食品微生物檢驗(yàn)第二章

食品微生物檢驗(yàn)2014年3月第二章食品微生物檢驗(yàn)條件及基本技術(shù)一.食品微生物檢驗(yàn)條件二.微生物檢驗(yàn)基本技術(shù)第一節(jié)食品微生物檢驗(yàn)基本條件一、微生物檢驗(yàn)室定義：指用于食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室。（一）環(huán)境基本要求：實(shí)驗(yàn)室環(huán)境不影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。要求：實(shí)驗(yàn)室的工作區(qū)域與辦公區(qū)域明顯分開。食品微生物實(shí)驗(yàn)室生物實(shí)驗(yàn)室級別管理制度建設(shè)布局常用儀器及用途生物安全水平分級生物安全防護(hù)水平（biosafetylevel，BSL）分為4級，以表示實(shí)驗(yàn)室的相應(yīng)生物安全防護(hù)水平。BSL－1：防護(hù)水平最低,普通建筑物即可，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)設(shè)洗手池。BSL-2：實(shí)驗(yàn)室的門有可視窗。在實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)域外還應(yīng)當(dāng)有供長期使用的存儲(chǔ)空間。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用專門的工作服；應(yīng)戴乳膠手套。配備高壓蒸汽滅菌器，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)配備生物安全柜。BSL-2生物安全水平分級BSL—3實(shí)驗(yàn)室：自成隔離區(qū)（有出入控制）或?yàn)楠?dú)立建筑物。BSL—4防護(hù)水平最高。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建造在獨(dú)立的建筑物內(nèi)或建筑物中獨(dú)立的完全隔離區(qū)域內(nèi)，該建筑物應(yīng)遠(yuǎn)離城區(qū)。實(shí)驗(yàn)室管理制度

1．實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定儀器配備管理使用制度，藥品管理使用制度，玻璃器皿管理使用制度，并根據(jù)安全制度和環(huán)境條件的要求，本室工作人員應(yīng)嚴(yán)格掌握，認(rèn)真執(zhí)行。2．進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室必須穿工作服，進(jìn)入無菌室換無菌衣、帽、鞋，戴好口罩，非實(shí)驗(yàn)室人員不得進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，嚴(yán)格執(zhí)行安全操作規(guī)程。3．實(shí)驗(yàn)室內(nèi)物品擺放整齊，試劑定期檢查并有明晰標(biāo)簽，儀器定期檢查、保養(yǎng)、檢修,嚴(yán)禁在冰箱內(nèi)存放和加工私人食品。4．各種器材應(yīng)建立請領(lǐng)消耗記錄，貴重儀器有使用記錄，破損遺失應(yīng)填寫報(bào)告；藥品、器材、菌種不經(jīng)批準(zhǔn)不得擅自外借和轉(zhuǎn)讓，更不得私自拿出。5．禁止在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)吸煙、進(jìn)餐、會(huì)客、喧嘩，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不得帶入私人物品，離開實(shí)驗(yàn)室前認(rèn)真檢查水、電、暖氣、門窗，對于有毒、有害、易燃、污染、腐蝕的物品和廢棄物品應(yīng)按有關(guān)要求執(zhí)行。檢驗(yàn)室建設(shè)布局圖1.辦公臺(tái)2.文件柜3.樣品柜4.通風(fēng)櫥5.實(shí)驗(yàn)邊臺(tái)6，7.無菌臺(tái)8.天平臺(tái)9.在落地儀器區(qū)再加個(gè)高溫儀器臺(tái)，放高壓滅菌鍋、干燥箱、水浴鍋、電熱板等無菌室建設(shè)檢驗(yàn)環(huán)境要求

微生物學(xué)檢驗(yàn)室要求操作區(qū)域與辦公區(qū)域分開。洗滌室、培養(yǎng)室、消毒間、無菌室應(yīng)分開。無菌室要設(shè)有套間或緩沖間，最好設(shè)推拉門，以防空氣振蕩過大。微生物檢驗(yàn)室應(yīng)備有自動(dòng)或腳踩式洗手池和固定的消毒設(shè)施。

（二）人員基本要求：檢驗(yàn)人員應(yīng)具有相應(yīng)的教育、微生物專業(yè)培訓(xùn)經(jīng)歷，具備相應(yīng)的資源，能夠理解并正確實(shí)施檢驗(yàn)。檢驗(yàn)人員應(yīng)掌握實(shí)驗(yàn)室生物檢驗(yàn)安全操作知識(shí)和消毒知識(shí)。檢驗(yàn)人員應(yīng)在檢驗(yàn)過程中遵守相關(guān)預(yù)防措施的規(guī)定，保證自身安全。注：有顏色視覺障礙的人員不能涉及辨色的實(shí)驗(yàn)。二、無菌室的建設(shè)（一）無菌技術(shù)1、對使用的器具及培養(yǎng)基的滅菌2、創(chuàng)造無菌環(huán)境食品微生物實(shí)驗(yàn)室常用儀器及用途潔凈工作臺(tái)（超凈工作臺(tái)、無菌臺(tái)）是一種供人操作的通用型局部凈化設(shè)備，通過風(fēng)機(jī)將空氣吸入，經(jīng)由靜壓箱通過高效過濾器過濾，將過濾后的潔凈空氣以垂直或水平氣流的狀態(tài)送出，使操作區(qū)域持續(xù)在潔凈空氣的控制下達(dá)到百級潔凈度它可造就局部高清潔度空氣環(huán)境。生物安全柜是為操作原代培養(yǎng)物、菌毒株以及診斷性標(biāo)本等具有感染性的實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，用來保護(hù)操作者本人、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境以及實(shí)驗(yàn)材料，使其避免暴露于上述操作過程中可能產(chǎn)生的感染性氣溶膠和濺出物而設(shè)計(jì)的。高壓滅菌鍋烘箱

培養(yǎng)箱水浴鍋顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡顯微鏡被用來放大微小物體的圖像。一般應(yīng)用于對生物、醫(yī)藥、微觀粒子等觀測。分光光度計(jì)分光光度計(jì)已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量pH計(jì)離心機(jī)PCR儀原理：采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測食品中是否有致病菌；靈敏度：對目標(biāo)菌檢測靈敏度為1個(gè)/g效率：檢測過程用時(shí)2-4H主要耗材：各菌種試劑盒真空泵冰箱純水機(jī)振蕩器/均質(zhì)機(jī)移液器其它儀器二、常用玻璃儀器及用具1、移液管

1ml，2ml，5ml，10ml，25ml

（一）量器類2、容量瓶

50ml，100ml，250ml，500ml，1000ml3、量筒

容量（ml）10、25、50、10、25、500、1000、2000固定體積移液器

數(shù)字型可調(diào)移液器P型

4、微量取樣器（二）、其他常用玻璃器皿3.5cm,7cm，9cm，15cm

1、培養(yǎng)皿2、試管各種試管的使用

13mmX100mm

：生化反應(yīng)及凝集反應(yīng)

15mmX150mm

：斜面培養(yǎng)

