認識色譜柱-反相色譜柱

色譜分離基本原理“兩相分配，相似相溶”色譜柱結(jié)構(gòu)色譜柱有方向性，主要與裝填技術(shù)有關(guān)。篩板的內(nèi)部孔形態(tài)會影響柱效規(guī)格內(nèi)徑長度粒徑碳載量孔徑比表面積材質(zhì)封端表觀規(guī)格：柱管材質(zhì)，填料分類，尺寸，粒徑隱藏信息：碳載量，平均孔徑，比表面積，封端，鍵合類型，pH范圍，最大耐壓，篩板孔徑等WatersXBridgeShieldRP184.6*250mm

5um柱效拖尾載樣量（體積）載樣量（濃度）分離度回收率你能正確連接它們嗎？填料硅膠等載體（正相色譜）硅膠+鍵合相（反相色譜）聚合物+鍵合相（離子交換，手性色譜柱等）整體柱（空間排阻色譜等）反相色譜C18填料硅膠注意：硅膠顆粒大小分布金屬殘留內(nèi)部孔徑實心核顆粒四乙氧基硅烷(TEOS)硅甲基嵌入型聚乙氧基硅烷(MPEOS)甲基三乙氧基硅烷(MTEOS)改性硅膠硅膠快速溶解嚴重的柱失效柱壽命短暫因嵌入硅甲基的阻擋,顆粒表面溶解速度明顯減緩柱壽命大大延長pH范圍可達1~11普通硅膠柱waters改性硅膠柱堿性條件下硅膠溶解單、雙、三官能團鍵合三官能團鍵合二官能團鍵合單官能團鍵合鍵合

碳載量影響殘留硅羥基比率

鍵合相流失率鍵合密度常見鍵合相

主要作用機理疏水疏水π-π疏水疏水氫鍵

π-π氫鍵氫鍵陽離子交換陰離子交換空間位阻：異丙基硅氧烷，異丁基硅氧烷增加pH范圍，但有限，一般1~9空間位阻AgilentPhenomenex空間位阻抗水解AgilentXDB極性嵌入Waters“Shield”內(nèi)嵌極性基團固定相：水表面層可能機理水“屏蔽”層改善與水的浸潤性－100%水溶液兼容降低了堿性化合物的保留降低了拖尾現(xiàn)象屏蔽了帶負電的硅羥基極性基團增加了表面層水的濃度

與鍵合相的疏水性作用雙重保留機理:1).與鍵合相的的疏水性作用;2).與殘余硅醇基間的離子交換作用O-SiO-SiO-

O-SiO-SiO-

O-SiO-

O-SiO-SiO-SiO-

O--SiO-SiO-SiO-SiOHO-SiO-SiOHO-SiOHO-SiO-SiO-SiOHO-SiO-Si(CH3)2HN+(CH3)2HN+當流動相pH值小于3時,硅醇基呈中性(未解離)

BaseBase對堿性化合物的保留及嚴重拖尾兩實驗使用相同的傳統(tǒng)C8硅膠柱離子交換作用堿性分析物在硅膠柱上的拖尾機理當流動相為pH6-8時,硅醇基帶負電性(大部解離)既然pH<3時硅醇基離解受抑制，為何不在所有情況下采用酸性條件進行分離?低pH可導(dǎo)致分離選擇性的喪失!---堿性基團離子化，極性增加pH7.0pH2.0amitriptylinenortriptyline常用封尾end-capped：三甲基硅氧烷極性封尾，增加極性保留由于空間位阻的存在，鍵合反應(yīng)最多只能覆蓋50%的硅羥基，超過一半硅羥基是活性硅羥基，與堿性基團會發(fā)生離子交換作用，增加了保留，導(dǎo)致峰形拖尾，用短鏈氯硅烷（如三甲基氯硅烷）鍵合活性的硅羥基，可以減小這種影響，這種操作被稱為封尾，封端，封口。封端封端–封口殘余硅羥基–減少不可逆吸附或拖尾–增加碳含量（0.1%-1%）封端現(xiàn)代色譜柱三大技術(shù)平臺親水AQ柱ECOSILODS-AQAtlantisDc18,T3SynergiHydro-RPHILIC柱Zic-HILICHypersilGOLDHILICAtlantisHILIC柱目的：提高極性化合物保留寬pH色譜柱ECOSILODS-ExtendXbridge/XterraC18/C8GeminiC18ZorbaxExtend目的：提高色譜柱pH使用范圍純硅膠柱ECOSILODS-SHPurospherSTARRP18eSymmetryC18極性嵌入柱ECOSILODS-EPSZorbax-BonusRP18SymmetryshieldRP18目的：改善峰形未濕潤的孔濕潤的孔注意：保留時間與填料表面積與配體有關(guān)。然而，如果硅膠表面未濕潤，那么有效的色譜表面積會減少95%，因此，減少被分析物的保留時間即等于“疏水塌陷”，記?。簬缀跛械谋砻娣e都在孔內(nèi)！低比例有機溶劑或純水溶液流動相C18

