儀器分析 高效液相色譜法

第17章HPLC法17.1內(nèi)容提要17.1.1基本概念高效液相色譜法──在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜(GC)的理論，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測(cè)器，使之發(fā)展成為高分離速率、高分離效率、高檢測(cè)靈敏度的高效液相色譜法，易稱為現(xiàn)代液相色譜法。高效液相色譜儀──采用了高壓輸液泵、高效固定相和高靈敏度檢測(cè)器等裝置的液相色譜儀稱為高效液相色譜儀。梯度洗脫──用兩種(或多種)不同極性的溶劑，在分離過程中按一定程序連續(xù)的改變流動(dòng)相的濃度、配比和極性，使樣品中各組分能在最佳的分配比下出峰的操作技術(shù)。也稱為梯度淋洗。低壓梯度──又稱外梯度，特點(diǎn)是先混合后加壓。它是采用在常壓下預(yù)先按一定的程序?qū)⑷軇┗旌虾笤儆帽幂斎肷V柱系統(tǒng)，易稱為泵前混合。高壓梯度──又稱內(nèi)梯度，特點(diǎn)是先加壓后混合。它有兩臺(tái)高壓輸液泵、梯度程序器(或計(jì)算機(jī)及接口板控制)、混合器等部件組成。兩臺(tái)泵分別將兩種極性不同的溶劑輸入混合器，經(jīng)充分混合后進(jìn)入色譜柱系統(tǒng)，是一種泵后高壓混合形式。柱外效應(yīng)──由色譜柱以外的因素引起的色譜峰形擴(kuò)展的效應(yīng)。柱外因素常指從進(jìn)樣口到檢測(cè)器之間，除色譜柱以外的所有死時(shí)間，如進(jìn)樣器、連接管、檢測(cè)器等的死體積，都會(huì)導(dǎo)致色譜峰形加寬、柱效下降。液固吸附色譜法──以固體吸附劑為固定相，吸附劑表面的活性中心具有吸附能力，樣品分子被流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，它將與流動(dòng)相溶劑分子在吸附劑表面發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附性。K值大的強(qiáng)極性組分易被吸附，K值小的弱極性組分難被吸附，樣品組分因此被分離。液液分配色譜法──根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶(或部分互溶)的液體中溶解度的不同，有不同的分配，從而實(shí)現(xiàn)分離的方法。分配系數(shù)較大的組分保留值也較大。正相分配色譜法──流動(dòng)相極性低而固定相極性高的稱為正相分配色譜法。反相分配色譜法──流動(dòng)相極性高而固定相極性低的稱為反相分配色譜法?；瘜W(xué)鍵合相──利用化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合到載體表面上，形成均一、牢固的單分子薄層而形成的各種性能的固定相?；瘜W(xué)鍵合相色譜法──采用化學(xué)鍵合固定相的液相色譜方法。它分為正相和反相鍵合相色譜法。離子交換色譜法──以離子交換樹脂為固定相，水溶液為流動(dòng)相，利用待測(cè)樣品中各組分離子與離子交換樹脂的親和力的不同而進(jìn)行分離分析的液相色譜分析法。凝膠色譜法──以多孔性凝膠類物質(zhì)為固定相，以水溶液或有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，根據(jù)不同組分分子體積的大小進(jìn)行分離分析的液相色譜分析法。也稱為尺寸排阻色譜法。17.1.2基本內(nèi)容1.高效液相色譜儀的組成不論何種類型高效液相色譜儀，基本上分為四個(gè)部分：高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)。(1)輸液系統(tǒng)包括貯液罐、高壓輸液泵、梯度洗脫裝置等。(2)進(jìn)樣系統(tǒng)是將待分析樣品引入色譜柱的裝置，包括取樣、進(jìn)樣兩個(gè)功能。(3)分離系統(tǒng)主要是指擔(dān)負(fù)分離作用的色譜柱，它是色譜儀的心臟。對(duì)色譜柱的要求是柱效高、選擇性好、分析速度快等。(4)檢測(cè)系統(tǒng)中的檢測(cè)器可分為通用型檢測(cè)器(對(duì)樣品和洗脫液總的物理化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng))和選擇型檢測(cè)器(僅對(duì)待分離組分的物理化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng))。2.高效液相色譜法的特點(diǎn)分離效能高、選擇性高、檢測(cè)靈敏度高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣。