植物細(xì)胞工程-課件chater7plant anther cultureand hybriding

CHAPTER7

植物單倍體育種和花藥（粉）培養(yǎng)

第一節(jié)植物單倍體育種第二節(jié)花藥和花粉培養(yǎng)染色體是遺傳物質(zhì)的載體。染色體數(shù)目的變化會導(dǎo)致形態(tài)、解剖、生理、生化等諸多遺傳特性的變化。倍性變異與倍性育種自然界各物種的染色體數(shù)目是相對穩(wěn)定的，而且體細(xì)胞染色體數(shù)為性細(xì)胞的二倍。但植物細(xì)胞中染色體數(shù)目也會發(fā)生成倍增加或減少的現(xiàn)象。細(xì)胞含有3個以上染色體組的個體叫多倍體,僅含配子染色體數(shù)的個體叫做單倍體，這些都屬于倍性變異。本章主要介紹倍性變異的規(guī)律及其在植物育種中的應(yīng)用。在大多數(shù)生物的體細(xì)胞中，染色體都是兩兩成對的。體細(xì)胞中成雙的染色體可以分為兩套染色體,經(jīng)減數(shù)分裂形成的配子只含一套染色體,叫做一個染色體組(genome)

。染色體組(genome)與倍性人體細(xì)胞的染色體每一物種生殖細(xì)胞內(nèi)的全部染色體，在形態(tài)和功能上各不相同，但是包含了控制生物體生長發(fā)育、遺傳和變異的全部信息，這樣的一組完整的非同源染色體，叫做一個染色體組。單倍體在生物的體細(xì)胞中，染色體的數(shù)目不僅可以成倍地增加，還可以成倍地減少。體細(xì)胞中含有本物種配子染色體數(shù)的生物個體。例如，蜜蜂的蜂王和工蜂的體細(xì)胞中有32條染色體，而雄蜂的體細(xì)胞中只有16條染色體。像蜜蜂的雄蜂這樣，體細(xì)胞中含有本物種配子染色體數(shù)目的個體，叫做單倍體。對于二倍體生物而言，它的單倍體的體細(xì)胞中只含有一個染色體組。例如，玉米是二倍體，它的體細(xì)胞中含有2個染色體組、20條染色體，它的單倍體植株的體細(xì)胞中含有1個染色體組、10條染色體。單倍體植株經(jīng)過人工誘導(dǎo)使染色體數(shù)目加倍，重新恢復(fù)到正常植株的染色體數(shù)目，不僅能夠正常生殖，而且每對染色體上的成對的基因都是純合的，自交產(chǎn)生的后代不會發(fā)生性狀分離。因此，利用單倍體植株培育新品種，只需要兩年時間，就可以得到一個穩(wěn)定的純系品種。與常規(guī)的雜交育種方法相比，明顯地縮短了育種年限。早在20世紀(jì)70年代初，我國就開始用花藥體培養(yǎng)選育新品種，育成了“京花一號”小麥等新品種?！熬┗ㄒ惶枴毙←溗氪罅６啵S產(chǎn)性好，而且適應(yīng)性和抗病性強，現(xiàn)在已經(jīng)大面積推廣種植。多倍體體細(xì)胞中含有3個或3個以上染色體組的生物叫做多倍體。

多倍體的一般細(xì)胞體積比較大。因染色體增多，反映在個體的根、莖、葉、果實等顯粗大。所以農(nóng)業(yè)中把多倍體作為一種重要的育種方法。第一節(jié)植物單倍體育種單倍體植株的特性和利用單倍體育種及優(yōu)勢單倍體的獲得花藥培養(yǎng)花粉培養(yǎng)單倍體單倍體是指體細(xì)胞中含有本物種配子染色體數(shù)的生物個體。減數(shù)分裂形成的細(xì)胞就是單倍體細(xì)胞。配子是減數(shù)分裂產(chǎn)生的細(xì)胞，這種細(xì)胞中的全部染色體就稱為染色體組（也稱基因組），在這個染色體組中，各種染色體都只有一條，或者說，在一個染色體組中，各種染色體都只有一條，都是成單的。從染色體形態(tài)特征上看，單倍體染色體數(shù)只有二倍體的一半，因而其細(xì)胞的核變小，從而導(dǎo)致營養(yǎng)器官和繁殖器官變小，如氣孔、葉片、花藥、花較小及植株矮化；另一方面，單倍體植株的特點還常常是開花茂盛、較早、延續(xù)時間長、花粉粒顯著不正常，敗育（90～99%甚至更高），結(jié)實極少而籽粒小，所以常將不育性作為鑒別單倍體的標(biāo)志；單倍體植株的性狀有變化，能形成新的性狀，比如水稻單倍體可以變成無芒的、叢生性的、葉扭曲的等等。單倍體植株的特性單倍體育種

