pcr與hrm比較在小鼠基因型

高分辨率溶解曲線和pcr在小鼠基因鑒定中的的對(duì)比摘要

目前，在基因型鑒定方面大部分都是通過(guò)普通pcr，但是pcr需要通過(guò)跑膠、測(cè)序，耗費(fèi)了大量的時(shí)間與精力。本次試驗(yàn)對(duì)象是OB和DB型老鼠，OB和DB型老鼠基因序列重復(fù)結(jié)構(gòu)比較多，同時(shí)又是點(diǎn)突變，引物設(shè)計(jì)比較困難。在此基礎(chǔ)我們運(yùn)用了hrm技術(shù)，首先hrm技術(shù)在操作上簡(jiǎn)單易學(xué)，不需要特異性探針，成本比較低，而且hrm的根據(jù)樣品中DNA序列的長(zhǎng)度，GC含量以及堿基互補(bǔ)性的差異，其極高的溫度均一性使分辨精度達(dá)到對(duì)單個(gè)堿基差異的區(qū)分。綜述ob型小鼠是由于在堿基序列的第105位發(fā)生點(diǎn)突變由C→T,導(dǎo)致該位點(diǎn)上的氨基酸的改變由精氨酸CGA轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止密碼子TGA。這種突變使ob基因表達(dá)產(chǎn)物活性喪失,所以表現(xiàn)為肥胖。db小鼠是小鼠由于編碼瘦素Leptin受體的糖尿病基因胞內(nèi)區(qū)外顯子內(nèi)發(fā)生G→T點(diǎn)突變導(dǎo)致的先天肥胖性2型糖尿病型小鼠，其小鼠表現(xiàn)出多食、肥胖及血壓升高并且受體結(jié)合力也較低。

HRM

基本原理就是利用與DNA雙鏈與熒光染料相結(jié)合，在溫度逐漸升高的過(guò)程中DNA會(huì)發(fā)生減色效應(yīng)，通過(guò)檢測(cè)雙鏈DNA在熔解過(guò)程中所釋放的染料熒光信號(hào)所形成的特征熔解曲線，從而對(duì)基因序列中的核苷酸差異進(jìn)行鑒別。實(shí)驗(yàn)步驟一、db/ob小鼠DNA提取二、進(jìn)行基因型的鑒定1、普通pcr2、hrm技術(shù)

1、剪尾：剪1cm左右的尾巴，或者小鼠耳朵2、處理材料：1）動(dòng)物組織應(yīng)先打碎處理為細(xì)胞懸浮液，然后10,000rpm離心一分鐘，倒盡上清，加200ul緩沖液GA，振蕩至徹底懸浮。2）加入20ulproteinasek溶解，混勻。56℃放置，直至組織溶解，簡(jiǎn)短離心除管壁內(nèi)水珠，隔夜消化一天一、DNA提取3）、加入200ul緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃放置10min溶液應(yīng)變清亮，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁水珠。4）、加入200ul無(wú)水乙醇，充分振蕩混勻15sec，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。5)、將上步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)96孔吸附板CB3中，加蓋新的封口膜3,600rpm離心10min，倒掉深孔板中的廢液，將吸附板重新放在深孔板上。6）、像96孔吸附板CB3中加入500ul緩沖液GD加蓋新的封口膜3,600rpm離心10min，倒掉深孔板中的廢液，將吸附板重新放在深孔板上。7）、像96孔吸附板CB3中加入500ul緩沖液PW加蓋新的封口膜3,600rpm離心10min，倒掉深孔板中的廢液，將吸附板重新放在深孔板上。8)、像96孔吸附板CB3中加入600ul漂洗液PW加蓋新的封口膜3,600rpm離心10min，倒掉深孔板中的廢液，將吸附板重新放在深孔板上。9）、3600rpm離心10min，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。10）、將96孔吸附板CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)新的96孔深孔板中，像吸附膜的中間部位懸空滴加80ul洗脫液TB，室溫放置5-10min，加蓋新的封口膜3,600rpm離心10min收集DNA。常規(guī)pcr體系二、鑒定常規(guī)pcr程序溫度（℃）時(shí)間（min）循環(huán)數(shù)（cycles）9595657295557272105min30S30S30S30S30S30S5min-----1120202020201HRM體系hrm程序溫度（℃）時(shí)間循環(huán)數(shù)（cycles）95956572954065975min10s15s20s60s60s1s1果分析DB型小鼠紅色表示mut/mut純合子，橙色表示wt/wt表示野生，藍(lán)色表示mut/wt表示雜合OB型小鼠注：

紅色表示mut/mut純合子，橙色表示wt/wt表示野生，藍(lán)色表示mut/wt表示雜合子結(jié)論從實(shí)驗(yàn)的兩組小鼠中可以看出，普通pcr程序后，跑膠后的圖模糊不清，并且其特異性也比較差，這是由于于OB&DB小鼠都屬于點(diǎn)突變，并且OB&DB堿基序列中重復(fù)度比較