣板和5支無菌棉簽擦拭25cm2面積，擦拭后立即用無菌剪刀將棉簽頭剪入無菌容器中。第三十五頁，共六十頁，2022年，8月28日車間空氣采樣：將5個直徑90mm的普通瓊脂平板分別置于車間的四角和中部，打開平皿蓋5min，然后蓋蓋送檢。平皿第三十六頁，共六十頁，2022年，8月28日（七）采樣標(biāo)簽的填寫標(biāo)簽內(nèi)容主要：

編號、樣品名稱、生產(chǎn)單位、生產(chǎn)日期、產(chǎn)品批號、產(chǎn)品數(shù)量、存放條件、采樣時間、采樣人姓名，現(xiàn)場情況。第三十七頁，共六十頁，2022年，8月28日×××××采樣單樣品編號：━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━產(chǎn)品名稱（商品名）______規(guī)格型號__________注冊商標(biāo)_____________生產(chǎn)廠家_______________通訊地址__________郵政編碼□□□□□□受檢地點(diǎn)_______________通訊地址__________郵政編碼□□□□□□采樣地點(diǎn)_______________采樣日期__________采樣基數(shù)______________生產(chǎn)日期_______________批號__________產(chǎn)品依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)__________有效成分及含量____________________________________________________________檢驗?zāi)康豞_______________檢測項目_____________________________

采樣人仔細(xì)閱讀以下句子，然后簽字我認(rèn)真負(fù)責(zé)地填寫了該樣品采樣單，承認(rèn)以上填寫的合法性，被該采親單位所證實的樣品系按照采樣方法取得的，該樣品具有代表性、真實性和公正性。代表單位（章）代表單位（章）簽字簽字日期年月日日期年月日

備注

第三十八頁，共六十頁，2022年，8月28日四.樣品的送檢要求1、要快速運(yùn)送：不要超過3小時；2、若路途遙遠(yuǎn)，可在1~5℃低溫下運(yùn)送；3、要注意防污染、防散漏、防變質(zhì)；4、要填寫檢驗申請單。第三十九頁，共六十頁，2022年，8月28日五.樣品的處理方法（一）液體樣品（二）固體樣品（三）冷凍樣品第四十頁，共六十頁，2022年，8月28日（一）液體樣品的處理瓶裝液體樣品的處理盒裝或軟塑料包裝樣品的處理第四十一頁，共六十頁，2022年，8月28日1.瓶裝液體樣品的處理

用點(diǎn)燃的酒精棉球灼燒瓶口滅菌，接著用石炭酸或來蘇爾消毒后的紗布蓋好，再用滅菌開瓶器將蓋啟開；含有二氧化碳的樣品可倒入500mL磨口瓶內(nèi)，口勿蓋緊，覆蓋一滅菌紗布，輕輕搖蕩，待氣體全部逸出后，取樣25mL檢驗。第四十二頁，共六十頁，2022年，8月28日2.盒裝或軟塑料包裝樣品的處理

將其開口處用75%酒精棉擦拭消毒，用滅菌剪子剪開包裝，覆蓋上滅菌紗布或浸有消毒液的紗布在剪開部分，直接吸取樣品25mL，或傾入另一滅菌容器中再取樣25mL檢驗。第四十三頁，共六十頁，2022年，8月28日（二）固體樣品的處理搗碎均質(zhì)法剪碎振搖法研磨法整粒振搖法胃蠕動均質(zhì)法第四十四頁，共六十頁，2022年，8月28日1.搗碎均質(zhì)法將中樣(≥100g)剪碎或攪拌混勻，從中取25g放入帶225mL稀釋液的無菌均質(zhì)杯中，8000~10000r/min均質(zhì)1~2min即可。第四十五頁，共六十頁，2022年，8月28日視頻：無菌均質(zhì)器第四十六頁，共六十頁，2022年，8月28日2.剪碎振搖法將中樣(≥100g)剪碎或攪拌混勻，從中取25g檢樣進(jìn)一步剪碎，放入帶225mL稀釋液和直徑5mm左右玻璃珠的稀釋瓶中，蓋緊瓶蓋，用力快速振搖50次，振幅要大于40cm。第四十七頁，共六十頁，2022年，8月28日3.研磨法

將中樣(≥100g)剪碎或攪拌混勻，從中取25g檢樣放入無菌乳缽中充分研磨后，再放入帶有225mL無菌稀釋液的稀釋瓶中，蓋緊蓋后充分搖勻。第四十八頁，共六十頁，2022年，8月28日4.整粒振搖法直接稱取25g整粒樣品置于帶有225mL稀釋液和直徑5mm左右玻璃珠的稀釋瓶中，蓋緊瓶蓋，用力快速振搖50次，振幅要大于40cm。第四十九頁，共六十頁，2022年，8月28日（三）冷凍樣品冷凍樣品，先將中樣在0~4℃下解凍，時間不能超過18h，或在45℃下解凍，時間不能超過15min。再取檢樣25g做稀釋處理。第五十頁，共六十頁，2022年，8月28日請大家參考p229附錄五中國食品微生物限量規(guī)定列出的食品，選擇一種制定樣品的采集與制備方案，包括：1）選擇何種食品2）用品準(zhǔn)備3）樣品采集具體操作步驟4）樣品處理具體操作步驟第五十一頁，共六十頁，2022年，8月28日作業(yè)要求：提交一篇小論文：XX菌落總數(shù)的檢測報