化學(xué)發(fā)光免疫分析與其他方法對比

化學(xué)發(fā)光免疫分析

免疫學(xué)檢測發(fā)展簡介

免疫學(xué)檢測主要是利用抗原和抗體的特異性反應(yīng)進行檢測的一種手段，由于其可以利用同位素、酶、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等對檢測信號進行放大和顯示，因此常被用于檢測蛋白質(zhì)、激素等微量物質(zhì)。免疫分析經(jīng)歷了放射免疫檢驗、熒光免疫檢驗、酶標(biāo)免疫檢驗等不同時期，化學(xué)發(fā)光免疫檢驗是免疫分析發(fā)展的一個新階段，它環(huán)保、快速、準(zhǔn)確的特點已得到人們的普遍認(rèn)識。

因此化學(xué)發(fā)光免疫分析是通往免疫檢驗完美境界的必經(jīng)之路。

表1.1中國免疫診斷現(xiàn)狀

中國國際（歐美為主）放射免疫法（ＲＩＡ）．興起于20世紀(jì)70年代，現(xiàn)仍普遍使用于縣級以上醫(yī)院；．產(chǎn)品處于衰退期；．廠商試劑與儀器共同開發(fā)，試劑基本系列化。．興起于20世紀(jì)60年代，現(xiàn)已基本退出臨床應(yīng)用；．產(chǎn)品生命周期已終結(jié)；．廠商試劑和儀器共同開發(fā)，試劑基本系列化。酶聯(lián)免疫法（ＥＬＩＳＡ）．興起于20世紀(jì)80年代，現(xiàn)普遍使用于各級臨床機構(gòu)，為我國臨床免疫診斷的基本方法；．產(chǎn)品處于成熟期；．廠商試劑與儀器共同開發(fā)，試劑尚未系列化。．興起于20世紀(jì)70年代，現(xiàn)仍在臨床應(yīng)用；．產(chǎn)品處于衰退期；．廠商試劑與儀器共同開發(fā)，試劑基本系列化?；瘜W(xué)發(fā)光免疫法（ＣＬＩＡ）．導(dǎo)入于20世紀(jì)90年代，現(xiàn)個別較大醫(yī)院開展個別項目；．產(chǎn)品處于導(dǎo)入期或成長期；．無廠商開發(fā)生產(chǎn)，完全依賴進口．興起于20世紀(jì)80年代，現(xiàn)已被臨床普遍使用，成為臨床免疫診斷的支柱方法；．產(chǎn)品處于成熟期；．廠商試劑與儀器共同開發(fā)，儀器自動化程度高，試劑系列化狀態(tài).化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)原理化學(xué)發(fā)光免疫分析（ChemiluminescenceImmunoassay，CLIA）是將化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光體系與免疫反應(yīng)相結(jié)合，用于檢測微量抗原或抗體的一種新型標(biāo)記免疫測定技術(shù)?；瘜W(xué)發(fā)光是在常溫下由化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的光的發(fā)射。其機制為某些化合物（發(fā)光劑或發(fā)光底物）可以利用一個化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的能量使其產(chǎn)物分子或反應(yīng)中間態(tài)分子上升至電子激態(tài)。當(dāng)此產(chǎn)物分子或中間態(tài)分子衰退至基態(tài)時，以發(fā)射光子的形式釋放能量（即發(fā)光）。免疫測定(immunoassay)是利用抗原體反應(yīng)來測定標(biāo)本中微量物質(zhì)的方法。1.使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。2.使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。

3.洗滌后加入發(fā)光底物，酶促使發(fā)光底物發(fā)光，通過專用的儀器檢測光子的數(shù)量，從而反算出未知抗原或抗體的濃度?；瘜W(xué)發(fā)光免疫檢測原理在化學(xué)發(fā)光免疫分析，其基本原理同酶聯(lián)免疫技術(shù)（ELISA），常采用雙抗體夾心法、競爭法、等反應(yīng)模式，

圖1.2雙抗體夾心法反應(yīng)原理示意圖

化學(xué)發(fā)光免疫檢測原理歷史發(fā)展產(chǎn)品的對比：

1、化學(xué)發(fā)光與酶免的對比

2、化學(xué)發(fā)光與放免的對比

3、化學(xué)發(fā)光與時間分辯熒光檢測的對比

4、化學(xué)發(fā)光的突出優(yōu)點化學(xué)發(fā)光與酶免的對比酶免原理：1.使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。2.使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。3.洗滌后加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺刊物定性或定量分析。

化學(xué)發(fā)光免疫檢測的靈敏度與可測范圍遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于酶免產(chǎn)品，兼具ELISA法簡便的操作方法與較短的反應(yīng)時間。

化學(xué)發(fā)光與酶免的對比表：酶標(biāo)化學(xué)發(fā)光測量精度定性/半定量測量定量測量人體傷害底物有致癌性無有效期較長長干擾因素較多極少測試項目少多化學(xué)發(fā)光與放免的對比放免原理是使用具有放射性的I125作標(biāo)記物，然后用測量射線計數(shù)儀放射性（125I）。對環(huán)境的污染及對身體的危害，已經(jīng)為重視環(huán)保的國家逐步取消。（如整個歐洲僅尚存幾個放免試驗室）125I的半衰期短而導(dǎo)致其試劑有效期短標(biāo)記物125I的穩(wěn)定性差，導(dǎo)致試劑盒批間、批內(nèi)的變異較大；標(biāo)準(zhǔn)曲線有效期短，必須每次定標(biāo)，造成浪費。

操作繁瑣，出報告時間長?；瘜W(xué)發(fā)光與放免的對比表：放免化學(xué)發(fā)光測量精度較高高人體傷害放射性無有效期較長長干擾因素較多極少測試項目較多多化學(xué)發(fā)光與時間分辨的對比：

