高效液氣相色譜法

第七章高效液相色譜分析法高效液相色譜儀主要分離類(lèi)型液相色譜固定相與流動(dòng)相影響分離的因素與分離類(lèi)型的選擇高效液相色譜法（highperformanceliquidchromatography,HPLC）：是20世紀(jì)60年代末繼氣相色譜法后迅速發(fā)展起來(lái)的現(xiàn)代液相色譜法。高效液相色譜儀：高效液相色譜法的特點(diǎn)（1）高效

柱效可達(dá)每米105理論塔板數(shù)。（2）高速幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)完成。（3）高靈敏度

檢測(cè)限可達(dá)10-9至10-11g。（4）自動(dòng)化程度高

大多數(shù)HPLC儀配備計(jì)算機(jī)，特別是色譜專(zhuān)家系統(tǒng)的使用，實(shí)現(xiàn)了高效液相色譜儀的自動(dòng)化。（5）應(yīng)用范圍廣沸點(diǎn)高、相對(duì)分子質(zhì)量大、熱穩(wěn)定性差的有機(jī)物，都可采用HPLC分析。約75%－80%的有機(jī)物。第一節(jié)高效液相色譜儀高效液相色譜儀一般由四大部分組成：?高壓輸液系統(tǒng)?進(jìn)樣系統(tǒng)?分離系統(tǒng)?檢測(cè)系統(tǒng)一、高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng)由貯液罐、高壓輸液泵、過(guò)濾器、梯度洗脫裝置和壓力脈動(dòng)阻滯器等組成。1、高壓輸液泵（highpressurepump）：核心部件。作用是將流動(dòng)相在高壓下連續(xù)不斷地送入液路系統(tǒng)，保證流動(dòng)相正常工作。（動(dòng)畫(huà)）

2、梯度洗脫裝置：將兩種或兩種以上性質(zhì)不同但能互溶的溶劑，按一定程序連續(xù)改變其配比，以改變流動(dòng)相的極性、離子強(qiáng)度和溶液的PH值等，從而改變被測(cè)組分的相對(duì)保留值，提高分離效率，縮短分析時(shí)間。類(lèi)似氣相色譜的程序升溫。（1）低壓梯度裝置：在常壓下將不同溶劑按一定配比混合，然后借助一臺(tái)高壓泵，將混合好的流動(dòng)相壓入色譜柱中。（2）高壓梯度裝置：采用多元高壓泵，將不同溶劑按一定配比吸入混合室，在高壓下進(jìn)行混合，然后進(jìn)入色譜柱，程序控制每臺(tái)泵的輸出量。二、進(jìn)樣系統(tǒng)采用六通閥進(jìn)樣。優(yōu)點(diǎn)：進(jìn)樣時(shí)可保持系統(tǒng)的高壓；進(jìn)樣量準(zhǔn)確；重現(xiàn)性好；自動(dòng)化程度高；可用于分析和制備。三、分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)包括色譜柱、連接管、恒溫器等。1、色譜柱是色譜儀的“心臟”，由柱管和固定相組成。一般采用不銹鋼管，也可用厚壁玻璃和石英管。柱長(zhǎng)：10－30cm，直型。內(nèi)徑：2－6mm。注意事項(xiàng)：（1）一般色譜柱不能反沖，除非特別注明。（2）避免壓力和溫度的急劇變化及機(jī)械震動(dòng)。（3）正確使用流動(dòng)相。（4）在柱前安裝一個(gè)預(yù)柱。（5）使用結(jié)束時(shí)用純?nèi)軇_洗，柱內(nèi)充滿甲醇或乙腈擰緊柱塞保存。柱體：恒溫水浴夾套，適用于70℃以下。電熱恒溫裝置，室溫到150℃