3.高效液相色譜法幾種分離模式的分離原理及其應(yīng)用高效液相色譜法按組分在兩相間分離機(jī)理的不同主要可分為：液固吸附色譜法，液液分配色譜法，化學(xué)鍵合相色譜法，離子交換色譜法和凝膠色譜法(體積排阻色譜法)。各類型的分離原理以及應(yīng)用如下：模式分離原理應(yīng)用液固吸附色譜利用組分在固定相上的吸附能力不同而分離，采用非極性或弱極性流動(dòng)相，保留值取決于官能團(tuán)的類型和數(shù)目分離幾何異構(gòu)體，不同族化合物以及用于純化制備液液分配色譜根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶(或部分互溶)的液體中溶解度的不同，有不同的分配，從而實(shí)現(xiàn)分離的方法。分配系數(shù)較大的組分保留值也較大最適合同系物組分的分離正相鍵合相色譜利用組分在極性鍵合固定相與弱極性或非極性流動(dòng)相之間分配系數(shù)不同而分離，流動(dòng)相極性增大，保留值降低分離中等極性化合物反相鍵合相色譜采用非極性鍵合固定相和以水為底溶劑的極性流動(dòng)相，利用非極性基團(tuán)的疏水作用和極性基團(tuán)在流動(dòng)相中的二次化學(xué)平衡，如形成離子對(duì)、手性包絡(luò)物、酸堿平衡等進(jìn)行分離可分離極性較小的樣品，若利用二次化學(xué)平衡，可分離離子、離子型化合物，包括強(qiáng)酸強(qiáng)堿離子交換色譜及離子色譜組分離子與固定相平衡離子進(jìn)行動(dòng)態(tài)交換，根據(jù)不同組分離子對(duì)固定離子基團(tuán)的親和力的差別而達(dá)到分離的目的離子、離子型化合物或者在一定條件下可解離的化合物凝膠色譜以孔徑一定的多孔凝膠為填充劑，樣品按照尺寸差異進(jìn)行分離。小分子保留值大，大分子保留值小。根據(jù)孔徑尺寸范圍不同，有一定的相對(duì)分子質(zhì)量分離范圍高分子、生物大分子等4.高效液相色譜法的應(yīng)用和局限性HPLC具有高壓、高速率、高效率、高靈敏度等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于衛(wèi)生檢驗(yàn)、環(huán)境保護(hù)、生命科學(xué)、農(nóng)業(yè)、林業(yè)、水產(chǎn)科學(xué)和石油化工等領(lǐng)域，尤其適用于分離、分析不易揮發(fā)，熱穩(wěn)定性差的各種離子型化合物。例如，分離分析氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素、生物堿、糖類、農(nóng)藥等，在幾百萬種化合物中，可分離分析約80%的有機(jī)化合物。而其余20%的有機(jī)化合物，包括永久性氣體，易揮發(fā)低沸點(diǎn)及中等相對(duì)分子質(zhì)量的化合物，只能用氣相色譜法進(jìn)行分析。其局限性主要體現(xiàn)在：HPLC使用多種溶劑作流動(dòng)相成本高，易于引起環(huán)境污染；缺少GC中使用的通用型檢測(cè)器等。5.高效液相色譜常用的檢測(cè)器(1)紫外吸收檢測(cè)器其最重要的特征是對(duì)流動(dòng)相的脈沖和溫度變化不敏感，可用于梯度洗脫；主要缺點(diǎn)是對(duì)無紫外吸收的組分不響應(yīng)，而對(duì)紫外吸收較大的溶劑如苯不能作流動(dòng)相使用。(2)光電二極管陣列檢測(cè)器可獲得組分的三維圖譜，以獲得更多信息。(3)示差折光檢測(cè)器屬于通用型檢測(cè)器，應(yīng)用較多，主要缺點(diǎn)是對(duì)溫度變化特別敏感，且不適于梯度洗脫。(4)熒光檢測(cè)器屬于高靈敏度、高選擇性檢測(cè)器，僅對(duì)具有熒光特性的物質(zhì)有響應(yīng)，對(duì)流動(dòng)相脈沖不敏感，常用于梯度洗脫。6.高效液相色譜固定相液-固色譜固定相：可分為極性和非極性兩大類。極性吸附劑為各種無機(jī)氧化物，如：硅膠、氧化鋁等；非極性吸附劑最常見的是活性炭。不同類型的有機(jī)化合物，在極性吸附劑上的保留順序如下：氟碳化合物＜飽和烴＜烯烴＜芳烴＜有機(jī)鹵化物＜醚＜硝基化合物＜腈＜酯、酮、醛＜羥酸。液-液色譜固定相：由兩部分組成，一部分是作為載體的惰性顆粒，另一部分是涂在載體表面上的固定液。常用-氧二丙腈、聚乙二醇、角鯊?fù)榈?。?液色譜固定相不適合梯度洗脫?；瘜W(xué)鍵和固定相：常用非極性鍵合相有十八烷基鍵合相(ODS)、極性鍵合相有氨基鍵合相(強(qiáng)極性)、氰基鍵合相(中強(qiáng)極性)?；瘜W(xué)鍵合相的優(yōu)點(diǎn)：使用過程不流失；化學(xué)性能穩(wěn)定，在pH2～8的溶液中不變質(zhì)；熱穩(wěn)定性好，一般在70℃以下穩(wěn)定；載樣量大；適合梯度洗脫。