硅膠什么是“疏水塌陷”？疏水塌陷分0246810流動相：0.1%醋酸水溶液阿莫西林Vo：被分析物沒有保留“濕潤時”“去濕后”疏水塌陷此時色譜柱并沒有“壞”，如何復(fù)原：低比例有機相低流速沖洗過渡，然后高比例低流速。停流速后(孔去濕:~3%)流動相：0.1%醋酸水溶液Minutes0246810初始時保留時間無變化阿莫西林極性嵌入色譜柱：無疏水塌陷現(xiàn)象發(fā)生內(nèi)嵌極性基團鍵合相：使用高比例水溶液流動相時色譜性能穩(wěn)定疏水塌陷極性保留機理：離子交換+疏水作用1、極性封尾2、極性嵌入3、低碳載量4、保留硅羥基5、增加極性嵌入鍵合相AQ柱對極性與非極性化合物的優(yōu)異保留特性在100％水溶液流動相中運行保持色譜性能穩(wěn)定峰形優(yōu)異超低鍵合相流失，質(zhì)譜兼容酸性條件下穩(wěn)定性良好在高水相、低pH條件下具有較長的色譜柱壽命極佳的色譜柱間重現(xiàn)性碳載量低，不適合分離復(fù)雜組份和強堿性化合物

突破硅膠柱應(yīng)用禁區(qū)的有力手段優(yōu)點缺點無機基質(zhì)(C18–硅膠)

機械強度高柱效高保留穩(wěn)定

有限的pH應(yīng)用范圍對堿性分析物拖尾化學(xué)不穩(wěn)定性有機基質(zhì)(高聚物)

很寬的pH應(yīng)用范圍無離子型作用化學(xué)穩(wěn)定性好

機械強度不佳柱效低保留行為難以預(yù)測寬pH值色譜柱寬pH柱pH對填料穩(wěn)定性的影響高pH實驗pH>8時,許多C18硅膠基質(zhì)過早地喪失柱效由于填料顆粒溶解,色譜柱內(nèi)產(chǎn)生空隙隨著鍵合相覆蓋率的增加，色譜柱壽命延長低pH實驗pH<2時,許多C18硅膠基質(zhì)過早地喪失柱效由于鍵合相之水解作用,被測物喪失保留行為使用三官能團鍵合相可獲得最佳的穩(wěn)定性寬pH柱寬pH值色譜柱的幾種類型Agilent雙齒鍵合寬pH柱Waters雜化顆?；|(zhì)溶解度

(ppm)12345678910 12240-220-200-180-160-140-120-100-80-60-40-20-0-pH基質(zhì)溶解度曲線傳統(tǒng)硅膠柱適用范圍pH2-7

各種基質(zhì)的液相柱在高pH中溶解速率的比較液相柱基體材料的溶解導(dǎo)致柱前端形成空腔，由此而造成色譜峰畸形、分叉。現(xiàn)代超純硅膠柱適用范圍pH2-8寬pH值色譜柱適用范圍pH1-12柱效下降，柱壓升高的原因

鍵合相流失

保留時間的急劇下降是因為疏水塌陷

硅膠溶解坍塌死吸附，硅膠內(nèi)孔堵塞

篩板堵塞

稀釋劑與流動相差異大或流動相急劇變化導(dǎo)致的柱內(nèi)析晶壓力波動大致柱床松動，渦流效應(yīng)增大Q我的色譜柱壽命為何不長?

您是否有恰當?shù)臉悠非疤幚硎侄?

樣品前處理(凈化和富集)的好壞不僅影響分析結(jié)果的靈敏度和可靠性，而且直接影響色譜柱的壽命您的色譜柱是否有適當?shù)谋Ｗo措施?

在線過濾器保護柱您的色譜柱是否曾暴露在過于劇烈的分離條件?

使用某些對填料基體有腐蝕性的高濃度緩沖鹽

(如在中性或堿性pH區(qū)域使用高濃度緩沖鹽的磷酸鹽或硼酸鹽)

柱溫過高

將色譜柱暴露在極端pH的流動相中

Q選擇性與pH影響帶離子型官能團的待測物如：胺，羧酸及酚類等pH不影響不能發(fā)生電離的中性物質(zhì)的保留大多數(shù)藥物含有一個或多個離子型官能團pH變化引起的選擇性變化最大Q化合物從離子化狀態(tài)變化到非離子化狀態(tài)其保留因子變化10到30倍上述變化相當于有機溶劑的比例變化20%pH帶來最顯著的選擇性變化pH是方法開發(fā)最強有力的選擇性調(diào)節(jié)工具重要的方法開發(fā)為何要從新色譜柱開始？

隨使用條件和樣品潔凈度的不同，多數(shù)色譜柱在使用過程中可發(fā)生化學(xué)污染、表面狀態(tài)改變、基體材料部分溶解等等潛在變化。此類改變可導(dǎo)致柱內(nèi)填料的活化或鈍化，使其對某些化合物的分離選擇性加強或變劣。此類特殊分離選擇性常常是無法重復(fù)的。在此類舊色譜柱建立起來的方法將無法在新柱和其他舊色譜柱上得以重現(xiàn)，造成未來可能需要重新開發(fā)方法或進行大量針對儀器系統(tǒng)、色譜柱和流動相的不必要的診斷工作。

Q反相色譜柱的選擇小結(jié):常規(guī)應(yīng)用現(xiàn)代高純硅膠色譜柱：優(yōu)點：峰形好