PCR基本原理與應用-黃廷華

聚合酶鏈式反應長江大學動科學院PCR的用途體外擴增特異DNA片段的技術，能快速、特異地擴增目的DNA片段。能通過試管內的數小時反應將特定的DNA片段擴增數百萬倍。迅速獲取大量的單一核酸片段，為分子生物學研究提供了強大的工具。1953年，Watson和Crick提出DNA雙螺旋結構及半保留復制模型。1958年，Meselson和Stahl用實驗證實DNA半保留復制模型。70年代以來，人們采用兩種思路去嘗試建立基因的無性繁殖體系，一是基因克隆技術，二是體外擴增技術。發(fā)展歷程1971年，Khorana（美國MIT教授，1968年諾貝爾醫(yī)學獎得主）：“經過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因?！焙怂狍w外擴增最早設想被遺忘原因:（1）很難進行測序和合成寡核苷酸引物；（2）1970年Smith等發(fā)現(xiàn)了II型限制性內切酶，體外克隆基因已成為可能。1976年，臺籍科學家錢嘉韻（AliceChien）從黃石國家公園的嗜熱菌Thermusaquaticus中分離出熱穩(wěn)定的TaqDNA聚合酶。1985年，美國Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis發(fā)明聚合酶鏈反應（PolymeraseChainReaction，PCR），Saiki等首次應用PCR法成功地擴增了人-珠蛋白的DNA，并應用于鐮刀狀紅細胞貧血的產前診斷。1988年Saiki開始將耐熱性TaqDNA聚合酶應用于PCR，整個反應只加一次酶即可，擴增特異性和效率都明顯改善，操作大為簡化。1989年被譽為“分子年”，列PCR為十余項發(fā)明之首。1993年，Mullis榮獲諾貝爾化學獎。PCR的基本原理試管中進行的DNA復制反應，依據DNA半保留復制的機理；體外DNA分子于不同溫度下可變性和復性的性質；通過人為控制體外合成系統(tǒng)的溫度，使雙鏈DNA變成單鏈，單鏈DNA與人工合成的引物退火，DNA聚合酶使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈DNA。引物引物Mullis的構思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段94℃變性50-65℃退火XX℃延伸72℃94℃55℃PCR循環(huán)PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第1輪結束95℃第2輪開始PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第2輪結束PCR每一步的轉換通過溫度的改變控制。DNA模板解鏈（變性）、引物與模板結合（退火）、DNA聚合酶催化新生DNA的合成（延伸）三個步驟構成PCR反應的一個循環(huán)。此循環(huán)反復進行，可使目的DNA得以迅速擴增。理論擴增率：2n遞增（n為循環(huán)次數），25～30循環(huán)，目標DNA可增加109倍。實際擴增率：(１＋Ｘ)n，X為PCR的實際擴增率，平均約為75%。由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，擴增產物的增加，逐漸由指數形式變?yōu)榫€性形式，所以實際上進行30個循環(huán)后，擴增倍數一般可達106～107。以上“變性、退火、延伸”三部曲為PCR一輪循環(huán)。PCR反應體系與流程反應體系模板（DNA或RNA）引物TaqDNA聚合酶10×PCR緩沖液1.5～4

mM

Mg2+0.2

mM

dNTP反應流程預變性變性退火延伸延伸完全終止25～35循環(huán)一、PCR的反應體系引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP模板（template）Mg2+（magnesium）1、引物引物：決定PCR反應的特異性PCR產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增基本原則是最大限度地提高擴增效率和特異性，同時盡可能抑制非特異性擴增。引物設計的原則①引物長度：15-30bp，常用20bp左右—引物的有效長度不能大于38bp，否則最適延伸溫度會超過TaqDNA聚合酶的最適溫度（74℃），不能保證PCR擴增產物的特異性②引物擴增跨度：以500bp為宜—特定條件下可擴增長至10kb的片段③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜

—G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶

—ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，尤其3′端不應超過3個連續(xù)的G或C，因為這樣會使引物在G+C富集區(qū)引發(fā)錯誤延伸④避免引物內部出現(xiàn)二級結構和引物間互補

—特別避免3’端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異性的擴增條帶⑤引物3’端的堿基要求嚴格配對（不能做任何修飾）—特別是最末及倒數第二個堿基，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失?、抟?′端可修飾

—引物5′端限定著PCR產物的長度，但對擴增特異性影響不大；引物5′端堿基可不與模板DNA

互補而呈游離狀態(tài)；引物5′端最多可加10個堿基而對PCR反應無影響

3’5’3’5’限制性內切酶的識別序列啟動子序列定點突變探針標記⑦引物的特異性：—引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性⑧引物量：—每條引物的濃度0.1~0.5μM，以最低引物量產生所需要的結果為好—引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會2、酶及其濃度目前有兩種TaqDNA聚合酶供應天然酶：從水生嗜熱桿菌中提純基因工程酶：大腸菌合成一個典型的PCR反應約需酶量1-2.5U/100ul體系濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少DNA聚合酶

Klenow片段

T4DNA聚合酶

TaqDNA聚合酶（應用最廣）其他DNA聚合酶：TthDNA聚合酶

VentDNA聚合酶

PfuDNA聚合酶等Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)40506070809010010080604020Taq酶的保真性不高5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，無3’→5’外切活性;在PCR反應中如發(fā)生某些堿基的錯配，該酶是沒有校正功能的。保真性不如PfuDNA聚合酶等。3、dNTP的質量與濃度在PCR反應中，dNTP應為50～200μM，濃度過低會降低PCR產物的產量注意4種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制）,如其中任何一種濃度不同于其它幾種時（偏高或偏低），就會引起錯配高濃度的dNTP可與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性