7.高效液相色譜流動(dòng)相液相色譜的流動(dòng)相又稱為淋洗液、洗脫液等。流動(dòng)相的組成、極性改變可顯著改變組分分離狀況，故改變流動(dòng)相的組成和極性是提高分離度的重要手段。親水性固定液常采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定相的極性，而疏水性固定液常采用親水性流動(dòng)相。按組成不同流動(dòng)相可分為單組分(純?nèi)軇?和多組分，按極性可分為極性、弱極性、非極性，按使用方式則有固定組成(恒定)洗脫和梯度洗脫。常用作流動(dòng)相的溶劑有：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水等。可根據(jù)分離要求選擇合適的純?nèi)軇┗蚧旌先軇?。采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性，達(dá)到改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間的效果。8.液相色譜流動(dòng)相的選擇在選擇流動(dòng)相時(shí)，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。采用正相液-液分配分離時(shí)，首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時(shí)間太短，降低溶劑極性，反之增加，也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時(shí)間縮短，即梯度洗脫。17.2習(xí)題解答1.高效液相色譜儀一般分為幾個(gè)部分？從儀器構(gòu)造、分離原理、應(yīng)用范圍等方面比較氣相色譜與液相色譜的異同點(diǎn)。HPLCGC儀器組成高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)氣路系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、溫控系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理或記錄系統(tǒng)流動(dòng)相1.流動(dòng)相可為離子型、極性、弱極性、非極性溶液，可與被分析樣品產(chǎn)生相互作用，并能改善分離的選擇性；2.液體流動(dòng)相動(dòng)力黏度為10-3Pa·s,輸送流動(dòng)相壓力高達(dá)2～20MPa1.氣體流動(dòng)相為惰性氣體，不與被分析的樣品發(fā)生相互作用；2.氣體流動(dòng)相動(dòng)力黏度為10-5Pa·s,輸送流動(dòng)相壓力僅為，0.1～0.5MPa固定相1.分離機(jī)理：依據(jù)吸附、分配、篩析、離子交換、親和等多種原理進(jìn)行樣品分離，可供選用的固定相種類繁多2.色譜柱：固定相粒度小，為5～10μm；填充柱內(nèi)徑為3～6mm，柱長(zhǎng)10～25cm，柱效為103～104；毛細(xì)管柱內(nèi)徑為0.01～0.03mm，柱長(zhǎng)5～10m，柱效為104～105；柱溫為常溫1.分離機(jī)理：依據(jù)吸附、分配兩種原理進(jìn)行樣品分離，可供選用的固定相種類較多；2.色譜柱：固定相粒度大，為0.1～0.5mm；填充柱內(nèi)徑為1～4mm，柱長(zhǎng)1～5m，柱效為102～103；毛細(xì)管柱內(nèi)徑為0.1～0.3mm，柱長(zhǎng)10～100m，柱效為103～104；柱溫為常溫～400檢測(cè)器選擇性檢測(cè)器：UVD,PDAD,FD,ECD通用型檢測(cè)器：ELSD,RID選擇性檢測(cè)器：NPD,FPD,ECD通用型檢測(cè)器：TCD,FID(有機(jī)物)進(jìn)樣方式樣品制成溶液樣品需加熱汽化或裂解應(yīng)用范圍可分析低相對(duì)分子質(zhì)量、低沸點(diǎn)樣品；高沸點(diǎn)、中分子、高分子有機(jī)化合物(包括非極性、極性)；離子型無機(jī)化合物；熱不穩(wěn)定，具有生物活性的生物分子可分析低相對(duì)分子質(zhì)量、低沸點(diǎn)有機(jī)化合物；永久性氣體；配合程序升溫可分析高沸點(diǎn)有機(jī)化合物；配合裂解技術(shù)可分析高聚物注：柱效─用單位柱長(zhǎng)中的塔板數(shù)表示2.流動(dòng)相為什么要預(yù)先脫氣？常用的脫氣方法有哪些？