【課件】動物細胞融合技術與單克隆抗體課件-高二下學期生物人教版（2019）選擇性必修3

2.2.2動物細胞融合與單克隆抗體“生物導彈”追蹤癌細胞抗體植物體細胞雜交植物細胞融合植物組織培養(yǎng)溫故而知新：有沒有技術讓不同種動物的體細胞雜交，培育出集不同細胞優(yōu)勢于一身的動物細胞呢？實例1：自然條件受精作用1970年人工條件下的人-鼠細胞融合實驗實例2：人工誘導一、動物細胞融合技術一、動物細胞融合技術1、概念：指兩個或多個動物細胞結合形成一個細胞的技術。3、結果：形成雜交細胞。即融合后形成的原來兩個或多個細胞遺傳信息的單核細胞。2、原理：細胞膜具有一定的流動性4、誘導方式物理法：電融合法化學法：聚乙二醇（PEG)生物法：滅活的病毒細胞融合成功的標志：細胞核的融合仙臺病毒紫外線滅活喪失感染活性（不感染細胞）保留融合活性（誘導細胞融合）（1）“滅活病毒”中滅活的具體含義是什么？滅活是指用物理或化學手段使病毒失去感染能力，但是并不破壞病毒的抗原結構。病毒表面的糖蛋白和一些酶與細胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細胞互相凝聚，細胞膜上的蛋白質分子和脂質分子重新排布，細胞膜打開，細胞發(fā)生融合。（2）滅活病毒誘導細胞融合的原理是什么？正在融合的淋巴細胞與骨髓瘤細胞

正在融合的雞血細胞5.實例：6.意義：突破了有性雜交的局限，使遠緣雜交成為可能

7.應用：（1）細胞融合技術已經成為研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和培育生物新品種等的重要手段。（2）利用動物細胞融合技術發(fā)展起來的雜交瘤技術，為制造單克隆抗體開辟了新途徑。處理方法誘導手段結果原理請同學們看圖對比動物和植物細胞融合的異同：植物體細胞雜交動物細胞融合原理細胞融合前的處理方法誘導細胞融合的方法細胞融合成功的標志主要用途意義細胞膜具有一定的流動性、植物細胞的全能性細胞膜具有一定的流動性用果膠酶和纖維素酶去除細胞壁用胰蛋白酶或膠原蛋白酶使細胞分散成單個細胞電融合法、離心法；PEG融合法、高Ca2+-高pH融合法PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導法再生出細胞壁細胞核的融合獲得完整的雜種植株主要用于制造單克隆抗體打破生殖隔離，實現(xiàn)遠緣雜交育種，培育植物新品種突破了有性雜交的局限，使遠緣雜交成為可能動物細胞融合和植物體細胞雜交的比較抗體概念：特性：分布：漿細胞產生的專門應對抗原的蛋白質特異性即一種抗體只能與一種抗原結合主要分布于血清中，也分布于組織液及外分泌液（乳汁）中。注意:抗體的化學本質一定是蛋白質！二、單克隆抗體的制備1.傳統(tǒng)抗體制備方法及缺陷向動物體內反復注射某種抗原從動物血清中分離所需抗體產量低、純度低、特異性差（2）缺點：（1）方法：如何解決這個問題呢？2.單克隆抗體制備思路：每一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體選

