生化實驗(七)-綜合性實驗之三-血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳 2013

綜合性實驗三

血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳1.掌握醋酸纖維膜電泳的基本原理及其臨床意義;2.掌握醋酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)的操作技術;3.熟悉電泳儀器的使用和操作。一、實驗目的：二、實驗原理：（一）電泳(electrophoresis)：帶電粒子在電場中向與其電性相反的電極方向泳動的現(xiàn)象。正極負極帶負電粒子帶正電粒子電泳技術指利用電泳現(xiàn)象對混合物進行分離分析的技術。1.球形帶電顆粒在電場作用下所受的力電場力F=XQ

(X－電場強度，Q－粒子所帶電荷)阻力F'=6πrηv

(r－粒半徑，η－介質(zhì)粘度，v－粒運動速度)當F=F'，(電泳達平衡)，XQ=6πrηv移項得v/X=Q/6πrη遷移率

(mobility):U=v/X=Q/6πηrv/X,

單位電場強度時粒子運動的速度帶電粒子的遷移率在一定條件下取決于粒子本身的性質(zhì)：即與其所帶電量成正比；與其半徑及介質(zhì)粘度成反比。移動速度:v=d/t(cm/秒)電場強度:X=E/l(伏特/cm)(單位距離內(nèi)電勢差)d/tE/ldlEt2.兩種不同物質(zhì)的電泳分離遷移率U=v/X=——=——

(單位:cm2·伏特-1·秒-1)物質(zhì)(A)在電場中移動的距離為dA=UA

·

Et/l物質(zhì)(B)在電場中移動的距離為dB=UB

·

Et/l兩物質(zhì)移動距離的差為Δd=dA-dB=(UA

–

UB)·

Et/l物質(zhì)A和B能否分離取決于兩者遷移率。如兩者的U相同，則不能分離；如有差別則能分離。兩物質(zhì)的分離距離：與電壓和電泳時間成正比，與電場的距離成反比。小結：帶電粒子的遷移率在一定條件下取決于粒子本身的性質(zhì)：即與其所帶電量成正比；與其半徑及介質(zhì)粘度成反比。兩物質(zhì)的分離距離：與電壓和電泳時間成正比，與電場的距離成反比。電泳法：利用在電場的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對樣品進行分離、鑒定或提純的方法和技術。（二）影響電泳速度的因素⒈樣品本身帶電量：Q

越多，v越大。分子大?。簉越小，v越大。形狀：球形分子>纖維狀分子。⒉電場強度：X

越大，v越大。d=U·Et/l

U=v/X=Q/6πηrV=d/t=U·E/l

=U·X

=Q·E/(6πηr·l)⒊緩沖液成分：性質(zhì)穩(wěn)定，不易電解。pH：pH-pI越大，Q越多，v越大。離子強度：0.02～0.2M。I越大，樣品電流減小，v變??；I越小，樣品電流越大，v越大，但樣品易擴散。⒋支持介質(zhì)：惰性材料，有一定堅韌度，易保存；吸附力要?。粺o電滲作用。電滲：液體對固體的相對移動，由緩沖液的水分子和支持介質(zhì)的表面之間所產(chǎn)生的一種相關電荷所引起。電滲與電泳方向相同，v

變大；反之變小。簡言之，在電場作用下液體對于固體支持物的相對移動稱為電滲（electro-osmosis）。原因：固體支持物多孔，帶可解離化學基團，常吸附溶液中正離子或負離子，使溶液相對帶負電或正電。如以濾紙作支持物時，紙上纖維素吸附OH-帶負電荷；而與紙接觸的水溶液因產(chǎn)生H3O+帶正電荷。因此，若樣品質(zhì)點在電場中移向負極，結果質(zhì)點的表現(xiàn)速度比其固有速度要快，若質(zhì)點是移向正極，則表現(xiàn)速度比其固有速度要慢，可見應盡可能選擇低電滲作用的支持物以減少電滲的影響。甚至，當電滲作用大于電泳時，樣品質(zhì)點可“不進反退”，向電泳相反方向移動。附：電滲⒌溫度：過高，產(chǎn)熱增加、水分蒸發(fā)，對電泳不利。產(chǎn)生熱量(Q=I2Rt)對電泳技術不利，因產(chǎn)熱可促使支持介質(zhì)上溶劑蒸發(fā)，而影響緩沖溶液離子強度。溫度升高，介質(zhì)粘度下降，分子運動加劇，自由擴散變快，遷移增加。為降低熱效應對電泳影響，可控制電壓或電流，也可安裝冷卻散熱裝置。對高壓電泳增設冷卻系統(tǒng)，防樣品變性?！鲇绊戨娪具w移率的因素：FrictionCharge外加電流、電壓分子量分子形狀分子的等電點VoltageCATHODEANODE+--+FrictionCharge在確定的條件下，某物質(zhì)的遷移率為常數(shù)，是該物質(zhì)的化學特征常數(shù)醋酸纖維薄膜電泳是用醋酸纖維素薄膜作為支持物的電泳方法。血清中各種蛋白質(zhì)的等電點在pH4.0～7.3之間，在pH8.6的緩沖溶液中均帶負電荷，在電場中向正極泳動。血清中各種蛋白質(zhì)的等電點不同，所以帶電荷量也不同。此外各種蛋白質(zhì)的分子大小各有差異，因此在同一電場中泳動的速度不同。分子小而帶電荷多者，泳動較快；反之，則較慢。（三）血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳原理+白蛋白(A)α1α2

