分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)緒論課件

實(shí)驗(yàn)室規(guī)則（一）保持實(shí)驗(yàn)室安靜，認(rèn)真仔細(xì)地按實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。（二）穿戴好實(shí)驗(yàn)服。保持實(shí)驗(yàn)臺(tái)的清潔整齊。（三）愛(ài)護(hù)儀器，謹(jǐn)慎使用。節(jié)約使用藥品試劑，蒸餾水，自來(lái)水和電。（四）不得將高溫、強(qiáng)酸強(qiáng)堿、有毒污垢物品拋灑在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。（五）公用物品用畢放回原處，不得私自占有。（六）取完試劑應(yīng)將瓶蓋蓋好，切勿錯(cuò)蓋，用畢放回原處。（七）加熱、用電，使用劇毒腐蝕試劑應(yīng)注意安全操作，避免事故。（八）廢棄液體除指定有專(zhuān)門(mén)容器收集者外，應(yīng)倒入水池，并放水沖走，固體廢物倒入廢物缸內(nèi)。動(dòng)物尸體應(yīng)放入指定的容器中。（九）實(shí)驗(yàn)過(guò)程中自己不能解決或決定的問(wèn)題，切勿盲目處理，應(yīng)及時(shí)向指導(dǎo)教師反映取得幫助。（十）實(shí)驗(yàn)完畢，須將試劑排列整齊，整理好公用物品，將儀器洗凈收起。檫凈實(shí)驗(yàn)臺(tái)，請(qǐng)指導(dǎo)教師檢查，允許后方可離開(kāi)。成績(jī)?cè)u(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

50%實(shí)驗(yàn)+50%理論考試實(shí)驗(yàn)課8次，實(shí)驗(yàn)報(bào)告，實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)（包括遲到早退，著裝規(guī)范，實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范，實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生值日等），8次實(shí)驗(yàn)總分最后按比例計(jì)入總成績(jī)。實(shí)驗(yàn)報(bào)告存檔，不需歸還學(xué)生。理論考試內(nèi)容來(lái)自于講義及平時(shí)教學(xué)設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)題目：1免疫球蛋白IgG的分離純化與鑒定。2人血清白蛋白的提取純化及分子量的測(cè)定。3蛋清中溶菌酶的分離鑒定。4小鼠肝臟過(guò)氧化氫酶的分離純化及酶動(dòng)力學(xué)研究。5如何從動(dòng)物心肌細(xì)胞中提取乳酸脫氫酶同工酶？6如何提取真核細(xì)胞中的線(xiàn)粒體基因組DNA？7蛋白質(zhì)的表達(dá)具有一定的組織特異性，請(qǐng)以實(shí)驗(yàn)小鼠胰腺和肝臟為材料設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)羧肽酶A1酶原(procarboxypeptidaseA1)和白蛋白(Albumin)并計(jì)算這兩種蛋白質(zhì)在胰腺和肝臟中的表達(dá)量。8細(xì)胞色素氧化酶（Cytochromeoxidase）在肝臟中有三種亞型，即細(xì)胞色素氧化酶1，2和3，請(qǐng)以實(shí)驗(yàn)小鼠肝臟為材料設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)這三種酶的表達(dá)并計(jì)算它們的表達(dá)量?！斗肿俞t(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》——緒論——實(shí)驗(yàn)課程改革的基本思路教學(xué)目標(biāo)與課程安排

生物化學(xué)應(yīng)用化學(xué)的原理和方法，研究生命現(xiàn)象、生命的本質(zhì)、生命活動(dòng)及其規(guī)律的的學(xué)科。

醫(yī)學(xué)生物化學(xué)研究人體的化學(xué)組成、代謝、營(yíng)養(yǎng)、酶功能、遺傳信息傳遞、生物分子的相互作用等以及疾病的分子機(jī)制。通過(guò)研究，不僅從分子水平闡明生命現(xiàn)象及疾病分子機(jī)制，同時(shí)也可以為疾病的診斷及治療提供有效的措施。

醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)應(yīng)用遺傳學(xué)的理論與方法研究遺傳因素在疾病的發(fā)生、流行、診斷、預(yù)防、治療和遺傳咨詢(xún)等的作用機(jī)制及其規(guī)律的遺傳學(xué)分支學(xué)科。內(nèi)容包括遺傳的細(xì)胞和分子基礎(chǔ)、人類(lèi)染色體與染色體病、單基因遺傳病、多基因遺傳病、生化遺傳病、線(xiàn)粒體基因病、腫瘤遺傳、遺傳病的診斷和產(chǎn)前診斷等以及染色體制備和基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)等。