。2、恒溫器四、檢測(cè)系統(tǒng)1、紫外可見(jiàn)光度檢測(cè)器（ultravioletvisibledetector）應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)器。檢測(cè)原理：被分析組分對(duì)特定波長(zhǎng)的紫外光或可見(jiàn)光有選擇性吸收，待測(cè)組分濃度與吸光度的關(guān)系服從Lamber-Beer定律。?固定波長(zhǎng)型：波長(zhǎng)254nm?波長(zhǎng)連續(xù)可調(diào)型：波長(zhǎng)190－800nm?掃描型：190－700nm紫外可見(jiàn)光度檢測(cè)器可分為：以低壓汞燈作光源，光源單色性好，波長(zhǎng)一般固定為254nm。適合于對(duì)多種有機(jī)化合物的分析。（1）固定波長(zhǎng)型（2）波長(zhǎng)連續(xù)可調(diào)式鎢燈和氘燈作光源，波長(zhǎng)從190－800nm連續(xù)可調(diào)。樣品可以在最大的吸收峰處進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度高。應(yīng)用廣泛。（3）光電二極管陣列型光電二極管排列成陣作為檢測(cè)元件，在波長(zhǎng)為190－700nm之間作快速掃描，可獲得三維色譜光譜流出曲線。靈敏度高、分辨率好、方便快速、結(jié)果準(zhǔn)確。光電二極管陣列檢測(cè)器（1）靈敏度高，最小檢測(cè)濃度為10-9g/ml；（2）線性范圍寬；（3）對(duì)溫度和流速不敏感，可用于梯度洗脫；（4）應(yīng)用范圍廣，可用于多類(lèi)有機(jī)物的檢測(cè)。缺點(diǎn)：使用的溶劑在測(cè)定波長(zhǎng)下無(wú)吸收；只能分析在紫外或可見(jiàn)光區(qū)有吸收的物質(zhì)。紫外－可見(jiàn)光度檢測(cè)器的特點(diǎn)：2、熒光檢測(cè)器（fluorescencedetector）具有某種特殊結(jié)構(gòu)的化合物受紫外光激發(fā)后，能發(fā)射出比激發(fā)光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的熒光，在一定條件下其熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成線性關(guān)系。只適用于能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)及通過(guò)衍生技術(shù)生成熒光衍生物的檢測(cè)。檢測(cè)原理：利用氙燈作激發(fā)光源，可在250－600nm范圍內(nèi)發(fā)射連續(xù)光譜，采用光柵作分光元件。熒光檢測(cè)器示意圖（1）靈敏度更高，檢測(cè)限可達(dá)10-12－10-13ml；（2）選擇性好，只能檢測(cè)能夠產(chǎn)生熒光及衍生后能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)；（3）對(duì)溫度和流速的改變不敏感，可以進(jìn)行梯度洗脫；（4）所需試樣量少，適用于痕量分析；（5）應(yīng)用范圍較廣，既可檢測(cè)接受紫外光照射后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)，也可以檢測(cè)本身不能產(chǎn)生熒光，但和某種熒光劑反應(yīng)后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)。