答：流動(dòng)相中溶解氣體存在以下幾個(gè)方面的害處：氣泡進(jìn)入檢測(cè)器，引起光吸收或電信號(hào)的變化，基線突然跳動(dòng)，干擾檢測(cè)；溶解在溶劑中的氣體進(jìn)入色譜柱時(shí)，可能與流動(dòng)相或固定相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；溶解氣體還會(huì)引起某些樣品的氧化降解，給分離和分析結(jié)果帶來誤差。因此，使用前必須進(jìn)行脫氣處理。常用的脫氣法有以下幾種：低壓脫氣法(電磁攪拌，水泵抽空，可同時(shí)加熱或向溶劑吹氮?dú)猓蛔詣?dòng)在線脫氣)，吹氦脫氣法，超聲波脫氣法，加熱回流法。3.高壓輸液泵應(yīng)具備什么性能？答：它應(yīng)具備：流量穩(wěn)定，輸出壓力高，流量范圍寬，耐酸、堿和緩沖液腐蝕，壓力變動(dòng)小，更換溶劑方便，空間小，易于清洗和更換溶劑以及具有梯度洗脫功能等。4.在HPLC中，對(duì)流動(dòng)相的要求是什么？答：(1)與色譜柱不發(fā)生不可逆化學(xué)變化，保持柱效或柱子的保留值性質(zhì)長(zhǎng)期不變；(2)對(duì)待測(cè)樣品有足夠的溶解能力；(3)與所用檢測(cè)器相匹配；(4)黏度盡可能小，以獲得高柱效；(5)價(jià)格便宜，毒性小，易于純化。5.什么叫梯度洗脫？適用于哪些樣品的分析？與程序升溫有什么不同？答：梯度洗脫就是在分離過程中，讓流動(dòng)相的組成、極性、pH等按照一定程序連續(xù)變化，使樣品中各組分能在最佳的分配比下出峰，使保留時(shí)間短、擁擠不堪、甚至重疊的組分，或保留時(shí)間過長(zhǎng)而峰形扁平的組分獲得良好分離的一種操作形式。梯度洗脫特別適合于樣品中組分的分配比值范圍很寬的復(fù)雜樣品分析。梯度洗脫十分相似氣相色譜的程序升溫，兩者的目的相同。不同的是程序升溫是通過程序改變柱溫，當(dāng)流動(dòng)相和固定相不變時(shí)，分配比的變化是通過溫度變化引起的。而液相色譜是通過改變流動(dòng)相組成、極性、pH來達(dá)到改變分配的目的，一般柱溫保持恒定。6.在液相色譜中，提高柱效的途徑有哪些？其中最有效的途徑是什么？答：液相色譜中引起色譜峰擴(kuò)展的主要因素為渦流擴(kuò)散、流動(dòng)相傳質(zhì)、停留流動(dòng)相傳質(zhì)及柱外效應(yīng)。在液相色譜中要減小譜帶擴(kuò)展，提高柱效，要減少填料顆粒直徑，減小填料空穴深度，提高裝填的均勻性，采用低黏度溶劑作流動(dòng)相，流速盡可能低，同時(shí)要盡可能采用死體積較小的進(jìn)樣器、檢測(cè)器、接頭和傳輸管線。簡(jiǎn)答：即液相色譜中提高柱效的途徑主要有：1.提高柱內(nèi)填料裝填的均勻性；2.改進(jìn)固定相減小粒度；選擇薄殼型擔(dān)體；選用低黏度的流動(dòng)相；適當(dāng)提高柱溫。其中減小粒度是最有效的途徑。7.什么是化學(xué)鍵合固定相？它的突出優(yōu)點(diǎn)是什么？答：化學(xué)鍵合相是利用化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合到載體表面上，形成均一、牢固的單分子薄層而構(gòu)成各種性能的固定相。它的特點(diǎn)如下：(1)固定相不易流失，柱的穩(wěn)定性和壽命較高；(2)能耐受各種溶劑，可用于梯度洗脫；(3)表面較為均一，沒有液坑，傳質(zhì)快，柱效高；(4)能鍵合不同基團(tuán)以改變其選擇性，例如，鍵合氰基、氨基等極性基團(tuán)用于正像色譜法，鍵合離子交換基團(tuán)用于離子色譜法，鍵合C2，C4，C6，C8，C18，C22烷基和苯基等非極性基團(tuán)用于反相色譜法等。因此，它是HPLC較為理想的固定相。8.選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意什么？答：(1)盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)期積累損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。(2)避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失，酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。(3)試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀在柱中沉積。(4)流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測(cè)器的要求。當(dāng)使用紫外檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。9.指出