時間分辨免疫檢測原理和化學(xué)發(fā)光基本一樣，只是標(biāo)記物改為稀土元素，不用發(fā)光底物但需要外在的穩(wěn)定光源照射，光的波長產(chǎn)生stoke位移，并有一個時間滯后以便于檢測波長改變后的光子數(shù)量。

1、化學(xué)發(fā)光成本低于時間分辨熒光免疫分析。

2、化學(xué)發(fā)光比時間分辨熒光免疫試劑盒更穩(wěn)定

3、化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒對對測試環(huán)境條件要求低。

4、化學(xué)發(fā)光不需要外光源，儀器可靠性更高化學(xué)發(fā)光與時間分辯熒光的對比：化學(xué)發(fā)光時間分辯熒光標(biāo)記物酶-發(fā)光底物兩級放大稀土離子，如銪穩(wěn)定性穩(wěn)定性非常好影響被標(biāo)記物的生物活性與免疫活性靈敏度靈敏稍高于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系接近中性酸性，易引起蛋白質(zhì)變性包被技術(shù)不透明微量孔壁吸附,提高分析靈敏度,降低本底采用透明微量孔壁吸附，孔壁的透明度會引起,本底干擾技術(shù)性新技術(shù)，很成熟新技術(shù)，不成熟干擾因素干擾極小容易受內(nèi)外源稀土離子的干擾測試項目

項目齊全(見試劑報價單)缺少部分項目。如：貧血（葉酸，鐵蛋白，維生素B12）化學(xué)發(fā)光免疫分析的優(yōu)點：

1．靈敏度高：這是CLIA關(guān)鍵的優(yōu)越性，其靈敏度可達(dá)10-16mol/L（RIA為10-12mol/L）。又如化學(xué)發(fā)光底物（如AMPPD）可檢測出的堿性磷酸酶的濃度比顯色底物要靈敏5х105倍。2．寬的線性動力學(xué)范圍：發(fā)光強度在4～6個量級之間與測定物質(zhì)濃度間呈線性關(guān)系。這與顯色的酶免疫分析吸光度（OD值）為2.0的范圍相比，優(yōu)勢明顯。雖然RIA也有較寬的線性動力學(xué)范圍，但放射性限制了其應(yīng)用。3．光信號持續(xù)時間長：輝光型（glowtype）的CLIA產(chǎn)生的光信號持續(xù)時間可達(dá)數(shù)小時甚至一天。簡化了實驗操作及測量?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析的優(yōu)點：

4．分析方法簡便快速：絕大多數(shù)分析測定均為僅需加入一種試劑（或復(fù)合試劑）的一步模式。

5．結(jié)果穩(wěn)定、誤差?。簶悠废抵苯幼约喊l(fā)光，不需要任何光源照射，免除了各種可能因素（光源穩(wěn)定性、光散射、光波選擇器等）給分析帶來的影響，使分析結(jié)果靈敏穩(wěn)定可靠。6．安全性好及使用期長：在上述優(yōu)點前提下，更免除了使用放射性物質(zhì)。到目前為止，還未發(fā)現(xiàn)CLIA的危害性。有效期可長達(dá)1年以上，放射免疫分析由于放射性同位素的衰變，一般有效期只有一個月，而酶聯(lián)的底物貯存性差，都無法與化學(xué)發(fā)光相比，有效期長可以提高勞動效率，也利于推廣應(yīng)用。

總結(jié)綜合以上優(yōu)點，目前已有的各種免疫分析尚沒有出其右者，現(xiàn)在國外發(fā)達(dá)國家在CLIA的研究和開發(fā)方面進展很快，已有全自動的化學(xué)發(fā)光（閃光型和輝光型）與電化學(xué)發(fā)光免疫分析等系列產(chǎn)品。我國在化學(xué)發(fā)光免疫分析方面的研究還比較落后，這就是我國急需研究和發(fā)展CLIA的原因。

基本性能對照表【化學(xué)發(fā)光免疫分析種類】

1.直接化學(xué)發(fā)光A吖啶酯發(fā)光原理：納米磁珠分離后的吖啶酯標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物，在含H2O2的強酸、強堿激發(fā)底物的作用下，快速發(fā)出可見光，通過光電倍增管進行光子計數(shù)，相對光強度RLU與待測抗原濃度成函數(shù)關(guān)系。特點：發(fā)光過程在5秒內(nèi)完成，激發(fā)發(fā)光程序簡單，測試速度快，但發(fā)光標(biāo)記物吖啶酯在緩沖液中不穩(wěn)定，易水解，影響試劑穩(wěn)定性。代表儀器：拜耳公司的ACS180?！净瘜W(xué)發(fā)光免疫分析種類】B異魯米諾發(fā)光原理：發(fā)光過程和原理與吖啶酯完全相同，但激發(fā)發(fā)光速度更快，在3秒內(nèi)完成整個過程，測試速度最快，而且克服了吖啶酯在緩沖液不穩(wěn)定、易水解的缺點。代表儀器：德國Byk–Sangtec公司的LIAISONC電化學(xué)發(fā)光原理：納米磁珠分離后的三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物，在三丙胺的作用下，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，發(fā)出可見光，通過光電倍增管進行光子計數(shù)，相對光強度RLU與待測抗原濃度成函數(shù)關(guān)系。特點：激發(fā)發(fā)光過程復(fù)雜，時間長，每一個發(fā)光過程約需25秒，測試速度慢。代表儀器：瑞士ROCHE公司的ELECSYS1010和ELECSYS2010。【化學(xué)發(fā)