熒光檢測(cè)器的特點(diǎn)：3、電化學(xué)檢測(cè)器（electrochemicaldetector）對(duì)于既無(wú)紫外吸收又不能產(chǎn)生熒光，但具有電化學(xué)活性的物質(zhì)，可以用電化學(xué)檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。電化學(xué)檢測(cè)器的種類(lèi)：電導(dǎo)、庫(kù)侖、極譜、安培、電位檢測(cè)器等。其中安培檢測(cè)器最常用。檢測(cè)原理：測(cè)量電流與氧化還原物質(zhì)的濃度成正比。靈敏度高，檢測(cè)限可達(dá)10-12g/ml；選擇性好，只能檢測(cè)具有氧化還原性質(zhì)的物質(zhì)；線性范圍寬，3－4個(gè)數(shù)量級(jí)；設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低、易于操作。缺點(diǎn)：需用緩沖液作流動(dòng)相；電極表面易發(fā)生吸附、催化、氧化還原等現(xiàn)象；一般不能用于梯度洗脫。安培檢測(cè)器的優(yōu)點(diǎn)：第二節(jié)主要分離類(lèi)型按分離機(jī)理不同分類(lèi)：吸附色譜分配色譜離子交換色譜尺寸排阻色譜親和色譜其中分配色譜法應(yīng)用量廣泛。按固定相與流動(dòng)相之間相對(duì)極性的大小分類(lèi)：正相色譜（positivephasechromatography）：流動(dòng)相的極性較弱，固定相極性較強(qiáng)。適用于強(qiáng)極性化合物的分離。它往往是一種混合溶劑，由非極性烴類(lèi)溶劑如己烷、庚烷、異辛烷等及適量的極性溶劑如氯仿、醇、乙腈等配成。正相鍵合相色譜法適用于分離中等極性化合物，如脂溶性維生素、甾族、芳香醇、芳香胺、脂、有機(jī)氯農(nóng)藥等。反相色譜（reversedphasechromatography）流動(dòng)相極性較強(qiáng)，固定相極性較弱。適用于分離弱極性的化合物。固定相一般為C18和C8。在反相鍵合相色譜中，極性大的組分先流出，極性小的組分后流出。第三節(jié)液相色譜的固定相及流動(dòng)相一、固定相（一）液－固吸附色譜固定相是具有吸附活性的吸附劑：硅膠、氧化鋁、氧化鎂、硅酸鎂、分子篩、聚酰胺、活性炭等，極性非極性硅膠是應(yīng)用是最廣泛的吸附劑。1、表面多孔型（superficiallyporous）－薄殼型（pellicularbead）：在惰性物質(zhì)的硬殼如實(shí)心玻璃微球表面，涂一層很薄的多孔色譜材料，經(jīng)燒結(jié)而成。2、全多孔微粒型填料（microparticular）：目前廣泛使用的填料。可以制成無(wú)定型和球型。按結(jié)構(gòu)分：表面多孔型、全多孔微粒型。3、固定相的選擇原則固定相采用全多孔型微粒硅膠，其粒度為5－10m。主要考慮的因素：比表面積、平均孔徑、含水量等。是由固定液和載體組成，按涂漬方式可分機(jī)械涂層固定相和化學(xué)鍵合固定相兩種。目前廣泛使用的是化學(xué)鍵合固定相。（二）液－液分配色譜法固定相化學(xué)鍵合固定相利用化學(xué)反應(yīng)方法，通過(guò)化學(xué)鍵把各種不同類(lèi)型的有機(jī)基團(tuán)鍵合到載體（硅膠）表面上而得。1、酯化型（≡Si—O—C≡