βγ定量----將染色后的區(qū)帶分別剪開，將其溶與堿液，進行比色測定，計算各區(qū)帶的百分數(shù)。醋酸纖維素薄膜具有均一的泡沫狀結構（厚約120m），滲透性強，對分子移動的阻力很弱。用其作支持物進行電泳，具有微量、快速、簡便、分離清晰、對樣品無吸附現(xiàn)象等優(yōu)點?，F(xiàn)已廣泛用于血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、血紅蛋白、酶的分離和免疫電泳等方面。三、實驗器材1.電泳儀：為電泳提供直流電源。2.電泳槽：為電泳提供場所。多用有機玻璃制成，電極用鉑絲。3.血清加樣器：可用蓋玻片或X膠片或微量加樣器。4.醋酸纖維素薄膜：2cm×8cm5.其它：培養(yǎng)皿（直徑9-10cm）、濾紙、玻璃板、鑷子等。DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀DYY-Ⅲ型電泳槽

四、實驗試劑和材料1、巴比妥-巴比妥鈉緩沖液(pH=8.6，離子強度0.075)：稱取1.66g巴比妥和12.76g巴比妥鈉,置于大燒杯中，加蒸餾水約600ml，稍加熱溶解，冷卻后用蒸餾水定溶至1000ml。置4℃保存，備用。2、染色液：稱取0.5g氨基黑，甲醇50ml，冰醋酸10ml，蒸餾水加至100ml。3、漂洗液：取無水乙醇45ml，冰乙酸5ml和蒸餾水50ml，混勻置塞試劑瓶內(nèi)貯存。3、0.4N氫氧化鈉：稱取氫氧化鈉16.0g，蒸餾水加至1000ml1.醋酸纖維素薄膜的潤濕與選擇

將醋酸纖維素薄膜完全浸泡于緩沖液中5-10分鐘后。

每組取醋酸纖維素薄膜1張，取時用鑷子夾住薄膜一端，風干或置于試管上，晾干，注意區(qū)分薄膜的“光面”和“毛面”。

五、實驗操作步驟（一）儀器與薄膜的準備

2.電泳槽的準備

點樣時，先在醋酸纖維薄膜的無光澤面距一端1.5cm處，預先用鉛筆劃一條線作為點樣線，在緩沖液中浸泡10分鐘后，晾干，去除多余的緩沖液(防止樣品擴散稀釋)，用點樣器的邊緣沾上血清后，在點樣線上迅速地壓一下，使血清通過點樣器印吸在薄膜上，點樣力求均勻。（見圖）。此步是實驗的關鍵。醋酸纖維素薄膜規(guī)格及點樣位置示意圖（虛線處為點樣位置）（二）點樣

(先劃線，再浸泡)

將點樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上（點樣面朝下），另一端平貼在陽極端支架上(見下圖)。要求薄膜緊貼濾紙橋并繃直，中間不能下垂。

連接好電泳儀。在室溫下電泳，打開電源開關，調(diào)節(jié)電壓為100伏，電泳時間1hr。電泳后，調(diào)節(jié)旋鈕使電流為零，關閉電泳儀切斷電源。醋酸纖維薄膜電泳裝置示意圖1.濾紙橋2.電泳槽3.醋酸纖維素薄膜4.電泳槽膜支架5.電極室中央隔板（三）電泳

電泳完畢后將薄膜取下,用剪刀剪出個性小口（標記用），直接浸于氨基黑10B的染色液中，染2min取出。將薄膜從染色液中取出后用水沖洗后，依次在第一、第二、第三漂洗液中漂洗，最后再用清水漂洗一遍，直至可清晰分辨出5條色帶。風干或晾干。血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳圖譜示意圖（四）染色與漂洗

漂洗完畢后將薄膜取出,放在濾紙上。將薄膜上的5條色帶根據(jù)其顏色深淺、形狀、大小及相對位置進行描述、記錄在實驗報告本上，并判斷分析其結果。

注意事項：

薄膜和鉛筆畫示意圖均要提供，需要標示每條染色后條帶的名稱，并討論說明判斷原因。

（五）記錄和分析實驗結果六、注意事項1、薄膜的浸潤與選膜是電泳成敗的關鍵之一。2、點樣時，應將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，

吸水量以不干不濕為宜。3、點樣時，動作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞

膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果。4、點樣應點在薄膜的毛面上，點樣量要適量，不宜過

多或過少。5、電泳時應將薄膜的點樣端置于電泳槽的負極端，且

點樣面向下（為什么？）。6、應控制染色時間。時間長，薄膜底色不易脫去；時間

太短，著色不易區(qū)分，或造成條帶染色不均勻，必要

時可進行復染。臨床意義

血漿蛋白是血漿中最主要的固體成分,含量為60～80g/L,絕大部分由肝臟合成,僅γ球蛋白由漿細胞合成,正常值:白蛋白57%—72%α1球蛋白2%—5%α2球蛋白4%—9%β球蛋白6.5%—12%γ球蛋白12%—20%

血漿蛋白的主要功能:

維持血漿膠體滲透壓

調(diào)節(jié)血漿p