第10章 吸光光度法

第10章吸光光度法10.1概述10.2吸光光度法基本原理10.3分光光度計(jì)10.4顯色反應(yīng)及影響因素10.5光度分析法的設(shè)計(jì)10.6吸光光度法的誤差10.7常用的吸光光度法10.8吸光光度法的應(yīng)用“目視比色法”“光電比色法”,測(cè)量顏色深淺的儀器出現(xiàn)了分光光度計(jì)，建立“分光光度法”。并且其原理已早不局限于溶液顏色深淺的比較。用光電比色計(jì)、分光光度計(jì)不僅可以客觀準(zhǔn)確地測(cè)量顏色的強(qiáng)度，而且還把比色分析擴(kuò)大到紫外和紅外吸收光譜，即擴(kuò)大到無(wú)色溶液的測(cè)定。10.1概述吸光光度法：分子光譜分析法的一種，又稱分光光度法，屬于分子吸收光譜分析方法基于外層電子躍遷10.1概述吸收光譜發(fā)射光譜散射光譜分子光譜原子光譜

與化學(xué)分析法相比，它有一些不同于化學(xué)分析法的特點(diǎn):靈敏度高準(zhǔn)確度高操作簡(jiǎn)便快速應(yīng)用廣泛10.1概述物質(zhì)的

顏色與

光吸收

的關(guān)系物質(zhì)顏色黃綠黃橙紅紫紅紫藍(lán)綠藍(lán)藍(lán)綠吸收光色紫藍(lán)綠藍(lán)藍(lán)綠綠黃綠黃橙紅波長(zhǎng)400-450450-480480-490490-500500-560560-580580-610610-650650-760白光綠紫橙青藍(lán)黃藍(lán)紅青有色光的互補(bǔ)色760650600560500480450400nm2

物質(zhì)顏色和其吸收光關(guān)系10.2吸光光度法基本原理1

吸收光譜產(chǎn)生的原因光:一種電磁波,波粒二象性

光譜名稱波長(zhǎng)范圍X射線0.1~10nm遠(yuǎn)紫外光10~200nm近紫外光200~400nm可見(jiàn)光400~750nm近紅外光0.75~2.5um中紅外光2.5~5.0um遠(yuǎn)紅外光5.0~1000um微波0.1~100cm無(wú)線電波1～1000m當(dāng)光子的能量與分子的E匹配時(shí)，就會(huì)吸收光子

E=hu=hc/l原子光譜為線光譜分子光譜為帶光譜電子躍遷能級(jí)分子振動(dòng)能級(jí)分子轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)分子內(nèi)部的運(yùn)動(dòng)和能級(jí)1、價(jià)電子運(yùn)動(dòng)分子的價(jià)電子可以在成鍵軌道和反鍵軌道間躍遷。電子能級(jí)差1～20eV，相當(dāng)于60～1250nm光子的能量。2、分子的振動(dòng)分子內(nèi)原子以平衡點(diǎn)為中心以非常小的振幅作周期性振動(dòng)。振動(dòng)能級(jí)差0.05～1eV，相當(dāng)于1250～2500nm光子的能量。3、分子的轉(zhuǎn)動(dòng)分子以其重心為軸轉(zhuǎn)動(dòng)。轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)差10-4～0.05eV，相當(dāng)于25～250um光子的能量。分子的能量E分子＝Ee＋Ev＋Er吸收光譜曲線：物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下吸收光的強(qiáng)度大小

A～l關(guān)系最大吸收波長(zhǎng)lmax：光吸收最大處的波長(zhǎng)3一些基本名詞和概念lmax4朗伯-比爾定律光吸收定律－朗伯-比爾(Lambert-Beer)定律吸光光度法的理論依據(jù)，研究光吸收的最基本定律I0=Ir+It+IaI0=It+IaI0IrItIa

T=It/I0,T:透射比或透光度

A=lg(I0/It)＝lg(1/T),A:吸光度朗伯定律（1760年）：光吸收與溶液層厚度成正比比爾定律（1852年）：光吸收與溶液濃度成正比當(dāng)一束平行單色光垂直照射到樣品溶液時(shí)，溶液的吸光度與溶液的濃度及光程（溶液的厚度）成正比關(guān)系－－－朗伯比爾定律－－－光吸收定律