擇B淋巴細胞不可能無限增殖一個B淋巴細胞B淋巴細胞群

單克隆抗體產生克隆化培養(yǎng)單克隆抗體癌細胞動物細胞融合思考１：我們所學的哪種細胞是可以無限增殖的思考２：有什么方法能使B細胞產生抗體的能力和無限增殖能力同時具備思考：一個極富創(chuàng)造力的方案：動物細胞融合雜交細胞動物細胞培養(yǎng)單克隆抗體雜交瘤細胞既能迅速大量增殖，又能產生專一抗體骨髓瘤細胞（癌細胞）能無限增殖一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體1975年，米爾斯坦和科勒1984年，諾貝爾生理學或醫(yī)學獎用特定抗原注射小鼠從患骨髓瘤的小鼠體內取骨髓瘤細胞的培養(yǎng)多種B淋巴細胞骨髓瘤細胞誘導融合多種雜交細胞3.單克隆抗體制備的過程：PEG融合法電融合法滅活病毒誘導法能產生抗體能大量增殖脾臟中獲取2雜交瘤細胞13第一次篩選多種雜交瘤細胞多種雜交細胞骨髓瘤細胞自身融合B細胞自身融合雜交細胞132未融合的B淋巴細胞未融合的骨髓瘤細胞B-骨、骨-骨、B-B、用特定的選擇培養(yǎng)基（既能迅速大量增殖，又能產生抗體）克隆化培養(yǎng)抗體檢測第二次篩選：(抗原-抗體雜交技術)多種雜交瘤細胞陽性細胞檢測原理：抗原和抗體能夠特異性結合(分子水平的鑒定）分泌所需抗體的雜交瘤細胞陽性孔第二次篩選：抗體檢測的方法——抗原-抗體雜交法在單克隆抗體制備過程中，兩次篩選的目的和方法是不相同的。將雜交瘤細胞群稀釋，約每孔1個細胞進行培養(yǎng)（克隆化培養(yǎng)）一段時間后，檢測各孔上清液中細胞分泌的抗體上清液可與特定抗原結合的培養(yǎng)孔為陽性孔多孔細胞培養(yǎng)板分泌抗體能跟特定抗原結合的細胞即為所需雜交瘤細胞多次篩選第一次篩選第二次篩選原因方法目的誘導融合后得到的細胞中，除雜交瘤細胞之外，還有未融合的親本細胞，也有融合的具有同種核的細胞由于小鼠在生活中還受到其他抗原的刺激，所以經第一次篩選之后獲得的雜交瘤細胞中有能產生其他抗體的細胞用特定的選擇培養(yǎng)基進行篩選用96孔板培養(yǎng)，在每一個孔中盡量只接種一個雜交瘤細胞的情況下，進行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測（進行多次篩選）篩選獲得雜交瘤細胞獲得足夠數量的能分泌所需抗體的雜交瘤細胞兩次篩選的比較注射到小鼠體內體外培養(yǎng)分離、提純單克隆抗體體內或體外培養(yǎng)能分泌所需抗體的雜交瘤細胞從細胞培養(yǎng)液中提取從小鼠腹水中提取不需要配制培養(yǎng)液，不需要控制培養(yǎng)液無菌、無毒、溫度、PH、滲透壓、氣體環(huán)境等條件。雜交瘤細胞體內培養(yǎng)的優(yōu)點：

補充資料：第一次篩選獲得雜交瘤細胞①細胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基喋呤阻斷。②人淋巴細胞中有這兩種DNA的合成途徑，但不能分裂增殖。

③鼠骨髓瘤細胞中只有D途徑，沒有S途徑，但能不斷分裂增殖。篩選出雜交瘤細胞方法？培養(yǎng)基中加入氨基喋呤B淋巴細胞及同型融合細胞不能無限增殖，死亡骨髓瘤細胞及同型融合細胞不能無限增殖，死亡雜交瘤細胞能無限增殖，生長AB1、AB2、AB3……專一抗體檢驗陽性：有限稀釋法、抗原-抗體雜交法單克隆抗體的制備過程——第二次篩選【原理】將雜交瘤細胞培養(yǎng)液稀釋后滴入多孔板，如果稀釋度足夠高，多孔板的一個孔里就可能只有1個雜交瘤細胞，培養(yǎng)之后(即克隆化培養(yǎng))，用標記的抗原檢測每個小孔上清液里是否含有我們需要的特異性的抗體（抗原抗體能結合即為陽性孔）。這樣經過多次克隆化培養(yǎng)以及有限稀釋法的篩選，就能選出需要的那種雜交瘤細胞（AB3）。多孔細胞培養(yǎng)板抗體檢測板陽性孔單克隆抗體及其應用二

【課堂小結】單克隆抗體篩選二雜交細胞雜交瘤細胞體外或體內培養(yǎng)篩選一骨髓瘤細胞

誘導融合分泌特異抗體的雜交瘤細胞雜交瘤細胞群提取已免疫的B淋巴細胞動物細胞融合動物細胞培養(yǎng)單克隆抗體的制備既能大量繁殖又能產生專一抗體特異性強靈敏度高可大量制備注射抗原用特定的選擇性培養(yǎng)基克隆化培養(yǎng)、抗體檢測應用到的技術：原理：