18mmX180mm：檢樣稀釋型號150ml，200ml，250ml，500ml，1L，2L，3L

3、三角瓶

燒杯

容量（ml）：30、50、100、150、250、400、600、1000、2000、3000三、玻璃器皿的清洗和滅菌(一)、新購的玻璃器皿1、先用熱肥皂水刷洗，流水沖凈。2、再浸泡于１～２％的鹽酸中數(shù)小時(shí)，最后用流水沖凈。(二)、用過的玻璃器皿

1、含油脂器材的清洗（1）、單獨(dú)高壓滅菌；（2）、趁熱倒去污物；（3）、倒放在鋪有吸水紙的籃子上，置100℃烘箱中烤0.5h;（4）、再用5%的碳酸氫鈉水煮兩次，再用肥皂水刷洗干凈。2、含菌試管的清洗高壓滅菌后，肥皂水刷洗干凈，烘干或晾干備用。3、含菌平皿的滅菌（1）、底蓋分開放，放入桶中，高壓滅菌；（2）、趁熱倒去污物；（3）、肥皂水刷洗干凈，烘干或晾干備用。4、含菌吸管的清洗（1）、把含菌吸管投入3%的來蘇爾液內(nèi)浸泡30min以上殺菌；（2）、用肥皂水洗滌一次；（3）、最后用清水沖洗干凈即可。5、載玻片及蓋玻片的清洗（1）將載玻片及蓋玻片分別浸入5%的來蘇爾液內(nèi)浸泡過夜，取出水洗干凈；（2）蓋片用軟布擦干即可；（3）染色用的載玻片要放入肥皂水中煮沸10min，再用肥皂水刷洗干凈，最后用95%的酒精浸泡片刻，晾干備用。（三）、玻璃器材的滅菌（1）清洗后烘干；（2）加塞包扎；（3）滅菌:

干熱滅菌:160~165℃烘箱中烤2h

濕熱滅菌:121℃20min第二節(jié)食品微生物檢驗(yàn)技術(shù)第一節(jié)細(xì)菌的大小與形態(tài)大小計(jì)量單位是微米（μm）染色革蘭染色法形態(tài)球形桿形螺形光學(xué)顯微鏡細(xì)菌的大小與形態(tài)大多數(shù)球菌直徑約為1.0μm大多數(shù)桿菌長約2-3μm，直徑0.3-0.5μm大腸埃希菌

霍亂弧菌鏈球菌

第二節(jié)細(xì)菌的結(jié)構(gòu)基本結(jié)構(gòu)：核質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞壁特殊結(jié)構(gòu)：鞭毛、菌毛、芽胞、莢膜細(xì)胞膜細(xì)胞壁莢膜核糖體核質(zhì)菌毛鞭毛核質(zhì)（nuclearmaterial）單一密閉環(huán)狀DNA分子組成球形、棒狀或啞鈴狀化學(xué)組成DNA，RNA和蛋白質(zhì)細(xì)胞質(zhì)/漿（cytoplasm）核糖體質(zhì)粒胞質(zhì)顆粒中介體核糖體（ribosome）功能：合成蛋白質(zhì)的場所沉降系數(shù)為70S：50S和30S亞基鏈霉素紅霉素

概念染色體外的遺傳物質(zhì)，為閉合環(huán)狀雙鏈DNA，帶有遺傳信息，控制細(xì)菌某些特定的遺傳性狀。特點(diǎn)自我復(fù)制相互傳遞自行丟失質(zhì)粒（plasmid）□貯藏營養(yǎng)物質(zhì)□異染顆粒嗜堿性強(qiáng)鑒別細(xì)菌白喉棒狀桿菌胞質(zhì)顆粒中介體（mesosome）細(xì)胞膜內(nèi)陷、折疊、卷曲形成的囊狀物多見于G+細(xì)菌參與細(xì)菌分裂擬線粒體白喉棒狀桿菌中介體透射電鏡圖×130000細(xì)胞膜（cellmembrane）半透性薄膜功能物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)生物合成呼吸作用分泌作用細(xì)菌的結(jié)構(gòu)

核

質(zhì)細(xì)胞質(zhì)：核糖體、質(zhì)粒、胞質(zhì)顆粒、中介體細(xì)胞膜

細(xì)胞壁

莢膜鞭毛菌毛芽胞

基本結(jié)構(gòu)特殊結(jié)構(gòu)細(xì)胞壁（cellwall)功能維持菌體外形抵抗低滲環(huán)境營養(yǎng)攝取和物質(zhì)交換抗原性

結(jié)構(gòu)G+菌G-菌肽聚糖（peptidoglycan）原核細(xì)胞所特有

革蘭陽性菌肽聚糖：

聚糖骨架、四肽側(cè)鏈、五肽交聯(lián)橋啊啊AA革蘭陽性菌肽聚糖：

聚糖骨架、四肽側(cè)鏈、五肽交聯(lián)橋青霉素作用點(diǎn)

溶菌酶作用點(diǎn)N-乙酰葡糖胺

N-乙酰胞壁酸革蘭陰性菌肽聚糖：

聚糖骨架、四肽側(cè)鏈革蘭陰性菌肽聚糖：

聚糖骨架、四肽側(cè)鏈G+菌與G-菌肽聚糖結(jié)構(gòu)比較

革蘭陽性菌細(xì)胞壁特殊組分：磷壁酸

膜磷壁酸壁磷壁酸革蘭陽性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)

脂蛋白、脂質(zhì)雙層、脂多糖(內(nèi)毒素)革蘭陰性菌細(xì)胞壁特殊組分-外膜脂多糖（LPS）

G-菌內(nèi)毒素脂質(zhì)A：內(nèi)毒素的毒性和生物學(xué)活性的主要部分;無種屬特異性核心多糖：具有屬特異性特異多糖：G-菌的菌體抗原；具種特異性G+菌與G-菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)比較G+菌與G-菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)比較細(xì)胞壁 革蘭陽性菌 革蘭陰性菌強(qiáng)度較堅(jiān)韌較疏松厚度 20-80nm10-15nm肽聚糖組成聚、四、五聚、四、無肽聚糖結(jié)構(gòu)類型三維立體結(jié)構(gòu)二維平面結(jié)構(gòu)肽聚糖層數(shù)可多達(dá)50層1-2層肽聚糖含量

50%-80%5%-20%糖類含量多少脂類含量少多磷壁酸有無外膜 無有 G+

菌與G-

菌細(xì)胞壁的比較項(xiàng)目革蘭陽性菌革蘭陰性菌細(xì)胞壁的關(guān)系染色性紫色紅色細(xì)胞壁對酒精的通透性抗原性主要為磷壁酸主要為外膜細(xì)胞壁的化學(xué)組成不同毒性無內(nèi)毒素有內(nèi)毒素為陰性菌細(xì)胞壁成分對青霉素的作用有效無效作用于肽聚糖、五肽交聯(lián)橋細(xì)胞壁缺陷型（細(xì)菌L型）細(xì)胞壁受損的細(xì)菌能夠生長和分裂者原生質(zhì)體原生質(zhì)球高度多形性，生長緩慢油煎蛋狀菌落某些L型引起慢性感染細(xì)胞壁缺陷型（細(xì)菌L型）的特點(diǎn)著色不均勻,多為革蘭陰性菌除去誘發(fā)因素,可以恢復(fù)成原菌作用于細(xì)胞壁的抗菌藥物對其感染治療無效細(xì)菌的結(jié)構(gòu)