生物化學(xué)是分子生物學(xué)的基礎(chǔ)，分子生物學(xué)是生物化學(xué)的延伸和發(fā)展，遺傳學(xué)則是生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究的臨床學(xué)意義的直接體現(xiàn)，三門(mén)學(xué)科的關(guān)系可用下圖予以概括：

《醫(yī)學(xué)生物化學(xué)》、《醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)》、《醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)》，在學(xué)科發(fā)展上及實(shí)驗(yàn)技術(shù)上互相依賴(lài)的三門(mén)課程?！斗肿俞t(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》最大限度達(dá)到知識(shí)系統(tǒng)化、實(shí)驗(yàn)方法學(xué)習(xí)與技術(shù)訓(xùn)練的合理化。同時(shí)為培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新精神及提高綜合素質(zhì)打下良好基礎(chǔ)。根據(jù)本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)的目的及特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)充分考慮不同層次內(nèi)容及時(shí)間的合理安排。目的：除了應(yīng)用基本技能訓(xùn)練部分的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，本類(lèi)別實(shí)驗(yàn)還將學(xué)習(xí)PCR技術(shù)、蛋白印跡技術(shù)、人類(lèi)外周血染色體標(biāo)本制備及核型分析等。同時(shí)密切結(jié)合臨床問(wèn)題，有針對(duì)性訓(xùn)練學(xué)生從事臨床研究的思路及掌握自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的基本知識(shí)。綜合性實(shí)驗(yàn)及設(shè)置原則包括：人類(lèi)外周血染色體標(biāo)本的制備及核型分析；DMD基因突變檢測(cè)；綜合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究新技術(shù)介紹目的：現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展與多種新技術(shù)的發(fā)展與建立是密切相關(guān)的，由于本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)能掌握的技術(shù)有限，因此設(shè)置了通過(guò)理論教學(xué)與視頻觀摩相結(jié)合的課程來(lái)了解蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)、基因芯片技術(shù)、基于序列捕獲技術(shù)的二代測(cè)序技術(shù)及它們的臨床應(yīng)用。

第一層次：掌握基本實(shí)驗(yàn)技能

①蛋白質(zhì)、DNA提取方法及定量測(cè)定方法②電泳技術(shù)③層析技術(shù)④PCR技術(shù)⑤染色體標(biāo)本制備技術(shù)⑥蛋白印跡技術(shù)

第二層次：了解現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究新技術(shù)

①蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)②基因芯片技術(shù)

③基于序列捕獲技術(shù)的二代測(cè)序技術(shù)

第三層次：學(xué)習(xí)科研設(shè)計(jì)的基本思路通過(guò)本實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)達(dá)到目的：實(shí)驗(yàn)操作、新技術(shù)介紹、視頻觀摩合理穿插安排，便于有效利用時(shí)間。實(shí)驗(yàn)報(bào)告

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)及時(shí)整理和總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及記錄，按照下列順序?qū)懗鰧?shí)驗(yàn)報(bào)告：實(shí)驗(yàn)報(bào)告首頁(yè)：實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)（Thetitleofexperiment）；姓名；學(xué)號(hào)；班級(jí)；組別；同組同學(xué)；帶教教師；實(shí)驗(yàn)日期等。正文：①原理（Principle）；②操作步驟（Operationalprocedure）；③實(shí)驗(yàn)結(jié)果（Results）：包括照片、原始數(shù)據(jù)、計(jì)算過(guò)程及圖表等；④討論（Discussion）：對(duì)實(shí)驗(yàn)方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果和異?，F(xiàn)象進(jìn)行探討和評(píng)論，以及對(duì)于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的認(rèn)識(shí)、體會(huì)和建議。動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)的提取和含量測(cè)定

蛋白質(zhì)是生命現(xiàn)象的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，是生物體最重要的組成部分。因此，對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能研究，是生命科學(xué)的核心問(wèn)題。要研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，往往從細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)開(kāi)始，而對(duì)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定則是蛋白質(zhì)相關(guān)研究中的必備技術(shù)?；驹?/p>

