生物化學(xué)第二章

第二章核酸

（Chemistryofnucleicacid）1868年，瑞士科學(xué)家F.Miescher

從外科繃帶上膿細(xì)胞中分離出了一種富含磷的有機(jī)物質(zhì)，稱為“核素”(nuclein)。他的論文發(fā)表在Med.Chem.Unters1872年，他從萊茵河鮭魚(yú)中得到類似物,同時(shí)還分離到一種堿性化合物，稱為魚(yú)精蛋白（protamine）核酸的發(fā)現(xiàn)1889年，Altman等人又從酵母和動(dòng)物的細(xì)胞核中得到了不含蛋白質(zhì)的核酸，并首次使用“核酸”（NucleicAcid）命名。1944年，Avery等人通過(guò)細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證明核酸就是遺傳物質(zhì)。核酸的發(fā)現(xiàn)噬菌體轉(zhuǎn)化試驗(yàn)核酸的發(fā)現(xiàn)

1944年由Avery等完成的，它證明了生物遺傳特性發(fā)生改變的轉(zhuǎn)化因子是DNA，而不是蛋白質(zhì)。

(核酸)NucleicAcidPolynucleotidechain(核苷酸鏈)Nucleotide(Nt)basicunit(核苷酸)Mono-phosphate(磷酸)Nucleoside(核苷)Deoxy-ribose(Ribose)Base(堿基)Purin(嘧啶)Pyrimidine(嘌呤)Adenine(A)Thymine(T)Guanine(G)

Uracil

(U)

Cytosine(C)

DNA分子的片段

第一節(jié)概述1.1核酸的種類核酸（NucleicAcid）脫氧核糖核酸（DNA）核糖核酸（RNA）信使RNA(mRNA)轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)核糖體RNA(rRNA)小分子細(xì)胞核RNA（snRNA）、染色質(zhì)RNA(chRNA)種類分布功能DNA原核生物：核質(zhì)區(qū)真核生物：95%在細(xì)胞核、

5%在線粒體和葉綠體遺傳信息的載體RNAtRNA原核生物：細(xì)胞質(zhì)真核生物：75%在細(xì)胞質(zhì)

15%在線粒體和葉綠體

10%在細(xì)胞核攜帶、轉(zhuǎn)移aamRNA肽鏈合成的模板rRNA核糖體主要成分1.2核酸的分布1.3核酸的功能DNA是遺傳物質(zhì)，是遺傳信息的載體。1、DNA分布在染色體內(nèi)，是染色體的主要成分，而染色體是直接與遺傳有關(guān)的。2、體細(xì)胞DNA含量為生殖細(xì)胞DNA含量的兩倍，且含量十分穩(wěn)定。3、DNA在代謝上較穩(wěn)定不受營(yíng)養(yǎng)條件、年齡等因素的影響。4、作用于DNA的理化因素可引起遺傳特性的改變。由Avery在1953年用細(xì)菌轉(zhuǎn)化試驗(yàn)證明。（二）RNA的生物學(xué)功能RNA參與蛋白質(zhì)的生物合成。1、控制蛋白質(zhì)的合成；2、作用于RNA轉(zhuǎn)錄后加工與修飾；3、基因表達(dá)與細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)；4、生物催化與其他細(xì)胞持家功能；5、遺傳信息的加工與進(jìn)化。第二節(jié)核酸的化學(xué)組成核酸是一種線形多聚核苷酸(polynucleotide),其基本結(jié)構(gòu)單位是核苷酸(nucleotide)。戊糖堿基磷酸核苷核苷酸核酸

核苷酸

的基

本結(jié)構(gòu)一堿基嘌呤堿和嘧啶堿嘌呤堿(purine)：由嘌呤衍生而來(lái)Adenine(A)Guanine(G)嘧啶堿(pyrimidine)：是嘧啶的衍生物尿嘧啶(uracil,U)胸腺嘧啶(thymine,T)胞嘧啶(cytosine,C)在生理pH下，在生物體內(nèi)，堿基多以亞氨基、酮基礎(chǔ)形式存在。二核酸中的戊糖D-核糖（D-ribose）D-脫氧核糖（D-deoxyribose）核酸據(jù)此分類：脫氧核糖－DNA；

核糖－RNA；核酸中的戊糖均為

β-D-型它們均以呋喃糖態(tài)存在

RNA中

DNA中

三磷酸磷酸根，帶負(fù)電荷，可與多種陽(yáng)離子、組蛋白等結(jié)合結(jié)合。其參與形成磷酸二酯鍵。四核苷（nucleoside）

戊糖第1位碳原子上的羥基與嘌呤的第9位氮原子或與嘧啶的第1位氮原子形成的N-C糖苷鍵。腺苷脫氧鳥(niǎo)苷核苷的表示：

核苷：

A、G、C、U

脫氧核苷：dA,dG,dC,dT

修飾核苷：

如5-甲基胞嘧啶，m5dC。五核苷酸核苷與磷酸生成的核苷磷酸酯－核苷酸（nucleiotide）種類：1）按酯化位點(diǎn)：可在核糖的2’-,3’-,5’-；2）按核糖類型：