核

質(zhì)細(xì)胞質(zhì)：核糖體、質(zhì)粒、胞質(zhì)顆粒、中介體細(xì)胞膜細(xì)胞壁

莢膜鞭毛菌毛芽胞

基本結(jié)構(gòu)特殊結(jié)構(gòu)細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)－莢膜（capsule）某些細(xì)菌在其細(xì)胞壁外包繞一層粘液性物質(zhì)，為多糖或多肽的多聚體，用理化方法去除后并不影響細(xì)胞的生命活動(dòng)。功能抗吞噬作用粘附作用齲齒抗有害物質(zhì)的損傷作用細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)－鞭毛（flagellum）成分為蛋白質(zhì)具有抗原性鞭毛菌分成4類功能液體中能自由游動(dòng),

運(yùn)動(dòng)器官與致病性有關(guān)鑒定細(xì)菌和進(jìn)行分類細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)－菌毛（pilus）許多革蘭陰性菌和少數(shù)革蘭陽性菌菌體表面存在著一種比鞭毛更細(xì)、更短而直硬的絲狀物，與細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)無關(guān)。蛋白質(zhì),菌毛蛋白有抗原性分類普通菌毛:數(shù)量多，短而細(xì)粘附結(jié)構(gòu)，與致病有關(guān)性菌毛:少數(shù)革蘭陰性菌,少粗、長、中空傳遞某些遺傳物質(zhì)菌毛（pilus）F+F-F+F-F+F+F+F+細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)－芽胞（spore）概念產(chǎn)生芽胞的都是革蘭陽性菌芽胞的大小、形狀、位置等隨菌種而異細(xì)菌芽胞的形態(tài)芽胞形成芽胞

細(xì)胞分裂繁殖體周期子代細(xì)胞

強(qiáng)大的抵抗力

可在自然界中存在多年，是重要的傳染源。芽胞并不直接引起疾病，只有發(fā)芽成為繁殖體后,才能迅速大量繁殖而致病。有重要的鑒別意義。芽胞是否被殺死作為判斷滅菌效果的指標(biāo)芽胞（spore）胞質(zhì)顆粒核糖體菌毛擬核細(xì)胞壁細(xì)胞膜質(zhì)粒鞭毛莢膜細(xì)菌結(jié)構(gòu)總結(jié)第三節(jié)細(xì)菌形態(tài)檢查法顯微鏡放大法細(xì)菌形體微小，肉眼不能直接看到，必須借助顯微鏡（普通光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡）放大后才能觀察。染色法細(xì)菌體小半透明，經(jīng)染色后才能觀察較清楚。顯微鏡放大法普通光學(xué)顯微鏡——普通光學(xué)顯微鏡的分辨率為

0.25um。一般細(xì)菌都大于0.25um，故可用普通光學(xué)顯微鏡觀察。

抗酸染色電子顯微鏡——電子顯微鏡的分辨率為1nm。不僅能看清細(xì)菌的外形，內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)可一覽無余。肺炎鏈球菌莢膜莢膜顯微鏡放大法（二）細(xì)菌的染色應(yīng)用：主要用于檢查生活狀態(tài)下細(xì)菌的動(dòng)力及運(yùn)動(dòng)狀況常用方法：壓滴法、懸滴法、暗視野顯微鏡檢查不染色標(biāo)本檢查不染色標(biāo)本檢查-壓滴法載玻片細(xì)菌懸液蓋玻片染色標(biāo)本的檢查-常用染料堿性染料

電離后顯色離子帶正電荷，易與帶負(fù)電荷的被染物結(jié)合。細(xì)菌的等電點(diǎn)在pH2~5之間，易與帶正電荷的染料結(jié)合而著色。常用的染料有堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫、亞甲藍(lán)等。酸性染料:電離后顯色離子帶正電荷，易與帶負(fù)電荷的被染物結(jié)合。通常用來染細(xì)胞質(zhì)，而很少用于細(xì)菌的染色。常用的染料有伊紅、剛果紅等。復(fù)合染料（中性染料）及熒光染料

復(fù)合染料是堿性染料和酸性染料的復(fù)合物，如瑞氏染料（伊紅亞甲藍(lán)）、姬姆薩染料（伊紅天青）等；熒光染料如熒光標(biāo)記的抗體，熒光素常用異硫氫基熒光素。用于某些特殊的染色技術(shù)。脂溶性染料

如Sudanblack。染色標(biāo)本的檢查染色方法的種類單染法:采用一種染料染色復(fù)染法（鑒別染色）:采用兩種或兩種以上的不同染料進(jìn)行先后染色，使不同種類的細(xì)菌、同種細(xì)菌的不同結(jié)構(gòu)，分別染上不同的顏色，以便鑒別細(xì)菌。革蘭氏染色圖解革蘭氏染色試劑

步驟1：用蒸餾水滴瓶滴一小滴蒸餾水于潔凈的載玻片上

步驟2：用無菌操作法取少許培養(yǎng)物于蒸餾水滴上

步驟3：用接種環(huán)將培養(yǎng)物涂布成一薄層

步驟4：風(fēng)干

步驟5：在酒精燈火焰外層盡快的來回通過3-4次固定步驟6：結(jié)晶紫染色1分鐘

步驟7：用蒸餾輕輕沖洗玻片

步驟8：革蘭氏碘液染色1分鐘，再用蒸餾水輕輕沖洗

步驟9：酒精脫色至下滴液為無色，立即用蒸餾水沖洗

步驟10：番紅復(fù)染1分鐘，用蒸餾水輕輕沖洗

大腸桿菌（Escherichiacoli）革蘭氏染色圖

革蘭氏染色陰性桿菌（紅色）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）革蘭氏染色

革蘭氏染色陽性球菌（紫色）

注意事項(xiàng)1．革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是脫色時(shí)間，如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而被誤認(rèn)為革蘭氏陰性菌；如脫色時(shí)間過短，革蘭氏陰性菌也會(huì)被誤認(rèn)為是革蘭氏陽性菌。因此必須嚴(yán)格把握脫色時(shí)間。2．選用培養(yǎng)18-24小時(shí)菌齡的細(xì)菌為宜，若細(xì)菌太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。3.干凈的玻片、熱固定、每一步水洗要徹底并且吸干等也是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。步驟：結(jié)果:

陽性菌——紫色

陰性菌——紅色結(jié)晶紫初染碘液媒染乙醇脫色復(fù)紅復(fù)染涂片固定由丹麥醫(yī)生HansChristianGram于1884年創(chuàng)立。革蘭染色法（GramStain）特殊染色莢膜染色特殊染色

負(fù)染色（墨汁染色）特殊染色

染色法革蘭染色法在鑒別細(xì)菌、選擇抗菌藥物、研究細(xì)菌致病性等方面有意義

其他染色法單染色法、抗酸染色法、以及特殊染色法二、培養(yǎng)基的制備技術(shù)

培養(yǎng)基是指以液體、半固體或固體形式，包含天然或合成成分，用于促進(jìn)微生物的繁殖或保持其活力的物質(zhì)組成。由于各類微生物對營養(yǎng)的要求不同，培養(yǎng)目的和檢測需要不同，因而培養(yǎng)基的種類很多。我們可根據(jù)某種標(biāo)準(zhǔn)，將種類繁多的培養(yǎng)基劃分為若干類型。（一）培養(yǎng)基的分類1、根據(jù)培養(yǎng)基的組成來源不同來區(qū)分:天然培養(yǎng)基;合成培養(yǎng)基;半合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基