4、模板DNA模板DNA的來源：

—微生物中提取DNA—從細胞中提取DNA：血細胞、絨毛、尿樣、毛發(fā)、精斑、口腔上皮細胞

—固定和包埋的組織標本：脫蠟、蛋白酶K消化模板DNA的濃度：0.1～2ug/100ul體系

—PCR產量隨模板DNA濃度的增加而顯著升高

—模板DNA濃度過高導致非特異性產物增加

5、Mg2+濃度Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應產物減少二、PCR的反應流程溫度與時間的設置循環(huán)次數常見問題1、溫度與時間的設置設置變性-退火-延伸三個溫度點標準反應中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40～60℃退火，然后快速升溫至70～75℃延伸，對于較短靶基因（長度100～300bp）可采用二溫度點法，將退火與延伸溫度合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸。1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍①變性溫度與時間：一般93℃～94℃，1min足以使模板變性若低于93℃則需延長時間但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。②退火(復性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的重要因素退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基因序列的長度對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃作為選擇最適退火溫度的起點較為理想引物的復性溫度

通過以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm（解鏈溫度）＝4(G+C)+2(A+T)復性溫度=Tm值－（5～10℃）在Tm值允許范圍內，選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合，提高PCR反應的特異性復性時間一般為30～60s，足以使引物與模板之間完全結合③延伸溫度與時間：TaqDNA聚合酶的生物學活性：

70～80℃150核苷酸/S/酶分子

70℃60核苷酸/S/酶分子

55℃24核苷酸/S/酶分子

高于90℃時，DNA合成幾乎不能進行③延伸溫度與時間：延伸溫度：一般選擇在70～75℃之間常用溫度為72℃過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。延伸反應時間：根據待擴增片段長度而定1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min（足夠）3～4kb的靶序列需3～4min擴增10kb需延伸至15min延伸時間過長會導致非特異性擴增對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些2、循環(huán)次數循環(huán)次數決定PCR擴增程度循環(huán)次數主要取決于模板DNA的濃度循環(huán)次數：選在30～40次之間循環(huán)次數越多，非特異性產物的量亦隨之增多如何提高PCR中的DNA聚合酶的保真性？在PCR反應體系中，除使用TaqDNA聚合酶，摻入少量的具有3′→5′外切酶活性的耐熱DNA聚合酶，如Pfu，Vent，Pwo等，錯配率可降為原來的1/10；Mg2+濃度盡可能低，但不影響DNA合成；減少高溫反應時間，這樣DNA熱損傷將減少；減少循環(huán)數。如何提高PCR擴增的特異性？升高退火溫度可增加引物與模板結合的特異性；縮短退火和延伸時間，可減少錯誤引發(fā)及多余的DNA聚合酶分子參與酶促延伸的機會；降低引物和酶的濃度也可以減少錯誤引發(fā)，尤其是能減少引物二聚體的引發(fā)；改變Mg2+的濃度可進一步提高擴增的特異性。引物設計的特異性；減少循環(huán)次數；熱啟動（HotStart）。即首先將模板變性，然后在較高溫度時加入TaqDNA聚合酶、引物及MgCl2等一些重要成分，這樣使得引物在較高溫度下與模板退火，提高了反應的嚴謹性，使擴增更特異；采用二對引物即外引物和內引物進行擴增來提高擴增的特異性。

RT-PCR及定量RT-PCR（1）RT-PCR（reversetranscription-PCR）原理：先在逆轉錄酶的作用下、以mRNA為模板合成互補的cDNA（complementaryDNA），再以cDNA為模板進行PCR反應。是一種快速、簡便、敏感性極高的檢測mRNA表達的方法。PCR技術的主要類型常用的兩種逆轉錄酶AMV（avianmyeloblastosisvirus）：酶活性最適溫度42℃MMLV（Moloneymurineleukemiavirus）：酶活性最適溫度37℃（2）定量RT-PCR（qRT-PCR）：利用RT-PCR對mRNA水平進行半定量或絕對定量分析。半定量RT-PCR選用在組織中普遍表達、表達量比較恒定的看家基因作為內源性基因標準看家基因和目的基因共同進行反轉錄計算出擴增后目的基因/看家基因的比值，從而達到半定量的目的半定量PCR的注意事項步驟：1.抽提RNA，2.反轉錄獲得cDNA，3.以cDNA為模板做PCRRNA抽提質量一定要好，注意污染內參的選擇，常用的有βactin和GAPDH倆中半定量RT-PCR應該在兩管中進行，既內參和目的基因各一管，這樣便于控制指數期和平臺期一定要摸清楚！實時熒光定量PCR常規(guī)半定量PCR技術：

—對PCR擴增反應的終產物進行定量（需要跑電泳）

—重復性差

—半定量實時定量PCR技術：通過熒光染料對PCR擴增反應中每一個循環(huán)的產物進行定量

實時熒光定量PCR原理在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析（1）熒光標記方法

可分為兩種：

—熒光探針（Taqman）

—熒光染料（SYBRGreen）（2）Ct值是熒光定量PCR的一個重要的概念，C代表Cycle，t代表threshold含義是：每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環(huán)數熒光域值（threshold）的設定PCR反應的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光