核苷酸、脫氧核苷酸與一個(gè)磷酸結(jié)合－MP：(d)AMP、(d)GMP、(d)CMP、(d)TMP、UMP與二個(gè)磷酸結(jié)合－DP：如：ADP與三個(gè)磷酸結(jié)合－TP：

如：ATP

六特殊核苷酸環(huán)核苷酸：

核糖3’-,5’-成環(huán)。

cAMP、

cGMP

功能：第二信使，激素、一些藥物、神經(jīng)遞質(zhì)通過(guò)其發(fā)揮生理作用。ATP是生物體內(nèi)分布最廣和最重要的一種核苷酸衍生物。它的結(jié)構(gòu)如下：ATP腺嘌呤核糖核苷三磷酸堿基5-甲基-2,4-二氧嘧啶Thy胸腺嘧啶2,4-二氧嘧啶Ura尿嘧啶2-氨基-6-氧嘌呤

Gue鳥(niǎo)嘌呤2-氧-4-氨基嘧啶Cyt胞嘧啶嘧啶6-氨基嘌呤Ade腺嘌呤嘌呤124NN3561357NNNNCH24689HNNNNCHNH2HNNNNCHOHH2NNNNH2OHNNOONNOOCH3第三節(jié)核酸的分子結(jié)構(gòu)

DNA分子中各種脫氧核苷酸之間的連接方式和排列順序。四種脫氧核苷酸通過(guò)3’,5’-磷酸二酯鍵連接起來(lái)的多核苷酸鏈的排列順序。1.定義一DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)DNA單鏈的延伸5’3’端

無(wú)分枝的長(zhǎng)鏈2.多聚脫氧核苷酸鏈的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)由糖-磷酸相互間隔連接，構(gòu)成主鏈；堿基連接在主鏈的核糖上，形成側(cè)鏈。具有方向性。兩個(gè)末端分別為5'端和3'端。

在天然DNA中，5'端常為磷酸，3'端為游離羥基。3、一級(jí)結(jié)構(gòu)的表示方法1）線條法5'pGpCpTpTpAOH3'5'pGCTTAOH3'pGCTTAOHGCTTA2）文字式

DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)是指DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)。雙螺旋結(jié)構(gòu)是DNA的兩條鏈圍著同一中心軸旋繞而成的一種空間結(jié)構(gòu)。DNA的雙螺旋模型是由Watson和Crick兩位科學(xué)家于1953年提出的。1.二級(jí)結(jié)構(gòu)的概念二DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)1953年Watsosn&Crick

RighthandedB-formDNADoublehelixModel

2.雙螺旋結(jié)構(gòu)模型提出的依據(jù)A.DNA的X-射線衍射圖：(1)衍射斑點(diǎn)呈交叉狀分布(2)衍射點(diǎn)之間的距離與層次表明有0.34nm和3.4nm的周期性(3)圖的頂上和底部是最強(qiáng)的衍射斑點(diǎn)，呈帶狀M.H.F.Wilkins&RosalindFrankin

X~rayphotographofDNAwithhighquality

1952年B.DNA的堿基組成分析：（Chargaff定則）(1)所有DNA分子中A=T，G=C(2)同一種生物的所有體細(xì)胞DNA的堿基組成相同，與年齡、健康狀況、外界環(huán)境無(wú)關(guān)，可作為該物種的特征，用不對(duì)稱比率(A+T)/(G+C)

來(lái)衡量。(3)親緣越近的生物，其DNA的堿基組成越近，即不對(duì)稱比率越相近。C、DNA的堿基物化數(shù)據(jù)如堿基的幾何大小、鍵長(zhǎng)鍵角數(shù)據(jù)、酸堿滴定等。3.雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的基本特征(1)反向平行的雙鏈沿中心軸盤(pán)繞成右手螺旋。DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)(2)雙螺旋表面形成兩種凹槽：較淺的叫小溝，另一條叫大溝。l

堿基頂部基團(tuán)裸露在DNA

大溝內(nèi)

l

蛋白質(zhì)因子與DNA的特異結(jié)合依賴于

氨基酸與DNA間的氫鍵的形成l

蛋白質(zhì)因子沿大溝與DNA形成專一性

結(jié)合的機(jī)率與多樣性高于沿小溝的結(jié)合l

大溝的空間更有利于與蛋白質(zhì)的結(jié)合

(3)由糖-磷酸相互間隔連接構(gòu)成的主鏈處于螺旋外側(cè)；堿基則伸向螺旋內(nèi)部，與中軸垂直。RighthandedB-formDNADoublehelixModel