數(shù)學(xué)表達(dá)：A＝lg(1/T)=Kbc其中，A:吸光度，T:透射比，

K:比例常數(shù)，b:溶液厚度，c:溶液濃度注意：平行單色光均相介質(zhì)無(wú)發(fā)射、散射或光化學(xué)反應(yīng)吸收光譜

A0.3000.2000.1000.000400500600

λ/nmλmax不同物質(zhì)的λmax不同，據(jù)此定性分析同一物質(zhì)的濃度越大，A越大，據(jù)此定量分析吸光度的加和性A1=e1bc1A2=e2bc2A

=e1bc1+e2bc2

根據(jù)吸光度的加和性可以進(jìn)行多組分的測(cè)定以及某些化學(xué)反應(yīng)平衡常數(shù)的測(cè)定在某一波長(zhǎng)，溶液中含有對(duì)該波長(zhǎng)的光產(chǎn)生吸收的多種物質(zhì)，那么溶液的總吸光度等于溶液中各個(gè)吸光物質(zhì)的吸光度之和摩爾吸光系數(shù)e靈敏度表示方法A=e

bcA=Kbcc:mol/L表示物質(zhì)的濃度為1mol/L,液層厚度為1cm時(shí)溶液的吸光度。單位：

(L?mol-1?cm-1)反映吸光物質(zhì)對(duì)光的吸收能力，也反映用吸光光度法測(cè)定該物質(zhì)的靈敏度。c:g/LA=abca:吸光系數(shù)桑德?tīng)?Sandell)靈敏度：S

當(dāng)儀器檢測(cè)吸光度為0.001時(shí)，單位截面積光程內(nèi)所能檢測(cè)到的吸光物質(zhì)的最低含量。單位：mg/cm2

S=M/e

氯磺酚S測(cè)定鋼中的鈮

50ml容量瓶中有Nb30μg，用2cm比色池，在650nm測(cè)定光吸收，A＝0.43,求S.(Nb原子量92.91)。根據(jù)A=εbC,求ε＝3.3×104L·mol-1·cm-1

1分光光度計(jì)的組成光源單色器樣品池檢測(cè)器讀出系統(tǒng)10.3吸光光度計(jì)紫外可見(jiàn)近紅外分光光度計(jì)紫外可見(jiàn)近紅外分光光度計(jì)紫外可見(jiàn)近紅外分光光度計(jì)常用光源光源波長(zhǎng)范圍(nm)適用于氫燈185~375紫外氘燈185~400紫外鎢燈320~2500可見(jiàn)，近紅外鹵鎢燈250~2000紫外，可見(jiàn)，近紅外氙燈180~1000紫外、可見(jiàn)（熒光）能斯特?zé)?000~3500紅外空心陰極燈特有原子光譜激光光源特有各種譜學(xué)手段單色器棱鏡單色器光柵單色器

利用光的衍射和干射作用制成的元件優(yōu)點(diǎn)適用波長(zhǎng)范圍寬色散均勻分辨率高缺點(diǎn)有重疊和相互干擾玻璃棱鏡用于350～3200nm波長(zhǎng)可見(jiàn)分光光度計(jì)石英棱鏡用于185～4000nm波長(zhǎng)紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)單色光純度由棱鏡的色散率和出射狹縫寬度決定吸收池－比色皿玻璃比色皿用于可見(jiàn)光石英比色皿用于λ＜400nm的紫外光

比色皿的質(zhì)量要求

無(wú)色透明耐腐蝕同一厚度的透光率誤差5%1cm2cm3cm0.5cm檢測(cè)器

作用：接收透射光，并將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)常用檢測(cè)器：光電管光電倍增管光二極管陣列光電管分為紅敏和紫敏，陰極表面涂銀和氧化銫為紅敏，適用625－1000nm波長(zhǎng)；陰極表面涂銻和銫為紫敏，適用200－625nm波長(zhǎng)10.4顯色反應(yīng)及影響因素要求：a.選擇性好b.靈敏度高