天然培養(yǎng)基是指利用各種動(dòng)、植物或微生物的原料。如：牛肉膏、麥芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麩皮、各種餅粉、馬鈴薯、牛奶、血清等

優(yōu)點(diǎn)：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好，來源廣泛.缺點(diǎn)：成分難以確切知道。合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是一類化學(xué)成分和數(shù)量完全知道的培養(yǎng)基，它是用已知化學(xué)成分的化學(xué)藥品配制而成。這類培養(yǎng)基化學(xué)成分精確、重復(fù)性強(qiáng)，但價(jià)格昂貴，而微生物又生長緩慢，所以它只適用于做一些科學(xué)研究，例如營養(yǎng)、代謝的研究。半合成培養(yǎng)基

在合成培養(yǎng)基中，加入某種或幾種天然成分；或者在天然培養(yǎng)基中，加入一種或幾種已知成分的化學(xué)藥品即成半合成培養(yǎng)基。例如馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基等。

這種培養(yǎng)基在生產(chǎn)實(shí)踐和實(shí)驗(yàn)室中使用最多。

固體培養(yǎng)基；液體培養(yǎng)基；半固體培養(yǎng)基。2、根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來區(qū)分液體培養(yǎng)基

所配制的培養(yǎng)基是液態(tài)的，其中的成分基本上溶于水，沒有明顯的固形物，液體培養(yǎng)基營養(yǎng)成分分布均勻，易于控制微生物的生長代謝狀態(tài)。

固體培養(yǎng)基

在液體培養(yǎng)基中加入適量的凝固劑即成固體培養(yǎng)基。常用作凝固劑的物質(zhì)有瓊脂、明膠、硅膠等，以瓊脂最為常用。固體培養(yǎng)基在實(shí)際中用得十分廣泛。在實(shí)驗(yàn)室中，它被用作微生物的分離、鑒定、檢驗(yàn)雜菌、計(jì)數(shù)、保藏、生物測定等。

半固體培養(yǎng)基

把少量的凝固劑加入到液體培養(yǎng)基中，就制成了半固體培養(yǎng)基。以瓊脂為例，它的用量在0.2～1%之間。這種培養(yǎng)基有時(shí)可用來觀察微生物的動(dòng)力，有時(shí)用來保藏菌種。運(yùn)輸培養(yǎng)基；保存培養(yǎng)基；增菌培養(yǎng)基。3、根據(jù)培養(yǎng)基的用途來區(qū)分運(yùn)輸培養(yǎng)基

在取樣后和實(shí)驗(yàn)室樣品處理前的時(shí)間，保護(hù)和維持微生物活性的培養(yǎng)基（如Stuart或Amies運(yùn)輸培養(yǎng)基）。運(yùn)輸培養(yǎng)基中通常不允許包含使微生物增殖的物質(zhì)，但是培養(yǎng)基應(yīng)能保護(hù)菌株，確保它們不變質(zhì)。保存培養(yǎng)基

用于在一定期限內(nèi)保護(hù)和維持微生物活力，以防對微生物在長期保存中產(chǎn)生不利影響，或使微生物在長期保存后容易復(fù)蘇的培養(yǎng)基（如Dorset卵黃培養(yǎng)基）。復(fù)蘇培養(yǎng)基

能夠使受損或應(yīng)激的微生物修復(fù)，使微生物恢復(fù)正常生長能力，但不一定促進(jìn)微生物繁殖的培養(yǎng)基。增菌培養(yǎng)基

大多為液體培養(yǎng)基，能夠給微生物的繁殖提供較適當(dāng)?shù)纳L環(huán)境，包括：

A.選擇性增菌培養(yǎng)基：能夠保證特定的微生物在其中繁殖，而部分或全部抑制其他菌體生長的培養(yǎng)基（如SC、LST、RV等）；

B.非選擇性增菌培養(yǎng)基：能夠保證大多數(shù)微生物生長的培養(yǎng)基（如M肉湯、營養(yǎng)肉湯）。分離培養(yǎng)基

支持微生物生長的固體或半固體培養(yǎng)基，包括：

A.選擇性分離培養(yǎng)基：支持特定微生物的生長而抑制其他微生物生長的培養(yǎng)基（如PALCAM瓊脂、TCBS、顯色培養(yǎng)基等）；

B.非選擇性分離培養(yǎng)基：對微生物沒有選擇性抑制的分離培養(yǎng)基（如腦心浸液肉湯、營養(yǎng)瓊脂）。鑒別培養(yǎng)基

能夠進(jìn)行一項(xiàng)或多項(xiàng)微生物生理學(xué)和生化特性鑒定試驗(yàn)的培養(yǎng)基（如尿素培養(yǎng)基、Kligler瓊脂等）；能夠用于分離培養(yǎng)的鑒別培養(yǎng)基被稱作分離/鑒別培養(yǎng)基（如XLD、DHL、TCBS等）。鑒定培養(yǎng)基

能夠產(chǎn)生一個(gè)特定的鑒定反應(yīng)而不需要做進(jìn)一步確認(rèn)實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基（如ONPG、氧化酶試劑）。用于分離的鑒定培養(yǎng)基被稱為分離/鑒定培養(yǎng)基（如顯色培養(yǎng)基）。

顯色培養(yǎng)基是在選擇性培養(yǎng)基上加入了適量的帶發(fā)色及熒光基團(tuán)的酶底物，發(fā)色團(tuán)（熒光團(tuán)）與特殊酶可識(shí)別的基團(tuán)相連。目標(biāo)微生物產(chǎn)生一些特殊的可水解發(fā)色及熒光底物的酶，使得發(fā)色和熒光基團(tuán)釋放出來，從而使目標(biāo)微生物帶上易于辨別的特殊顏色或發(fā)出熒光。多用途培養(yǎng)基

同時(shí)具有多種不同用途的特定培養(yǎng)基。例如，血瓊脂是一種復(fù)蘇培養(yǎng)基，又是分離培養(yǎng)基，還可作為溶血實(shí)驗(yàn)的鑒別培養(yǎng)基。(1)即用型培養(yǎng)基：以即用形式置于容器中（如平皿、試管或其他容器）供應(yīng)的培養(yǎng)基。(2)商品化脫水合成培養(yǎng)基：不立即使用的干粉形式的（如粉末、小顆粒、凍干等形式）培養(yǎng)基。溶于水后能制備成一種或兩種類型的培養(yǎng)基：

a)完全即用型培養(yǎng)基：不需要添加其他成分的培養(yǎng)基；

b)不完全即用型培養(yǎng)基：使用時(shí)加入不穩(wěn)定成分。4、

根據(jù)培養(yǎng)基的制備方法不同來區(qū)分5、

實(shí)驗(yàn)室制備個(gè)別成分培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)室按照培養(yǎng)基配方逐一稱取個(gè)別成分，按照培養(yǎng)基制備程序進(jìn)行。二、培養(yǎng)基的制備正確制備培養(yǎng)基是微生物檢驗(yàn)的一個(gè)基本步驟。在處理脫水培養(yǎng)基和其他含有有害物質(zhì)（如膽鹽或其他選擇劑）的培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)遵守良好實(shí)驗(yàn)室規(guī)范（GLP）和生產(chǎn)廠商的注意事項(xiàng)。使用商品化脫水合成培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格按照廠商提供的使用說明配制，如質(zhì)量（體積）、pH、制備條件、滅菌條件、操作步驟等。當(dāng)使用獨(dú)立成分制備培養(yǎng)基時(shí)，按配方準(zhǔn)確配制并記錄所有配制步驟。另外，記錄所有使用成分的特性（如代號和批號等）。（1）水