(4)雙螺旋內(nèi)部的堿基按規(guī)則配對(duì)：A與T配對(duì)，形成2個(gè)氫鍵；G與C配對(duì)，形成3個(gè)氫鍵，稱為堿基互補(bǔ)配對(duì)，雙螺旋的兩條鏈也呈互補(bǔ)關(guān)系。A

=

TGC(5)雙螺旋直徑為2nm，每對(duì)脫氧核苷酸殘基沿縱軸旋轉(zhuǎn)36°，上升0.34nm。所以每10個(gè)堿基對(duì)形成一個(gè)螺旋，螺距3.4nm。4.影響雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的因素

互補(bǔ)堿基之間的氫鍵(Hydrogenbond)

弱鍵,可加熱解鏈氫鍵堆積,有序排列(線性,方向)

堿基堆集力(Basestackingforces)：堿基堆集成非極性的區(qū)域，相互間產(chǎn)生疏水作用和范德華力

☆疏水作用力(Hydrophobicinteraction)

☆

Vandewaalsforce

(1.7A°/嘌呤環(huán)與嘧啶環(huán)作用半徑)3.4A°4.影響雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的因素

離子鍵

磷酸酯鍵

(phosphoesterbond)強(qiáng)鍵,需酶促解鏈消除DNA單鏈上磷酸基團(tuán)間的靜電斥力

l

0.2mol/LNa+

生理鹽條件

4.影響雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的因素

在生理狀態(tài)及在溶液中，DNA一般為B型(含水量90％以上，NaCl濃度為2.5M）。

當(dāng)水合的DNA脫水時(shí)，轉(zhuǎn)變?yōu)锳型(含水量75％)。還有Z型的DNA(左手螺旋，0.7MMgCl2)。5.DNA雙螺旋構(gòu)象的多態(tài)性DNA的分子構(gòu)型(B,Z,A)比較

Z-DNAZ-DNAA-DNAB-DNA0.2MNaclZ-DNA趨于穩(wěn)定

rabbit

AntibodyofZ-DNA

B-DNA

Z-DNA

Z-DNA

4MNacl

Br+

Z-DNA的檢測(cè)羊抗兔二級(jí)抗體

goatAntibodyofZ-DNA

偶聯(lián)熒光標(biāo)記

免疫反應(yīng)

果蠅唾液腺染色體

細(xì)胞學(xué)制片

Z-DNAinDrosophilachromosomeprovedbyanti-Zantibody

ImmunoligicaslidCytologicalslid可能的功能

基因表達(dá)調(diào)控

Z-DNA

(小溝,信息少)

基因關(guān)閉

B-DNA

(大溝,信息多)

基因表達(dá)

●二級(jí)結(jié)構(gòu)的形態(tài)LinearDNA.LOpenCircleDNAOCSupercoiledcircleCovalentClosedCircleCCCD.S.L1.00D.S.OC1.14S.S.L1.30D.S.CCC1.41Collapsed3.00SvedbergUnit(S)polymerOCLCCC核酸分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)(分別出現(xiàn)在DNA復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，重組等階段)核酸分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)分別出現(xiàn)在DNA復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，重組等階段(knot)6.三股螺旋DNA

(TribleHelixDNA,T.SDNA)

※T.SDNA的發(fā)現(xiàn)與證實(shí)

l

1953年以前Pauling(Chemist)

提出T.SDNA存在的可能性

l

1953年Watson&CrickD.SDNAmodel

證明沿大溝存在多余的氫鍵給體與受體潛在的專一與DNA(蛋白質(zhì))

結(jié)合的能力形成T.SDNA可能性

l

1957年Davis,Felsenfeld,Rich發(fā)現(xiàn)

poly(U)+poly(U)+poly(A)T.SRNA

T.SDNA的概念l

1966年Miller&Sobell

實(shí)現(xiàn)RNA+D.SDNATrible

polyNt

asRepressor

關(guān)閉基因

但由于D.SDNA的提出而被忽視但因證明LacI

產(chǎn)物為Repressor而被忽視

●

1975年P(guān)erlgut

人工合成T.SDNA并證明其

Tm值,沉降系數(shù)(S)

l

1987年Mirkin.S.M

Nature330(495)

證明plasmidDNA在pH=4.3的溶液中,有T.SDNA的存在

●1987年Dervan.MoserScience238(645)

合成S.SDNA+D.SDNA→T.SDNA

實(shí)現(xiàn)DNA的定點(diǎn)切割研究X-rayphotograph

核磁共振→結(jié)構(gòu)功能

繼Davis（1957）后30年第一次證明T.SDNA在生物體內(nèi)的存在

PolyT/ATTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAPolyT/ATTTTTTTTTTTAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTAAAAAAAAAA●D.S.DNA+D.S.DNAT.S.DNA+S.S.DNA6.三鏈DNA(T.S.DNA)

