人教-選修1-固定化酵母細(xì)胞及蔗糖酶的檢測1

固定化酵母細(xì)胞及蔗糖酶的檢測實驗?zāi)康牧私饷概c細(xì)胞固定化方法并掌握一種酵母細(xì)胞固定化技術(shù)。了解蔗糖酶活力的測定原理及還原糖的定性檢測法。實驗原理固定化酶和固定化細(xì)胞是利用物理及化學(xué)的處理方法，將水溶性酶或細(xì)胞與固體的水不溶性支持物（或稱載體）相結(jié)合，使其既不溶于水，又能保持酶和微生物的活性。它們在固相狀態(tài)下增加了機械強度，穩(wěn)定性提高，可回收反復(fù)使用，并在貯存較長時間后依然保持酶和微生物的活性不變。常用的固定化方法有：（1）物理吸附法；（2）交聯(lián)法；（3）包埋法。相對于固定化酶，微生物細(xì)胞固定化技術(shù)的優(yōu)點是可避免復(fù)雜的酶提取和純化過程，也降低了成本，同時也解決了酶的不穩(wěn)定性問題，操作穩(wěn)定性也較好。微生物細(xì)胞固定化常用的載體有：①多糖類（纖維素、瓊脂、葡萄糖凝膠、海藻酸鈣、K-角叉膠、DEAE-纖維素等）；②蛋白質(zhì)（骨膠原、明膠等）；③無機載體（氧化鋁、活性炭、陶瓷、磁鐵、二氧化硅等）。蔗糖酶活力的檢測原理是利用了蔗糖酶可以催化蔗糖水解生成果糖和葡萄糖，而單糖含有游離羰基，具有弱還原性。某些弱氧化劑（如硫酸銅的堿性溶液，即斐林試劑）與單糖在煮沸的條件下，會有溶液的顯色變化過程：淺藍色→棕色→磚紅色（氧化亞沉淀，）而蔗糖不能與斐林試劑發(fā)生顏色反應(yīng)。且葡萄糖溶液濃度越高，顏色越深。儀器和試劑儀器：試管、2mL吸管2支、水浴鍋、漏斗試劑：海藻酸鈉若干克；卡氏酵母液；4%CaCl2；10%蔗糖液100mL；斐林試劑甲、乙液。實驗步驟

1．酵母細(xì)胞固定化：稱取海藻酸鈉1克加入100ml水中，微火加熱溶解后冷卻到30℃左右，將預(yù)先準(zhǔn)備好的卡氏酵母液10~15mL（若濃度低，可提高加入量）加入混勻。然后倒入下邊裝有膠管與止血夾的漏斗中，讓其慢慢滴入4%的150~200ml氯化鈣溶液中，制成直徑2~3mm的球形固定化酵母。剛形成的凝膠珠應(yīng)在CaCl2溶液中浸泡一段時間，以便形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。

檢驗?zāi)z珠的質(zhì)量是否合格，可以使用下列方法。一是用鑷子夾起一個凝膠珠放在實驗桌上用手?jǐn)D壓，如果凝膠珠不容易破裂，沒有液體流出，就表明凝膠珠的制作成功。二是在實驗桌上用力摔打凝膠珠，如果凝膠珠很容易彈起，也能表明制備的凝膠珠是成功的。將固定化酵母細(xì)胞裝入玻璃柱中（柱下端口塞上棉花），從柱上端加入10~20ml10%的蔗糖液，靜止反應(yīng)10min?？刂埔欢ǖ牧魉偈顾馓且旱稳霟?。2．蔗糖酶的檢測：吸取上述水解液2mL于干凈試管中，加入斐林試劑2mL，浸入沸水浴中約1~2min，觀察顏色變化。有氧化亞銅沉淀的說明蔗糖已被水解，管中有蔗糖酶的存在。以10%蔗糖液作空白對照。注意事項

1．酵母細(xì)胞的活化：在缺水的狀態(tài)下，微生物會處于休眠狀態(tài)。酵母細(xì)胞所需要的活化時間較短，一般需要0.5～1h，需提前做好準(zhǔn)備。此外，酵母細(xì)胞活化時體積會變大，因此活化前應(yīng)該選擇體積足夠大的容器，以避免酵母細(xì)胞的活化液溢出容器外。2．加熱使海藻酸鈉溶化是操作中最重要的一環(huán)，涉及到實驗的成敗，海藻酸鈉的濃度涉及到固定化細(xì)胞的質(zhì)量。如果海藻酸鈉濃度過高，將很難形成凝膠珠；如果濃度過低，形成的凝膠珠所包埋的酵母細(xì)胞的數(shù)目少，影響實驗效果。可以通過觀察凝膠珠的顏色和形狀來判斷：如果制作的凝膠珠顏色過淺、呈白色，說明海藻酸鈉的濃度偏低，固定的酵母細(xì)胞數(shù)目較少；如果形成的凝膠珠不是圓形或橢圓形，則說明海藻酸鈉的濃度偏高，