配制培養(yǎng)基應(yīng)使用蒸餾水或相同質(zhì)量的水，目的是排除抑制或影響微生物生長的物質(zhì)。為保證蒸餾水的質(zhì)量，蒸餾水的電阻率最少應(yīng)達(dá)到0.3MΩ/cm。建議不使用未經(jīng)過微生物含量檢測的水（細(xì)菌總數(shù)應(yīng)小于1000CFU/mL）。（2）稱量和復(fù)水

稱量所需的脫水培養(yǎng)基（注意緩慢操作，必要時(shí)佩戴口罩或在通風(fēng)櫥中操作，以防吸入含有有毒物質(zhì)的培養(yǎng)基粉末），先加入少量的水，充分混合（注意避免培養(yǎng)基結(jié)塊），然后再加水至所需的量。（3）溶解和分裝

脫水培養(yǎng)基加水后適當(dāng)加熱，并不停攪拌使其快速溶解，必要時(shí)，重新溶解。含瓊脂的培養(yǎng)基在加熱前應(yīng)先浸泡幾分鐘。由個(gè)別成分制備的培養(yǎng)基應(yīng)將不同成分分別加入適量的水中，并充分溶解，然后再加水至所需的量。（4）pH的測定和調(diào)整用pH計(jì)測pH，必要時(shí)進(jìn)行調(diào)整。在實(shí)驗(yàn)室用個(gè)別成分制備的培養(yǎng)基，除特殊說明外，培養(yǎng)基滅菌并冷卻到25℃時(shí)，培養(yǎng)基的pH變化不應(yīng)超過0.2個(gè)pH單位。一般使用大約濃度為40g/L（約1mol/L）氫氧化鈉溶液或濃度約為36.5g/L(約1mol/L)的鹽酸溶液進(jìn)行培養(yǎng)基pH的調(diào)整。值得注意的是，商品化的培養(yǎng)基在高壓滅菌前后的pH可能變化很大，但使用質(zhì)量好的蒸餾水或去離子水配制時(shí)，滅菌前并不需要調(diào)節(jié)pH。（4）分裝

將配制好的培養(yǎng)基分裝到適當(dāng)?shù)娜萜髦?，?yīng)按使用的目的和要求，分裝于試管、燒瓶等適當(dāng)容器內(nèi)，分裝量不得超過容器裝盛量的2/3。容器口可用墊有防濕紙的棉塞封堵，制作的棉塞應(yīng)緊貼管壁，不留縫隙，以防外界微生物沿縫隙侵入，棉塞不宜過緊或過松，塞好后以手提棉塞，試管不下落為準(zhǔn)。棉塞的2/3在試管內(nèi)，1/3在試管外。分裝容器應(yīng)預(yù)先清洗干凈并經(jīng)干烤消毒，以利于培養(yǎng)基的徹底滅菌。此外還須用防水紙包扎（目前試管一般多有用螺旋蓋，采用金屬或塑料試管帽），分裝時(shí)最好能使用半自動(dòng)或電動(dòng)的定量分裝器。分裝瓊脂斜面培養(yǎng)基時(shí)，分裝量應(yīng)以能形成2/3底層和1/3斜面的量為恰當(dāng)。每批培養(yǎng)基應(yīng)另外分裝20mL培養(yǎng)基于一小玻璃瓶中，隨該批培養(yǎng)基同時(shí)滅菌，作為測定該批培養(yǎng)基最終pH之用。培養(yǎng)基和試劑的滅菌通常采用濕熱滅菌或過濾滅菌。但有些特殊培養(yǎng)基（如嗜鹽瓊脂培養(yǎng)基、MKTTn、科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基等）只能煮沸滅菌。煮沸后應(yīng)迅速冷卻，避光保存；明膠、血清、糖類等不耐高溫的物質(zhì)，應(yīng)采取高壓鍋低溫滅菌法（間歇滅菌法）滅菌；有些試劑不需滅菌，可以直接使用（參見相關(guān)國際標(biāo)準(zhǔn)或供應(yīng)商使用說明）。所有培養(yǎng)基濕熱或過濾滅菌后,必須進(jìn)行監(jiān)測,尤其是要對pH、顏色、無菌效果和均勻性等指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測。（6）滅菌

制備含有有毒物質(zhì)的添加成分（尤其是抗生素）時(shí)，需要特別小心（必要時(shí)在通風(fēng)櫥內(nèi)操作），避免因粉末的擴(kuò)散造成實(shí)驗(yàn)人員過敏或發(fā)生其他不良反應(yīng)。制備溶液時(shí)要特別小心并按產(chǎn)品使用說明操作，不要使用過期的試劑。對于抗生素工作溶液，應(yīng)當(dāng)現(xiàn)用現(xiàn)配。在特定環(huán)境下，抗生素溶液應(yīng)適量分裝后冷凍儲(chǔ)存，但解凍后的溶液不能再次冷凍，生產(chǎn)廠商應(yīng)提供冷凍對抗生素活性影響的有關(guān)資料，也可由使用者自行測定。（7）添加成分的制備培養(yǎng)基的使用(1)瓊脂培養(yǎng)基的融化將培養(yǎng)基放到沸水浴中或使用有相同效果的方法（如高壓鍋中的蒸汽）使之融化。經(jīng)過高壓的培養(yǎng)基盡量減少加熱時(shí)間以保證培養(yǎng)基的質(zhì)量。避免過度加熱，培養(yǎng)基融化后即可將其從加熱器上取下，放入47℃±2℃的恒溫水浴鍋中冷卻，直至使用。融化后的培養(yǎng)基應(yīng)盡快使用，放置時(shí)間一般不應(yīng)超過4h。(2)培養(yǎng)基的脫氣必要時(shí)，將培養(yǎng)基在使用前放到沸水浴或蒸汽浴中加熱15min，加熱時(shí)松開容器的蓋子；加熱后蓋緊蓋子，迅速冷卻至使用的溫度。(3)添加成分的加入對熱不穩(wěn)定的添加成分應(yīng)在培養(yǎng)基冷卻至47℃±2℃時(shí)再加入。在加入滅菌的添加成分前，先放置到室溫，避免冷的液態(tài)造成瓊脂凝結(jié)或形成片狀物。將加入培養(yǎng)基的所有添加物緩慢充分混勻，然后盡快分裝到要使用的容器中。(4)培養(yǎng)基斜面和平板培養(yǎng)基的制備和儲(chǔ)存瓊脂斜面培養(yǎng)基應(yīng)在滅菌后立即取出，冷至55℃-60℃時(shí)，擺置成適當(dāng)斜面，待其自然凝固。斜面長度不超過試管長度1/2為宜。如制作半固體或固體深層培養(yǎng)基時(shí)，滅菌后則應(yīng)垂直放置至冷凝。制備平板培養(yǎng)基，將融化的培養(yǎng)基傾注到平皿中，使之在平皿中形成一個(gè)至少2mm厚的瓊脂層（對于直徑90mm的平皿，通常需要加入15mL瓊脂培養(yǎng)基）。將平皿蓋好蓋子后放到一個(gè)涼的水平平面使瓊脂冷卻凝固。在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基會(huì)損失水分，當(dāng)水分損失的量大于培養(yǎng)基總量的15％時(shí)，就會(huì)影響微生物的生長。