細胞膜具有一定的流動性、細胞增殖動物細胞融合、動物細胞培養(yǎng)1.(1)若A細胞是小鼠骨髓瘤細胞，則B細胞是取自小鼠體內的

細胞，從小鼠體內提取分離該細胞之前，應給小鼠注射____________類物質。（2）d過程是一個

的過程，該過程的進行常用_____________或_____________誘導。(3)假設僅考慮某兩個細胞的融合，則可形成

種類型的C細胞，因此需用__________培養(yǎng)基篩選出D細胞用于培養(yǎng)，D細胞的名稱是

，其特點是_________________________________________。B淋巴

抗原

動物細胞融合

聚乙二醇滅活病毒

選擇性3既能無限增殖又能產生特異性抗體

雜交瘤細胞(4)在培養(yǎng)時通過________分裂方式大量繁殖。D細胞體外培養(yǎng)需要注意的條件是（要求答4項）

（5）單克隆抗體在疾病的診斷、治療和預防方面，與常規(guī)抗體相比，其特點是

。特異性強、靈敏度高，可大量制備有絲無菌、無毒的環(huán)境；充足的營養(yǎng)；適宜的溫度和pH；適宜的氣體環(huán)境

小試牛刀單克隆抗體能準確地識別抗原的細微差異，與特定抗原發(fā)生特異性結合，并且可以大量制備。三、單克隆抗體的應用1.單克隆抗體的優(yōu)點：資料1用抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體做成的“早早孕診斷試劑盒”。在妊娠第8天就可以作出診斷，這比原來的診斷方法提前了10d左右，可以避免孕婦在不知道妊娠的情況下因服用藥物而對胎兒造成不利影響。該方法檢測的準確率在90%以上。具有準確、高效、簡易、快速特點。診斷優(yōu)點：（1）廣泛用作診斷試劑資料2使用高效的細胞毒素類藥物進行化療可以有效殺傷腫瘤細胞。但細胞毒素沒有特異性，在殺傷腫瘤細胞的同時還會對健康細胞造成傷害，這限制了它在臨床上的應用。抗體-藥物偶聯(lián)物（antibody-drugconjugates,ADC）通過將細胞毒素與能特異性識別腫瘤抗原的單克隆抗體結合，實現(xiàn)了對腫瘤細胞的選擇性殺傷。ADC通常由抗體、接頭和藥物(如細胞毒素)三部分組成，它的作用機制如下圖所示。(2)用于治療疾病和運載藥物抗體藥物接頭ADC被細胞吞噬釋放藥物溶酶體裂解細胞凋亡1.ADC的抗體和藥物各具有什么作用？討論抗體主要發(fā)揮靶向運輸作用，即通過特異性結合靶細胞表面的抗原，將連接的藥物輸送到靶細胞；藥物發(fā)揮治療效應，如殺傷靶細胞2.除了細胞毒素，還有哪些物質理論上可以作為ADC偶聯(lián)的藥物？3.單克隆抗體診斷試劑盒和ADC在臨床應用上各具有什么優(yōu)勢？①可以用放射性同位素標記單克隆抗體進行靶向放療；②一些作用于細胞信號轉導通路的藥物（PD-1抗體或PD-L1抗體）可以通過阻斷腫瘤細胞的信號通路來抑制其生長，理論上也可以將這些藥物與單克隆抗體結合進行治療①單克隆抗體診斷試劑盒中的單克隆抗體只與特定的抗原反應，因此檢測的特異性和靈敏度大大提高；生產單克隆抗體的雜交瘤細胞可以傳代培養(yǎng)、冷凍保存和復蘇利用，有利于控制產品的質量和標準化生產診斷試劑盒；②ADC能夠協(xié)同發(fā)揮抗體特異性識別的靶向作用和細胞毒素對腫瘤細胞的殺傷作用，因此它在臨床上具有靶點清楚、毒副作用小等優(yōu)點主要用于癌癥治療，如：單克隆抗體+藥物=“生物導彈”優(yōu)點：位置準確、療效高、副作用小結合同位素的單抗(“生物導彈”—單抗導向，藥物為彈頭)(2)用于治療疾病和運載藥物課堂小結兩個過程動物細胞融合過程單克隆抗體制備過程三個“一”一個誘導細胞融合的新方法

－－滅活病毒一個新細胞－－雜交瘤細胞一個優(yōu)勢－－單克隆抗體特異性強、靈敏度高、可大量制備的優(yōu)勢

4.單克隆抗體在臨床上還有哪些應用？你可以課后搜集資料，然后以“單克隆抗體在臨床上的應