由于進行簡單染色體加倍后就可得到純合的二倍體，主要應(yīng)用于育種。

單倍體育種：

將具有單套染色體的單倍體植物，經(jīng)人工染色體加倍，使其成為純合二倍體。從中選出具有優(yōu)良性狀的個體，直接繁育成新品種；或選出具有單一優(yōu)良性狀的個體，作為雜交育種的原始材料，稱為單倍體育種。單倍體育種的優(yōu)勢：1、控制雜種分離，縮短育種周期2、排除顯隱性基因干擾，提高選擇效率3、作誘變材料提高誘變效率4、克服遠(yuǎn)緣雜交不育5、快速純化栽培品種單倍體育種控制雜種分離，縮短育種周期通常雜種材料必須經(jīng)過4-5代以上的近交分離和人工選擇，才能獲得主要性狀基本純合的基因型。而獲得單倍體后再進行人工加倍，只需一個世代就可以獲得純合二倍體，這就可以大大加速育種進程，縮短育種年限，節(jié)約人力、物力和土地資源等單倍體育種的優(yōu)勢傳統(tǒng)雜交育種需8~10年，單倍體育種只需2年時間就可得到純合體單倍體育種的優(yōu)勢排除顯隱性基因干擾，提高選擇效率等位基因雜交育種選擇頻率單倍體育種選擇頻率1對：Aa2對：Aa和Bb3對：Aa、Bb和Ccn對：Aa。。。(?)11/21*21/22*21/23*21/2n*2(?)3(?)2(?)n效率比1/211/221/231/2n以隱性純合體作為選擇目標(biāo)，傳統(tǒng)雜交育種和單倍體育種的選擇效率單倍體育種的優(yōu)勢3、誘變材料常規(guī)誘變難以使等位基因的兩個成員同時發(fā)生突變；隱性基因突變往往被顯性基因掩蓋而不能表現(xiàn)。4、遠(yuǎn)緣雜交克服遠(yuǎn)緣雜種因染色體無法正常配對而導(dǎo)致的不育。5、純化栽培品種通過對特定性狀植株的花粉進行培育，獲得單倍體植株進行加倍，得到純系。單倍體育種的優(yōu)勢單倍體的獲得1、自然篩選

1921年最早發(fā)現(xiàn)單倍體的曼佗羅，至今已發(fā)現(xiàn)高等植物中有20余科百余種有單倍體植株存在，但在自然界其頻率較低（0.001～0.01%），加之高度不育或完全不育，往往自生自滅。自發(fā)單倍體未能得到廣泛應(yīng)用。2、人工誘發(fā)單倍體育種單倍體的自然發(fā)生在自然條件下，玉米、高梁、水稻、番茄等高等植物，偶爾也會出現(xiàn)單倍體植株。單倍體的獲得自然發(fā)生孤雌生殖：由卵細(xì)胞不經(jīng)受精直接發(fā)育成胚和植株。孤雄生殖：由精細(xì)胞單獨發(fā)育形成胚和植株。無融合生殖：由反足細(xì)胞、助細(xì)胞等發(fā)育形成。體細(xì)胞減數(shù)分裂：幾率很小。人工誘發(fā)單倍體實驗誘導(dǎo)單倍體植物的產(chǎn)生是比較復(fù)雜的。因為單倍體植物常常是起源于單倍單性生殖，所以誘發(fā)單倍體方法的可歸結(jié)為不經(jīng)過受精作用、兩性核的融合而刺激配子發(fā)育。單倍體的獲得主要有兩種方式：