(ε>104)c.產(chǎn)物的化學(xué)組成穩(wěn)定d.化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定e.反應(yīng)和產(chǎn)物有明顯的顏色差別

(l>60nm)沒(méi)有顏色的化合物，需要通過(guò)適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)定量生成有色化合物再測(cè)定－－顯色反應(yīng)1顯色反應(yīng)大多數(shù)有機(jī)物可在紫外光區(qū)測(cè)定大多數(shù)無(wú)機(jī)離子無(wú)色或色淺，需要顯色絡(luò)合反應(yīng)氧化還原反應(yīng)2顯色反應(yīng)類型離子締合反應(yīng)成鹽反應(yīng)褪色反應(yīng)

Zr(IV)-偶氮胂III絡(luò)合物測(cè)定草酸吸附顯色反應(yīng)

達(dá)旦黃測(cè)定Mg(II),Mg(OH)2吸附達(dá)旦黃呈紅色3顯色劑無(wú)機(jī)顯色劑:

過(guò)氧化氫，硫氰酸銨，碘化鉀有機(jī)顯色劑：偶氮類：偶氮胂III三苯甲烷類三苯甲烷酸性染料鉻天菁S三苯甲烷堿性染料結(jié)晶紫

鄰菲羅啉類：新亞銅靈肟類：丁二肟4多元絡(luò)合物混配化合物

Nb-5-Br-PADAP-酒石酸

V-PAR-H2O離子締合物

AuCl4--羅丹明B金屬離子-配體-表面活性劑體系

Mo-水楊基熒光酮-CTMABa躍遷類型

價(jià)電子躍遷：σ→σ*,π→π*;n→σ*,n→π*

E(h)順序:n→π*<π→π*<n→σ*<σ→σ*

有機(jī)化合物的生色原理b生色團(tuán)和助色團(tuán)

生色團(tuán):含有π→π*躍遷的不飽和基團(tuán)助色團(tuán):含非鍵電子的雜原子基團(tuán),如-NH2,-OH,-CH3…

與生色團(tuán)相連時(shí)，會(huì)使吸收峰紅移，吸收強(qiáng)度增強(qiáng)5影響因素a溶液酸度（pH值及緩沖溶液）影響顯色劑的平衡濃度及顏色，改變?chǔ)

影響待測(cè)離子的存在狀態(tài)，防止沉淀

影響絡(luò)合物組成形式pHλmax(nm)形式pHλmax(nm)H4L+1.2462-465Sn4+1.0530H3L4.8-5.2462,490Ga3+5.0550H2L-8.4-9.0512HL2-11.4-12.0532-538pH對(duì)苯芴酮及其絡(luò)合物的顏色影響b顯色劑的用量稍過(guò)量，處于平臺(tái)區(qū)c顯色反應(yīng)時(shí)間針對(duì)不同顯色反應(yīng)確定顯示時(shí)間顯色反應(yīng)快且穩(wěn)定；顯色反應(yīng)快但不穩(wěn)定；顯色反應(yīng)慢，穩(wěn)定需時(shí)間；顯色反應(yīng)慢但不穩(wěn)定d顯色反應(yīng)溫度加熱可加快反應(yīng)速度，導(dǎo)致顯色劑或產(chǎn)物分解e溶劑f干擾離子

有機(jī)溶劑，提高靈敏度、顯色反應(yīng)速率消除辦法：提高酸度，加入隱蔽劑，改變價(jià)態(tài)選擇合適參比

褪色空白(鉻天菁S測(cè)Al，氟化銨褪色，消除鋯、鎳、鈷干擾)