凝固后的培養(yǎng)基應(yīng)立即使用或存放于暗處和（或）放在4℃～12℃冰箱的密封袋中，最多存放一周或按廠商提供的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。在平板底部做好標(biāo)記，標(biāo)記的內(nèi)容包括制備日期和（或）有效期和名稱，也可以使用培養(yǎng)基的編碼系統(tǒng)進(jìn)行標(biāo)記。將倒好的平板放在密封的袋子中冷藏保存可延長儲(chǔ)存期限。為了避免產(chǎn)生冷凝水，平板應(yīng)冷卻后再裝入袋中。儲(chǔ)存前不要對瓊脂培養(yǎng)基表面進(jìn)行干燥處理。對于采用表面接種形式培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基，應(yīng)先對瓊脂表面進(jìn)行干燥；干燥時(shí)，將平板蓋揭開，將平板倒扣于烘箱（培養(yǎng)箱）中（溫度設(shè)為20℃～50℃），或放在有對流風(fēng)的無菌凈化臺(tái)中，直到培養(yǎng)基表面的水滴消失為止。注意不要過度干燥，商業(yè)化的平板瓊脂培養(yǎng)基應(yīng)按照廠商提供的說明操作。(5)培養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)每垛最多堆放6個(gè)平板，平板間要留有空隙以進(jìn)行空氣流通，使培養(yǎng)物的溫度盡快與培養(yǎng)箱溫度達(dá)到一致。對于液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基溫度與培養(yǎng)箱達(dá)到一致取決于很多因素，如體積、內(nèi)容物量、容器類型、培養(yǎng)類型等。在使用厭氧罐時(shí)，有時(shí)堆放的平板數(shù)可以超過6個(gè)。(6)培養(yǎng)基的棄置所有污染的和未使用的培養(yǎng)基的棄置應(yīng)采用安全的方式，而且要符合國家和地方法規(guī)的規(guī)定。成品的質(zhì)量控制

(1)物理質(zhì)量的控制實(shí)驗(yàn)室測試至少應(yīng)包括以下內(nèi)容：20℃～25℃時(shí)的pH；

觀察以下內(nèi)容：加入培養(yǎng)基的量和（或）瓊脂層的厚度；色澤；透明度和（或）是否存在肉眼可見的雜質(zhì)；凝膠穩(wěn)定性（粘稠度）和濕度。(2)微生物指標(biāo)控制A.污染檢測：在每批制備好的培養(yǎng)基選取部分樣品進(jìn)行污染測試。B.測試菌株：具有代表性的穩(wěn)定特征并能有效證明實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基最佳性能的一套菌株。測試菌株主要購于標(biāo)準(zhǔn)菌株保藏中心，也可以是實(shí)驗(yàn)室自己分離的具有良好特性的菌株。最好使用從事品種分離的菌株。包括：陽性菌株、陰性菌株等。C.即用培養(yǎng)基和試劑：應(yīng)由商品化即用培養(yǎng)基的生產(chǎn)廠，向使用者提供相應(yīng)的資質(zhì)證明。使用者就不必對培養(yǎng)基進(jìn)行大量的培養(yǎng)基測試工作，但應(yīng)保證其儲(chǔ)存條件。D.商品化合成脫水培養(yǎng)基制備的培養(yǎng)基：對于每批制備好的培養(yǎng)基，除用有效菌株進(jìn)行測試外，還應(yīng)用實(shí)際樣品進(jìn)行檢測，以更好地證明。不含指示劑的培養(yǎng)基，只需用陽性測試菌株進(jìn)行檢測。含有指示劑或選擇劑的培養(yǎng)基，應(yīng)使用能證明其指示或選擇作用的菌株進(jìn)行試驗(yàn)。復(fù)合培養(yǎng)基（即需要加入添加成分的培養(yǎng)基）需要用具備有效性能的菌株逐批進(jìn)行驗(yàn)證，對實(shí)驗(yàn)室制備的需加入添加成分的現(xiàn)成培養(yǎng)基同樣適用。1.SN/T1538.1-2005培養(yǎng)基制定指南第一部分：實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基制備質(zhì)量保證通則。2.ISO/TS11133.1-2000食品和動(dòng)物飼料的微生物學(xué)培養(yǎng)基制備和生產(chǎn)導(dǎo)則第1部分實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基制備的質(zhì)量保證一般導(dǎo)則3.SN/T1538.2-2007培養(yǎng)基制備指南第2部分：培養(yǎng)基性能測試實(shí)用指南。本部分標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了培養(yǎng)基的通用質(zhì)量控制要求并列舉了固體和液體培養(yǎng)基的性能測試方法。本部分標(biāo)準(zhǔn)適用于市售和自制培養(yǎng)基的性能測試。三、微生物的分離、純化與接種技術(shù)接種工具和方法在實(shí)驗(yàn)室或工廠實(shí)踐中，用得最多的接種工具是接種環(huán)、接種針。由于接種要求或方法的不同，接種針的針尖部常做成不同的形狀，有刀形、耙形等之分。有時(shí)滴管、吸管也可作為接種工具進(jìn)行液體接種。在固體培養(yǎng)基表面要將菌液均勻涂布時(shí)，需要用到涂布棒。

接種和分離工具1．接種針2.接種環(huán)3.接種鉤4.5.玻璃涂棒6.接種圈7.接種鋤8.小解剖刀

微生物的分離、純化與接種技術(shù)劃線接種：這是最常用的接種方法。即在固體培養(yǎng)基表面作來回直線形的移動(dòng)，就可達(dá)到接種的作用。常用的接種工具有接種環(huán)，接種針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。劃線接種，分離純化Inoculatinganagarplatetoobtainsinglecolonies灼燒微生物的分離、純化與接種技術(shù)斜面接種技術(shù)微生物的分離、純化與接種技術(shù)

－－細(xì)菌的涂布分離技術(shù)微生物的分離、純化與接種技術(shù)

－－液體接種法、穿刺接種液體接種法：包括從斜面菌種接入培養(yǎng)液，或從液體菌種接入液體培養(yǎng)液，兩種情況都可以用接種環(huán)接種。但在培養(yǎng)量比較大的情況下，液體接種宜采用移液管接種，同時(shí)要求無菌操作。微生物的培養(yǎng)