孤雄生殖：花藥（粉）培養(yǎng)，誘發(fā)小孢子單性發(fā)育形成植物體。

孤雌生殖：未受精子房或胚珠培養(yǎng)，誘發(fā)卵細(xì)胞單性發(fā)育形成植物體。早在1964年，印度的古哈（Guha）和馬赫西瓦里（Maheshwari）兩位教授就開始培養(yǎng)毛葉曼佗羅的花藥，直到1966年，他們從毛葉曼佗羅的花藥培養(yǎng)中得到了單倍體植株。他們的成功引起了世界范圍內(nèi)的花藥培養(yǎng)熱潮，至20世紀(jì)70年代，許多國家的科學(xué)家用花藥培養(yǎng)發(fā)得到了水稻、茶、甘藍(lán)、黑麥等單倍體植株。人工誘發(fā)孤雄生殖單倍體的獲得

許多研究者曾試圖利用異屬、種的花粉授粉，經(jīng)輻射線照射過的花粉授粉、延遲受粉、或借助于不正常溫度（低溫或高溫）影響花粉粒萌發(fā)或影響受精過程的正常進行等方法獲得具有單倍體胚的種子，從而得到單倍體植物。人工誘發(fā)孤雌生殖單倍體的獲得

此外，因發(fā)現(xiàn)雙胚或多胚種子長出的雙生苗或多生苗中單倍體出現(xiàn)的頻率常高于正常的單胚種苗，所以也試圖由雙生苗中分選出單倍體。或試用核替換、激素和化學(xué)藥劑處理、機械刺激子房等方法誘發(fā)單倍體。但迄今用這些方法尚未能有效地獲得大量的單倍體用于育種。人工產(chǎn)生單倍體以前所用的方法有：遠(yuǎn)緣雜交、延遲授粉、用射線照射花粉授粉、激素處理及激溫處理等。單倍體的獲得60年代中期，印度的Guha和Maheshwari首次報道由南洋金花花藥培養(yǎng)獲得大量花粉植株后，通過花藥培養(yǎng)產(chǎn)生單倍體的技術(shù)已被成功推廣到多種植物中，其中包括禾谷類作物和蔬菜等。利用花藥或花粉培養(yǎng)以及胚囊中單倍的卵細(xì)胞培養(yǎng)，在育種上取得了較好的成績。單倍體的獲得第二節(jié)植物花藥花粉培養(yǎng)技術(shù)

花藥培養(yǎng)方法，簡言之，就是把孢母細(xì)胞經(jīng)過減數(shù)分裂后處于發(fā)育某一階段的花藥從植株上取下來，在無菌操作條件下接種在人工合成的培養(yǎng)基上，經(jīng)過一段時間培養(yǎng)，花藥中的花粉經(jīng)細(xì)胞分裂和分化發(fā)育為植株。即離體培養(yǎng)條件使花粉改變自己的正常發(fā)育過程，進而形成單倍體植物。BACK離體培養(yǎng)小孢子發(fā)育成植物體的途徑花粉的配子體發(fā)育途徑花藥培養(yǎng)技術(shù)

自然狀況下，花粉(小孢子)發(fā)育形成雄配子體（2細(xì)胞或3細(xì)胞的花粉粒）花粉的孢子體發(fā)育途徑離體培養(yǎng)條件下，花粉最終形成完整的植株，類似由一個合子細(xì)胞發(fā)育形成孢子體的過程，因此，把花粉在離體培養(yǎng)條件下發(fā)育形成單倍體植株稱為花粉的孢子體發(fā)育途徑?；ㄋ幣囵B(yǎng)技術(shù)花粉的孢子體發(fā)育途徑A花粉孢子體的發(fā)育途徑

途徑ABC

孢子體第一次在配子體配子體配子體分裂發(fā)生的時間第一次分裂之后第一次分裂之前第一次分裂之后

參與形成孢子體NN2N、3N、4N的染色質(zhì)的量多N（2N、3N、3N）-X孢子體單倍體單倍體二、三、四倍體植株的倍性或多倍體或它們的非整倍體

花藥培養(yǎng)技術(shù)花粉的孢子體發(fā)育途徑B花藥離體培養(yǎng)的主要過程：誘導(dǎo)花粉形成愈傷組織誘導(dǎo)愈傷組織分化苗使幼苗生長健壯花藥培養(yǎng)技術(shù)花藥培養(yǎng)材料準(zhǔn)備誘導(dǎo)花粉脫分化、分裂分化培養(yǎng)和壯苗培養(yǎng)完整植物體形成馴化和移植花粉植株鑒定1、材料準(zhǔn)備