選擇適當(dāng)波長(zhǎng)10.5光度分析法的設(shè)計(jì)1.選擇顯色反應(yīng)2.選擇顯色劑3.優(yōu)化顯色反應(yīng)條件4.選擇檢測(cè)波長(zhǎng)5.選擇合適的濃度6.選擇參比溶液7.建立標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)量條件選擇1測(cè)定波長(zhǎng)選擇選擇原則：“吸收最大，干擾最小”靈敏度選擇性2測(cè)定濃度控制控制濃度吸光度A：0.2～0.8減少測(cè)量誤差3參比溶液選擇儀器調(diào)零消除吸收池壁和溶液對(duì)入射光的反射扣除干擾試劑空白試樣空白褪色空白4標(biāo)準(zhǔn)曲線制作理論基礎(chǔ)：朗伯-比爾定律相同條件下測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度AA～c作圖10.6吸光光度法的誤差非單色光引起的偏移物理化學(xué)因素：非均勻介質(zhì)及化學(xué)反應(yīng)吸光度測(cè)量的誤差

對(duì)朗伯-比爾定律的偏移1非單色光引起的偏移復(fù)合光由l1和l2組成，對(duì)于濃度不同的溶液a和b,引起的吸光度的偏差不一樣，濃度大，復(fù)合光引起的誤差大，故在高濃度時(shí)線性關(guān)系向下彎曲?？朔菃紊庖鸬钠x：

使用較好的單色器，獲得較純的單色光應(yīng)將入射波長(zhǎng)選擇在被測(cè)物質(zhì)的最大吸收處選擇適當(dāng)?shù)臐舛确秶?，使吸光度讀數(shù)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)1非單色光引起的偏移非均勻介質(zhì)

膠體，懸浮、乳濁等對(duì)光產(chǎn)生散射，使實(shí)測(cè)吸光度增加，導(dǎo)致線性關(guān)系上彎2物理化學(xué)因素離解、締合、異構(gòu)等如：Cr2O72-+H2O-=2HCrO4-=2H++2CrO42-PAR的偶氮－醌腙式化學(xué)反應(yīng)a.控制溶液的酸度b.加入掩蔽劑c.改變干擾離子的價(jià)態(tài)d.選擇合適的參比溶液e.增加顯色劑用量f.分離3.顯色反應(yīng)的干擾和消除方法4吸光度測(cè)量的誤差A(yù)＝0.434

，T＝36.8%

時(shí)，測(cè)量的相對(duì)誤差最小A=0.2~0.8,T=15~65%，相對(duì)誤差<4%

dc/c=dA/A=dT/TlnT

Er=dc/c×100％=dA/A×100％=dT/TlnT×100％2.示差吸光光度法目的：提高光度分析的準(zhǔn)確度和精密度解決高(低)濃度組分(i.e.A在0.2~0.8以外)問(wèn)題分類：高濃度示差吸光光度法、低濃度示差吸光光度法、精密示差吸光光度法特點(diǎn)：以標(biāo)準(zhǔn)溶液作空白原理：A相對(duì)

=A=bcx-bc0=bc準(zhǔn)確度：讀數(shù)標(biāo)尺擴(kuò)展,相對(duì)誤差減少,

c0愈接近c(diǎn)x,準(zhǔn)確度提高愈顯著10.7常用的吸光光度法1.目視比色法例：硫脲還原－硫氰酸鹽比色法測(cè)定鋼鐵中的鉬。酸溶，硫酸－高氯酸介質(zhì)中，硫脲還原鐵（III）為鐵(II),除干擾，還原鉬（VI）為五價(jià)，2.00mg/100ml的鉬標(biāo)準(zhǔn)溶液為參比溶液，用2.00-2.30mg/100ml的鉬標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制工作曲線和測(cè)定樣品溶液的吸光度,480nm測(cè)定A。2.雙波長(zhǎng)吸光光度法目的：解決渾濁樣品光度分析消除背景吸收的干擾多組分同時(shí)檢測(cè)原理：

A=Al1-Al2=（l1-l2）bc

波長(zhǎng)對(duì)的選擇：a.等吸光度點(diǎn)法，b.系數(shù)倍率法3.導(dǎo)數(shù)吸光光度法選l1為參比波長(zhǎng),l2為測(cè)量波長(zhǎng)得

Al1=xl1bcx+

yl1bcyAl2=

xl2bcx+

yl2bcyΔA=Al2-Al1=(

xλ2bcx+

yl2bcy)-(

xl1bcx+

yl1bcy)在等吸光度的位置(G,F),

yl2＝

yl1，則上式成為

ΔA=(

xl2-