－－微生物培養(yǎng)中的氧氣條件培養(yǎng)設(shè)備：包括接種室、恒溫培養(yǎng)室、恒溫培養(yǎng)箱、液體發(fā)酵——搖床、厭氧培養(yǎng)罐等。好氧培養(yǎng)：例如平板培養(yǎng)、斜面培養(yǎng)、淺層液體培養(yǎng)、液體振蕩培養(yǎng)或通氣攪拌培養(yǎng)等都屬于好氧培養(yǎng)的方法。厭氧培養(yǎng)：除了最簡便的深層液體培養(yǎng)以外，可以采用物理、化學(xué)或生物學(xué)的方法來排除培養(yǎng)容器中的空氣或空氣中的氧氣，創(chuàng)造厭氧條件。對于嚴(yán)格厭氧的微生物，要用化學(xué)和物理并用的方法。在進(jìn)行厭氧培養(yǎng)時(shí)，可以用指示劑檢查系統(tǒng)中的還原條件，一般實(shí)驗(yàn)室中常用的如葡萄糖——美蘭指示劑。微生物的培養(yǎng)

－－微生物培養(yǎng)中的厭氧條件生物學(xué)方法：利用植物呼吸作用，造成厭氧條件，常用的方法是在密封的干燥器底部放入發(fā)芽種子，因種子的呼吸作用增強(qiáng)，吸收氧氣，創(chuàng)造厭氧條件。此法簡易，但厭氧程度低?；瘜W(xué)方法：利用焦性沒食子酸吸收容器中的氧氣。在容器的一邊放一包用吸水紙包好的焦性沒食子酸，在另一邊放入堿液，容器密封后，讓堿液流向焦性沒食子酸一邊，兩者反應(yīng)時(shí)吸收容器中的氧氣，創(chuàng)造厭氧條件。物理方法：常用真空泵抽出密封干燥器內(nèi)的空氣或再充入其它惰性氣體，以保證厭氧條件。抽氣前，容器內(nèi)放入指示劑和培養(yǎng)物。一般為達(dá)到嚴(yán)格厭氧目的，常采用物理和化學(xué)相結(jié)合并用的方法。微生物的培養(yǎng)

－－微生物培養(yǎng)中的厭氧培養(yǎng)美蘭氧化還原指示劑：0.006NNaOH0.015%美蘭溶液6％葡萄糖溶液上列三種溶液在使用時(shí)等量混合，加熱使美蘭退色，迅速放入?yún)捬豕拗?。微生物?xì)胞大小和數(shù)量的測定目的要求：學(xué)習(xí)使用目鏡測微尺和鏡臺(tái)測微尺在顯微鏡下測定微生物大小的方法；學(xué)習(xí)使用血球記數(shù)板測定微生物數(shù)量的方法。實(shí)驗(yàn)材料：顯微鏡、目鏡測微尺、鏡臺(tái)測微尺、細(xì)菌染色片、血球記數(shù)板、酵母菌懸液、蓋玻片、無菌滴管、西水紙、擦鏡紙、香柏油、二甲苯測定微生物的大小測定的工具：目鏡測微尺鏡臺(tái)測微尺測定微生物的大小目鏡測微尺的校正：在高倍鏡下，看清鏡臺(tái)測微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡，使目鏡測微尺與鏡臺(tái)測微尺的刻度平行，移動(dòng)推動(dòng)器，使目鏡測微尺的0點(diǎn)與鏡臺(tái)測微尺的某一刻度重合，然后，仔細(xì)尋找兩尺第二個(gè)完全重合的刻度。計(jì)算兩刻度間目鏡測微尺的格數(shù)和鏡臺(tái)測微尺的格數(shù)。由于鏡臺(tái)測微尺的刻度每格長10μm，所以可得：目鏡測微尺每格長度（μm）=（鏡臺(tái)測微尺格數(shù)×10）/目鏡測微尺格數(shù)

注意：校正目鏡測微尺必須針對特定的顯微鏡和附件（特定的接物鏡、接目鏡、鏡筒長度等）進(jìn)行，而且只能在這特定的情況下才可重復(fù)使用。菌體大小的測定：取下鏡臺(tái)測微尺，將細(xì)菌染色標(biāo)本置于載物臺(tái)上，然后在油鏡下用目鏡測微尺測量菌體的長和寬。測定微生物數(shù)量方法：活菌計(jì)數(shù)法——平板菌落計(jì)數(shù)法；總菌計(jì)數(shù)法——血球計(jì)數(shù)板或霍瑟（PeroffHausser）細(xì)菌計(jì)數(shù)板（二者原理和部件相同，只是厚薄不同而已）。

測定微生物數(shù)量本實(shí)驗(yàn)用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)酵母菌的數(shù)量取清潔無油的血球計(jì)數(shù)板，在計(jì)數(shù)室上面加蓋玻片。取酵母菌液，搖勻，用滴管由蓋玻片邊緣滴一小滴，使菌液自行滲入，計(jì)數(shù)室內(nèi)不得有氣泡。靜止5min后，用低倍鏡觀察并將計(jì)數(shù)室移至視野中央。高倍鏡下計(jì)數(shù)：隨機(jī)計(jì)數(shù)五個(gè)中格的平均值，然后求得每個(gè)中格的平均值。乘上16（或25）就得出一大格中的總菌數(shù)，最后再換算到每mL菌液中的含菌數(shù)。計(jì)算方法：注意事項(xiàng)：壓在方格線上的菌體，以壓在底線和右側(cè)線上的菌體計(jì)入本格內(nèi)；遇到有芽體的酵母時(shí)，若芽體和母體同等大，就按單個(gè)酵母計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)完畢后，血球計(jì)數(shù)板要立即清洗干凈，并用吸水紙吸干，最后用擦鏡紙擦干凈，并放回盒內(nèi)。（X1+X2+X3+X4+X5）5×25（或16）×10×1000×

稀釋倍數(shù)酵母菌細(xì)胞數(shù)/mL=細(xì)菌生理學(xué)檢查法

－－微生物保藏方法斜面冰箱保藏法：將菌種接在新鮮斜面培養(yǎng)基上，定溫培養(yǎng)長出豐滿菌苔后，一般形成芽孢的細(xì)菌要形成芽孢，形成孢子的微生物要長出孢子，貼上標(biāo)簽，放在試管架上，在棉塞部位用尼龍紙或防水紙包好，放入40C冰箱中保藏。一般每隔3個(gè)月至半年用新鮮培養(yǎng)基移植1次。方法簡便，實(shí)驗(yàn)室均采用。

缺點(diǎn)：移接代數(shù)太多，易產(chǎn)生變異、退化。石蠟封藏法：在已長好的斜面菌種上加入無菌液體石蠟油，高出斜面1cm直立試管放入冰箱保藏，適用保存細(xì)菌和放線菌。石蠟的處理：250mL三角瓶裝100mL液體石蠟，1.05kg/cm3高壓滅菌30min，然后放在1050C左右的烘箱中1h，使水分蒸發(fā)掉。砂土管保藏法：(可用于保藏產(chǎn)孢子的放線菌、霉菌和產(chǎn)芽孢的細(xì)菌）。1.砂土管的制備：取河沙若干，用40目過篩，出去大顆粒，加10％HCl后煮沸30min，除去有機(jī)質(zhì)（也可用10％HCl浸泡2—4h)。最后倒去酸水，用自來水沖洗至中性，烘干備用。另取0.3m以下非耕作層的瘦黃土若干，曬干磨細(xì)，過120目篩。2.按土：砂＝1：4的比例均勻混合，裝入指形管中，以1cm高為宜，塞上棉塞，160～1700C干熱滅菌2h。3.在新鮮菌種斜面上加入3mL左右的無菌水，用無菌接種環(huán)制成菌懸液，用無菌吸管吸取0.2～0.3mL的菌懸液放入每個(gè)砂土管中，用接種環(huán)拌勻，并貼上標(biāo)簽，注明菌名。4.菌液加好后，立即進(jìn)行抽真空干燥，要求在24h內(nèi)抽干，尤其是夏天要求較短時(shí)間內(nèi)抽干。搖散砂土，放干燥器內(nèi)冰箱保藏。冷凍真空干燥保藏法：此法一般常用于細(xì)菌或病毒一類的菌種保藏，常用脫脂牛奶或血清作為菌種的保護(hù)劑?！?接種、分離純化4.1接種