對花粉發(fā)育時期進行選擇。

挑選出適宜培養(yǎng)的花蕾以后，用一種適當(dāng)?shù)臏缇鷦┻M行表面消毒。然后在無菌條件下將花藥連同花絲一起夾出，置于一個無菌的培養(yǎng)皿中，取其中一個花藥，在醋酸洋紅中涂抹鏡檢，確定花粉的發(fā)育時期，如果發(fā)現(xiàn)符合要求，把其余雄蕊上的花藥輕輕地從花絲上摘下，水平地放在培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)（花藥培養(yǎng)）?；蛘哂眠@些花藥制備花藥懸浮液，以進行離體的花粉培養(yǎng)。在進行花藥培養(yǎng)的時候，必須注意在整個操作過程中不應(yīng)使花藥受到損傷，若受損傷，則應(yīng)淘汰，因為損傷常常會刺激花粉壁形成愈傷組織。逆境處理促進小孢子脫分化和再分化

培養(yǎng)前對花藥進行低溫、高溫、高糖等逆境處理，對啟動小孢子核分裂和愈傷組織形成起促進作用。

這一步是誘導(dǎo)花粉增殖，形成未分化的細(xì)胞團塊。培養(yǎng)水稻花藥一般用中國科學(xué)院北京植物所研制改良的N6培養(yǎng)基做基本培養(yǎng)基，添加2毫克/升2，4—D。接種時選用的花藥，以處在單核發(fā)育中后期的較好，從植株外部形態(tài)看是孕穗的早中期。每次接種前要取樣檢查，鏡檢花粉，以外部形態(tài)對照，然后便于取樣。誘導(dǎo)花粉形成愈傷組織花藥培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)愈傷組織分化苗

待愈傷組織長至2～4mm，就可以進行植株的誘導(dǎo)了。這一步仍在N6培養(yǎng)基上進行，但附加物不是2，4——D，而是2毫克/升吲哚乙酸和2毫克/升激動素。方法是將愈傷組織在無菌條件下轉(zhuǎn)移到添加過激動素等的分化培養(yǎng)基上，仍在25℃左右下培養(yǎng)，此時應(yīng)輔之以光照，自然光最好，日光燈類也可（6h/d）。

已分化得到的小苗，讓其繼續(xù)成長。一般不需再換培養(yǎng)基既可長到一定大?。?0cm左右）。然后拔去試管和培養(yǎng)瓶塞，置室溫下1～2天，再移至事先準(zhǔn)備好的瓦盆或直接移至大田，最初最好用薄膜或玻璃罩稍加維護，保持濕度，移栽時應(yīng)將苗根上的培養(yǎng)基洗凈。有的為了壯苗，在分化小苗芽長至1～2cm時移換一次培養(yǎng)基，在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上降低蔗糖濃度，并補加1毫克/升吲哚乙酸，待苗在此培養(yǎng)基上長至20cm左右再移出。

使幼苗生長健壯花粉植株的形態(tài)發(fā)生方式A、器官發(fā)生方式花粉粒經(jīng)均等分裂或不均等分裂，形成多細(xì)胞花粉粒，突破花粉壁形成不規(guī)則，松散的細(xì)胞團，即花粉愈傷組織。愈傷組織繼續(xù)培養(yǎng)，再生成單倍體植株。如甘藍(lán)、水稻等。B、類胚體發(fā)生方式花粉粒經(jīng)均等分裂或不均等分裂，形成多細(xì)胞花粉粒，經(jīng)進一步培養(yǎng)以胚狀體形式釋放出來，最后形成植物體。如曼佗羅、煙草等。誘導(dǎo)愈傷組織分化苗

待愈傷組織長至2～4mm，就可以進行植株的誘導(dǎo)了。這一步仍在N6培養(yǎng)基上進行，但附加物不是2，4——D，而是2毫克/升吲哚乙酸和2毫克/升激動素。方法是將愈傷組織在無菌條件下轉(zhuǎn)移到添加過激動素等的分化培養(yǎng)基上，仍在25℃左右下培養(yǎng)，此時應(yīng)輔之以光照，自然光最好，日光燈類也可（6h/d）。花藥培養(yǎng)技術(shù)