）鍵合相：醇與硅膠表面的硅醇基直接酯化反應(yīng)，生成具有≡Si—O—C≡

鍵的固定相，適用于極性小的流動(dòng)相，分離極性化合物。

≡Si—OH＋HO－R

＝

≡Si—OR

＋H2O缺點(diǎn)：易水解、醇解、熱穩(wěn)定性差。主要有兩種類(lèi)型：2、硅烷化型（≡Si—O—Si—

C≡）鍵合相：氯硅烷與硅醇基進(jìn)行硅烷化反應(yīng)，生成具有≡Si—O—Si—

C≡鍵的固定相。特點(diǎn)：性質(zhì)穩(wěn)定、不易吸水、耐有機(jī)溶劑，能在70°C以下、pH2－8范圍內(nèi)正常工作。此種固定相為十八烷基鍵合相，簡(jiǎn)稱ODS或C18。優(yōu)點(diǎn)：（1）傳質(zhì)速度快，柱效高；（2）化學(xué)性能穩(wěn)定、熱穩(wěn)定性好，色譜柱穩(wěn)定性好，使用壽命長(zhǎng)；（3）可以鍵合不同性質(zhì)的官能團(tuán)，選擇性高。（4）可用多種溶劑作流動(dòng)相，利用梯度洗脫，分離效果好，分析效率佳；（5）70°C以下均可使用、進(jìn)樣量大。（三）離子交換色譜法固定相以離子交換劑為固定相。常用的離子交換劑有兩類(lèi)：以交聯(lián)聚苯乙烯為基體的離子交換劑、以硅膠為基體的鍵合相離子交換劑。目前后者已基本取代前者。常見(jiàn)的離子交換基團(tuán)有兩類(lèi)：（1）陽(yáng)離子交換基團(tuán)，如磺酸基（－SO3H）、羧酸基（－COOH）（2）陰離子交換基團(tuán)，如季銨基（－NR3Cl）、氨基（－NH2）特點(diǎn)：較高的耐壓性、熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性、粒度細(xì)、易填充均勻、表面?zhèn)髻|(zhì)快、柱效高、有室溫下可以獲得良好的分離、使用方便。（四）尺寸排阻色譜法固定相多孔性凝膠。一種表面惰性、含有不同尺寸孔穴和立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。試樣組分分子按流體力學(xué)體積大小不同進(jìn)行分離的液相色譜法。凝膠色譜法（gelchromatography）：凝膠作固定相。凝膠過(guò)濾色譜法（gelfiltrationchromatography;GFC）：水溶液為流動(dòng)相。凝膠滲透色譜法（gelpremeationchromatography;GPC）：有機(jī)溶劑作流動(dòng)相。（一）基本原理是利用固定相如凝膠孔徑與被分離組分分子空間尺寸（流體力學(xué)體積）大小的關(guān)系得到分離。硅膠型、聚苯乙烯型、葡聚糖凝膠型……空間排斥（阻）色譜SizeExclusionChromatographyM.W.tR空間排斥（阻）色譜SizeExclusionChromatographyM.W.tR空間排斥（阻）色譜SizeExclusionChromatographyM.W.tR空間排斥（阻）色譜SizeExclusionChromatographyM.W.tR空間排斥（阻）色譜SizeExclusionChromatographyM.W.tR（五）親和色譜法固定相由基體、間隔臂和配位體三部分組成。分離過(guò)程中當(dāng)含有親和物的樣品隨流動(dòng)相經(jīng)過(guò)固定相時(shí)，親和物就與配位體結(jié)合，達(dá)到與其它組分分離的目的。二、流動(dòng)相流動(dòng)相的作用：?攜帶樣品?給樣品提供一個(gè)在兩中進(jìn)行分配的場(chǎng)所。流動(dòng)相可分為：?jiǎn)我涣鲃?dòng)相和混合流動(dòng)相。分離度的好壞、分析速度的快慢，在很大程度上取決于流動(dòng)相的種類(lèi)和配比。因此，流動(dòng)相的選擇是分析成功與否的重要因素。（一）對(duì)流動(dòng)相的基本要求（1）與固定相不互溶，也不與固定相發(fā)生任何化學(xué)反應(yīng)。（2）對(duì)待測(cè)樣品要有足夠的溶解度，通常用k值衡量，要求k值在1－10之間。（3）純度高，使用前要經(jīng)過(guò)過(guò)濾、脫氣等處理。（4）粘度要小，有較低的沸點(diǎn)。（5）應(yīng)與所適用的檢測(cè)器相匹配。（6）價(jià)格便宜、毒性小、易于純化。（二）流動(dòng)相的選擇1、液固吸附色譜流動(dòng)相的選擇待測(cè)樣品的極性和洗脫劑的極性相一致。洗脫劑極性的強(qiáng)弱通常用溶劑強(qiáng)度參數(shù)來(lái)衡量，值越大，表示極性越強(qiáng)，洗脫能力越強(qiáng)。水>甲醇>乙醇>乙酸乙酯>乙醚>二氯甲烷>氯仿苯>甲苯＞二甲苯＞四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>石油醚＞正戊烷常用溶劑在氧化鋁吸附劑上極性強(qiáng)弱的比較：在進(jìn)行分離時(shí)，一般先選用中等極性溶劑作流動(dòng)相，若組分的保留時(shí)間太短，說(shuō)明流動(dòng)相極性太大，應(yīng)改用極性較弱的溶劑。若組分保留時(shí)間太長(zhǎng)，說(shuō)明流動(dòng)相極性太小，應(yīng)改用極性稍強(qiáng)的溶劑，也可采用兩種或兩種以上溶劑按不同比例進(jìn)行混合后作洗脫劑。2、液液分配色譜流動(dòng)相的選擇在液液分配色譜中，要求流動(dòng)相與固定相的極性有顯著不同，以防止固定液流失。正相分配色譜主要用于分離極性化合物，常選用低極性的溶劑如烷烴類(lèi)溶劑。待測(cè)組分流出順序與其極性大小有關(guān)，極性小的先流出色譜柱，極性大的后流出色譜柱。反相分配色譜主要用來(lái)分離非極性化合物，流動(dòng)相多選用水或無(wú)機(jī)鹽緩沖液。待測(cè)組分流出順序與正相分配色譜正好相反。3、離子交換色譜流動(dòng)相的選擇離子交換色譜的流動(dòng)相大都是具有一定pH值和離子強(qiáng)度的緩沖溶液。