動(dòng)物肝臟細(xì)胞比較脆弱，易于破碎，故本實(shí)驗(yàn)選用小鼠肝臟細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料。采用勻漿法將其破碎，然后加入樣品提取液使蛋白質(zhì)溶解，用高速離心法棄去細(xì)胞碎片。收集上清液后可進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析。為了防止蛋白酶的破壞，可在提取液中加入蛋白酶抑制劑。例如加入苯甲磺酰氟（PMSF）可以抑制絲氨酸蛋白酶和某些半胱氨酸蛋白酶；胃蛋白酶抑制劑，可抑制酸性蛋白酶；乙二胺四乙酸（EDTA）可抑制金屬蛋白酶。為了防止蛋白質(zhì)的巰基發(fā)生氧化，可加入一定量的還原劑如巰基乙醇、二硫蘇糖醇?？紤]到溶液中如存在重金屬離子（如鋁、銅、鐵離子）可能會(huì)與蛋白質(zhì)形成不溶復(fù)合物，可在溶液中加入一定濃度的EDTA。目前蛋白質(zhì)的含量測(cè)定常用的方法有定氮法、雙縮尿法（Biuret法）、Folin－酚試劑法（Lowry法）、考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）、BCA法和紫外吸收法。其中Bradford法和Lowry法靈敏度較高，比紫外吸收法靈敏10～20倍，比Biuret法靈敏100倍。Lowry法：該法的原理主要是根據(jù)蛋白質(zhì)中的肽鍵在堿性溶液中能與銅離子結(jié)合形成復(fù)雜的絡(luò)合物（類(lèi)似雙縮脲反應(yīng)）。由于蛋白質(zhì)中酪氨酸的存在，該絡(luò)合物在堿性條件下進(jìn)而與Folin－酚試劑形成藍(lán)色復(fù)合物。上述呈色反應(yīng)色澤深淺皆與蛋白質(zhì)含量成正比。因此通過(guò)比色，參照已知含量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的比色標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，可確定待測(cè)樣品的蛋白質(zhì)含量?？捡R斯亮蘭法：考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在一定范圍內(nèi)，考馬斯亮蘭G250-蛋白質(zhì)復(fù)合物在595nm下，吸光度與蛋白質(zhì)含量呈線(xiàn)性關(guān)系。故可以用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。Lowry法1．取16mm*150mm試管16支，標(biāo)明號(hào)碼，放置在試管架，在1～6號(hào)試管內(nèi)分別加入標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白（使用時(shí)取貯液用雙蒸水稀釋至0.5mg/mL）0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL，用雙蒸水補(bǔ)足至每管總體積0.5mL，在7、8號(hào)試管內(nèi)分別加入待測(cè)樣品25、50μL，并用雙蒸水補(bǔ)足至0.5mL（即將待測(cè)樣品稀釋20或10倍）。9～16號(hào)重復(fù)1～8號(hào)。2．各管加入2.5mL新配制的堿性銅溶液，立即搖勻，在室溫下放置10min。3．各管加入0.5mLFolin酚試劑應(yīng)用液，邊加入邊立即充分混合（用震蕩混合器），然后在室溫下放置30～60min（不要超過(guò)60min）。4．將標(biāo)準(zhǔn)樣品及待測(cè)樣品在可見(jiàn)光光度計(jì)上在550nm波長(zhǎng)下比色。5．根據(jù)已知含量的標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)得的吸光度做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，然后根據(jù)待測(cè)樣品的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出其蛋白質(zhì)含量。根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算出小鼠肝臟提取液的蛋白質(zhì)含量?？捡R斯亮蘭法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度1．取16mm*150mm試管16支，標(biāo)明號(hào)碼，放置在試管架，在1～6號(hào)試管內(nèi)分別加入標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白（使用時(shí)取貯液用雙蒸水稀釋至0.5mg/mL）0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mL，用雙蒸水補(bǔ)足至每管總體積0.1mL，在7、8號(hào)試管內(nèi)分別加入稀釋20、10倍的待測(cè)樣品0.1mL。9～16號(hào)重復(fù)1～8號(hào)。2．每管加入考馬斯亮蘭G250染料試劑3mL,搖勻，室溫靜置3分鐘。3．分光光度計(jì)于波長(zhǎng)595nm比色。4．根據(jù)已知含量的標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)得的吸光度做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，然后根據(jù)待測(cè)樣品的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出其蛋白質(zhì)含量。根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算出小鼠肝臟提取液的蛋白質(zhì)含量。紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度1．取16mm*150mm試管16支，標(biāo)明號(hào)碼，放置在試管架，在1～6號(hào)試管內(nèi)分別加入標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白（2mg/mL）0、0.3、0.45、0.6、0.75、0.9mL，用雙蒸水補(bǔ)足至每管總體積3mL，在7、8號(hào)試管內(nèi)分別加入稀釋100、50倍的待測(cè)樣品3mL。9～16號(hào)重復(fù)1～8號(hào)。2．以1號(hào)管為參比，用紫外分光光度計(jì)于波長(zhǎng)280nm處比色。3．根據(jù)已知含量的標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)得的吸光度做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，然后根據(jù)待測(cè)樣品的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出其蛋白質(zhì)含量。根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算小鼠肝提取液的蛋白質(zhì)含量。飯盒