將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過程叫做接種。

4.1.1接種工具1．接種針

2.接種環(huán)

3.接種鉤

4.5.玻璃涂棒

6.接種圈

7.接種鋤

8.小解剖刀

圖4-1

接種和分離工具4.1.2無菌操作

培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養(yǎng)基上，這個(gè)過程叫做無菌接種操作。在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中的各種接種必須是無菌操作。

接種時(shí)，打開培養(yǎng)皿的時(shí)間應(yīng)盡量短。用于接種的器具必須經(jīng)干熱或火焰等滅菌。接種環(huán)的火焰滅菌方法：通常接種環(huán)在火焰上充分燒紅（接種柄，一邊轉(zhuǎn)動(dòng)一邊慢慢地來回通過火焰三次），冷卻，先接觸一下培養(yǎng)基，待接種環(huán)冷卻到室溫后，方可用它來挑取含菌材料或菌體，迅速地接種到新的培養(yǎng)基上。然后，將接種環(huán)從柄部至環(huán)端逐漸通過火焰滅菌，復(fù)原。不要直接燒環(huán)，以免殘留在接種環(huán)上的菌體爆濺而污染空間。

平板接種時(shí)，通常把平板的面傾斜，把培養(yǎng)皿的蓋打開一小部分進(jìn)行接種。在向培養(yǎng)皿內(nèi)倒培養(yǎng)基或接種時(shí)，試管口或瓶壁外面不要接觸底皿邊，試管或瓶口應(yīng)傾斜一下在火焰上通過。4.2接種法與純培養(yǎng)的分離技術(shù)含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱為混和培養(yǎng)物（Mixedculture）。如果在一個(gè)菌落中所有細(xì)胞均來自于一個(gè)親代細(xì)胞，那么這個(gè)菌落稱為純培養(yǎng)（Pureculture）。在進(jìn)行菌種鑒定時(shí)，所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物。得到純培養(yǎng)的過程稱為分離純化。

4.2.1平板劃線分離培養(yǎng)法

平板劃線分離培養(yǎng)法，用無菌的接種環(huán)取培養(yǎng)物少許在平板上進(jìn)行劃線，使培養(yǎng)物中混在的多種細(xì)菌在培養(yǎng)基表面分散生長，各自形成菌落，根據(jù)菌落的形態(tài)及特征，挑選單個(gè)菌落，經(jīng)過移種而獲得純種細(xì)菌（純培養(yǎng)）。分離細(xì)菌的方法很多，最常用的是平板劃線分離法。根據(jù)劃線的方式不同有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。（圖4-2）

圖4-2平板劃線分離法

1.斜線法

2.曲線法

3.方格法

4.放射法

5.四格法

1.曲線劃線分離法1)先將接種環(huán)火焰滅菌,待冷后取培養(yǎng)物少許;2)左手拿起平板，以中指為支點(diǎn)，并用拇指和食指將平板蓋打開；3)右手迅速將取有培養(yǎng)物的接種環(huán)從打開的空間插入平板內(nèi)，使接種環(huán)與培養(yǎng)基表面呈45℃角，在酒精燈上方5~6cm處劃線接種。先在平板上1/5處輕輕涂布，然后即可左右來回以曲線形式作連續(xù)劃線接種，線與線間留有適當(dāng)距離，將整個(gè)平板表面劃滿曲線；4)注明標(biāo)識(shí)后，置35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，一般在18~24小時(shí)后觀察結(jié)果。2.斜線(分區(qū))劃線分離法1)用接種環(huán)先將培養(yǎng)物涂布于平板1區(qū)并作數(shù)次劃線,再在2、3……區(qū)依次劃線。2)每劃完一個(gè)區(qū)域，均將接種環(huán)滅菌一次，待冷后再劃下一區(qū)域。3)每一區(qū)域的劃線均接觸上一區(qū)域的接種線1~2次，使接種量逐漸減少，以獲得單個(gè)菌落。4)其他操作與上述曲線劃線分離法相同。斜線接種示意圖3.方格劃線法

將培養(yǎng)物涂布于平板上1/5處，接種環(huán)經(jīng)火焰滅菌后，自1/5劃線處作平行劃線5~6條，將接種環(huán)滅菌后，劃垂直線5~6條，使呈正方形格。其他操作同前。

細(xì)菌在固體培養(yǎng)基表面只能在固定的地方生長繁殖，經(jīng)過一定的培養(yǎng)時(shí)間后，可形成肉眼可見的菌落。菌落中只含有一種細(xì)菌，而每種細(xì)菌的菌落各有其特征。菌落形態(tài)往往有助于初步識(shí)別細(xì)菌；還可以由此獲得細(xì)菌而進(jìn)行一系列的鑒定。

識(shí)別菌落的能力是從事微生物檢驗(yàn)人員的極為重要的基本功。菌落形態(tài)觀察1)大小:以mm表示。菌落的大小隨細(xì)菌種類、培養(yǎng)基及培養(yǎng)時(shí)間等條件而不同。同一種細(xì)菌在同一平板上，在密集處的菌落比疏散處小。因此，表示菌落大小時(shí)，應(yīng)注明培養(yǎng)基名稱。一般以培養(yǎng)18~24小時(shí)后，選散在處的菌落大小。1mm左右為小菌落；2~3mm為中等大；3mm以上為大菌落。2)形狀及邊緣：圓形、不規(guī)則、放射狀、樹根狀、邊緣整齊、波形、鋸齒狀、卷發(fā)狀等。3)隆起：平的、突起的、凸面的、凸形的等。4)表面：光滑（S型）、粗糙（R型）；有無光澤等。

圖4-3細(xì)菌的培養(yǎng)特征1.點(diǎn)狀2.圓形3.絲狀4.不規(guī)則形5.假根狀6.紡錘狀7.扁平8.隆起9.凸起10.墊狀11.臍狀

12.邊緣整齊13.波狀14.裂片狀15.嚙蝕狀16.絲狀17.卷發(fā)狀

18.絲線狀19.刺毛狀20.串珠狀21.疏展?fàn)?2.樹根狀23.假根狀

24.絲狀25.串珠狀26.乳頭狀27.絨毛狀28.樹根狀29.量杯狀30.蘿卜狀31.漏斗狀32.囊狀33.層狀34.絮狀35.環(huán)狀36.蹼狀37.膜狀5)構(gòu)造:均勻、露滴狀、顆粒狀、發(fā)狀、皺招狀等。6)顏色：無色、白色、灰色、灰白色或乳白色、熒光綠、金黃色、檸檬