通過(guò)改變?nèi)軇﹑H值、緩沖劑的類(lèi)型、離子強(qiáng)度和加入有機(jī)溶劑等來(lái)改變交換劑的選擇性，從而改善分離度。

4、尺寸排阻色譜流動(dòng)相的選擇流動(dòng)相能完全溶解樣品，必須與凝膠本身非常相似以便濕潤(rùn)凝膠，粘度要小，與檢測(cè)器相匹配。常用的流動(dòng)相有：四氫呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酰胺、水等。以水溶液為流動(dòng)相，適用于分離水溶性樣品。以有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，適用于分離非水溶性樣品。1、純化使用前必須經(jīng)過(guò)0.45m濾膜過(guò)濾，除去溶劑中的微小機(jī)械雜質(zhì)，防止堵塞輸液管道和進(jìn)樣閥。并用G4微孔玻璃漏斗除去3－4m以下的固態(tài)雜質(zhì)。2、脫氣如果氣體進(jìn)入泵體，妨礙柱塞及單向閥的正常工作，導(dǎo)致輸液不準(zhǔn)，脈流及壓力波動(dòng)，影響組分保留時(shí)間和峰面積的重現(xiàn)性。當(dāng)氣泡進(jìn)入檢測(cè)器，則引起光吸收和電信號(hào)的變化，造成基線波動(dòng)及漂移。（三）流動(dòng)相的處理與貯存脫氣的方法：抽真空脫氣法；加熱回流脫氣法；超聲波震蕩脫氣法。3、貯存貯存于玻璃、不銹鋼或氟塑料容器內(nèi)。容器必須密閉，不要長(zhǎng)期貯存，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。1、等度洗脫（isocraticelution）：自始至終溶劑配比保持恒定。2、梯度洗脫（gradselution）：按一定的程序不斷改變流動(dòng)相的配比。對(duì)復(fù)雜樣品，可以達(dá)到很好的分離，縮短分析周期，提高分析速度。要求所用溶劑互溶性好，純度高。每次梯度洗脫結(jié)束，必須對(duì)色譜柱進(jìn)行再生處理，使其恢復(fù)到初始狀態(tài)。（四）洗脫方式1、柱內(nèi)展寬柱內(nèi)展寬（insidecolumneffect）：當(dāng)溶質(zhì)在色譜柱內(nèi)移動(dòng)時(shí)，其譜帶隨時(shí)間而展寬。在高效液相色譜中，VanDeemter方程的分子擴(kuò)散項(xiàng)B/U較小，可以忽略不計(jì)，因此VanDeemter方程式應(yīng)為：在HPLC法中影響柱效的主要因素是傳質(zhì)阻力。H＝A＋Cu第四節(jié)影響分離的因素與分離類(lèi)型的選擇一、影響分離的因素GC與HPLC的H－u曲線比較從圖可以看出，隨著流動(dòng)相流速增高，板高H增大，柱效降低。柱外展寬－柱外效應(yīng)（extracolumneffect）：是降低柱效的一