已分化得到的小苗，讓其繼續(xù)成長。一般不需再換培養(yǎng)基既可長到一定大小（20cm左右）。然后拔去試管和培養(yǎng)瓶塞，置室溫下1～2天，再移至事先準(zhǔn)備好的瓦盆或直接移至大田，最初最好用薄膜或玻璃罩稍加維護，保持濕度，移栽時應(yīng)將苗根上的培養(yǎng)基洗凈。有的為了壯苗，在分化小苗芽長至1～2cm時移換一次培養(yǎng)基，在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上降低蔗糖濃度，并補加1毫克/升吲哚乙酸，待苗在此培養(yǎng)基上長至20cm左右再移出。

使幼苗生長健壯花藥培養(yǎng)技術(shù)形態(tài)鑒定細(xì)胞學(xué)鑒定分子標(biāo)記鑒定如等位酶、RFLP、RAPD等進行分子標(biāo)記。單倍體植株的鑒定花藥培養(yǎng)技術(shù)自然加倍水稻的自然加倍頻率較高，?？蛇_(dá)50%左右或更高，所以一般不用采取特殊措施，也可得到若干株系，這樣效果較好，無副作用。人工加倍目前主要采取秋水仙素處理。使用的藥品濃度普遍是0.1～0.2%。處理方法有：小苗浸泡法、生長錐處理和培養(yǎng)基加倍。染色體的加倍花藥培養(yǎng)技術(shù)秋水仙素加倍染色體的原理秋水仙素（C22H25O6）與正在分裂的細(xì)胞接觸后，可抑制微管的聚合過程，不能形成紡錘絲，使染色體無法分向兩極，從而產(chǎn)生染色體加倍的核。

適宜濃度的秋水仙素溶液，能阻礙紡錘絲的形成，但對染色體結(jié)構(gòu)無明顯影響。處理的細(xì)胞在一定時間內(nèi)可恢復(fù)正常，重新進行分裂?；ㄋ幣囵B(yǎng)及單倍體應(yīng)用存在的問題1、誘導(dǎo)頻率低2、體細(xì)胞干擾3、倍性變異4、藥壁絨粘氈層對花粉發(fā)育的作用5、白化苗問題花藥培養(yǎng)技術(shù)花粉培養(yǎng)又稱小孢子培養(yǎng)。將花粉從花藥中分離出來成為分散或游離的狀態(tài)，通過培養(yǎng)使花粉啟動脫分化，進而發(fā)育成完整植株的一種技術(shù)。始于1953年。

花粉培養(yǎng)的特點

較之花藥培養(yǎng)，它對植物的遺傳變異和作物育種研究更具有重要意義：1、可排除花藥培養(yǎng)中花絲、藥壁等體細(xì)胞的干擾；2、便于實驗因果分析?；ㄋ幈诮M織為花粉脫分化機制分析增加了困難和干擾；3、一個花藥中花粉數(shù)目巨大，可減少試驗用材料；4、花粉除數(shù)量多，還具有單細(xì)胞、單倍性和較高同步性特點。直接培養(yǎng)直接分離花粉進行培養(yǎng)哺養(yǎng)培養(yǎng)以裂開的花藥（同種或異種）做哺育組織進行花粉培養(yǎng)（絨氈層的作用）花粉培養(yǎng)方式花粉培養(yǎng)

花藥培養(yǎng)一般在光照（12～18h，5000～10000lx）、28℃和黑暗（12～16h）、22℃周期交替的條件下進行。但最適培養(yǎng)條件因培養(yǎng)系統(tǒng)不同而異，應(yīng)分別確定。在對培養(yǎng)發(fā)生反應(yīng)的花藥中，壁組織逐漸變褐，并且因物種的不同，在培養(yǎng)3～8周后，由于花粉愈傷組織或花粉植株不斷生長所施加的壓力，藥壁破裂，當(dāng)花粉小植株長到3～5cm高時，將它們一個個的由愈傷組織剝離下來，轉(zhuǎn)移到另外一種培養(yǎng)基上，以促進根系發(fā)育。最后，將生根的植株移入小花盆內(nèi)的土壤中。稻、麥等的花藥培養(yǎng)先形成愈傷組織再分化，而煙草則形成胚狀體，可直接成苗。以水稻花藥培養(yǎng)單倍體植株為例介紹培養(yǎng)方法。

花藥接種后，置于25℃左右的條件下培養(yǎng)，不需加光，約一周后，花藥開始變?yōu)楹稚?，一般在一個月內(nèi)可以看到花藥裂開長出愈傷組織。愈傷組織出現(xiàn)頻率，一般雜種花藥比穩(wěn)定品種高，