●

HomologouspalindromicsequenceinaD.S.DNA-------TTCCCTCTTTCCC------CCCTTTCTCCCTT-------------AAGGGAGAAAGGG---GGGAAAGAGGGAA----

Mirkin(1987)pGG332plasmidDNA

--------TTCCCTCTTTCCC--------

--------AAGGGAGAAAGGG--------

-------TTCCCTCTTTCCC---------

--------AAGGGAGAAAGGG-------

NoduleDNA

HingedDNA

freeDNA

l

S.S.DNA+D.S.DNAT.S.DNA☆

PU+PU/PY(偏堿性介質(zhì)中穩(wěn)定)☆

PY

+PU/PY(偏酸性介質(zhì)中穩(wěn)定)常見(jiàn)類型

第三條鏈位于B-DNA的

Majorgroove中與D.S.DNA一起旋轉(zhuǎn)T.S.DNA可能的功能

a)T.S.DNA可阻止調(diào)節(jié)蛋白與DNA結(jié)合,關(guān)閉基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程

b)T.S.DNA與基因重組,交換有關(guān)

加入第三條S.S.DNA作為分子剪刀(molecularscissors),

定點(diǎn)切割DNA分子

d)加入反義的第三條鏈(anti-sence

polydNt)終止基因的表達(dá)

e)相反的觀點(diǎn)----T.S.DNA與基因表達(dá)呈正相關(guān)!?

四股螺旋DNA

(tetraplexDNA,TetrableHelixDNA)

發(fā)現(xiàn)

1958.Poly(I)

X-rayphotograph

堿基形成環(huán)狀氫鍵連接結(jié)構(gòu)TetrableHelixDNA均有形成四股螺旋DNA的可能

5’---TTAGGGTTAGGGTTAGGG-3’3’---AATCCCAATCCC-5’

Poly(G),4(dG)

染色體端粒高度重復(fù)的DNA序列(TG)著絲點(diǎn)附近的高度重復(fù)序列

結(jié)構(gòu)特點(diǎn)LinkedbyHoogsteenBondingGGGG2×d(T4G4)2×d(G4C4)

結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可能的功能

A穩(wěn)定真核生物染色體結(jié)構(gòu)

B保證DNA末端準(zhǔn)確復(fù)制

C與DNA分子的組裝有關(guān)

D與染色體的meiosis(減數(shù)分裂)&mitosis(有絲分裂)有關(guān)

HoogsteenBonding

5-----TTAGGGTTAGGGTTAGGGT

3-----AATCCCAATCCC

GGG

TA超螺旋:雙螺旋進(jìn)一步扭曲形成的更高層次的空間結(jié)構(gòu)，包括DNA扭曲、超螺旋、多重螺旋和連環(huán)等。1.DNA超螺旋的概述

DNA正常的雙螺旋結(jié)構(gòu)處于能量最低狀態(tài)，雙螺旋中沒(méi)有張力而處于松弛狀態(tài)。如果這種正常雙螺旋額外增加或減少螺旋圈數(shù)，就會(huì)使雙螺旋內(nèi)的原子偏離正常的位置而產(chǎn)生張力，這樣正常的雙螺旋就發(fā)生扭曲而形成超螺旋。超螺旋總是向著抵消初級(jí)螺旋改變的方向發(fā)展。三DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)2.DNA超螺旋的特點(diǎn)1）線狀DNA分子

雙螺旋與蛋白質(zhì)結(jié)合后扭曲盤(pán)繞而形成螺旋的螺旋結(jié)構(gòu)。positivesupercoiled

2）環(huán)狀DNA分子雙螺旋扭曲而形成麻花狀的超螺旋結(jié)構(gòu)3、DNA超螺旋的生物學(xué)意義

DNA被壓縮和包裝，使其體積大大減小增加了DNA的穩(wěn)定性可能與復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的調(diào)控有關(guān)第四節(jié)RNA的分子結(jié)構(gòu)一、RNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1.單鏈狀，但許多區(qū)域可自身進(jìn)行堿基配對(duì)，形成回折。2.堿基配對(duì)規(guī)則：A-U，G-C，不能配對(duì)區(qū)域形成突起。3.RNA分子比DNA分子小得多，一般含幾十至幾千個(gè)核苷酸一、RNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)核苷酸之間的連結(jié)方式：3',5'-磷酸二酯鍵一、RNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)tRNA分子功能：tRNA：轉(zhuǎn)運(yùn)RNA，負(fù)責(zé)運(yùn)送氨基酸一、RNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)tRNA分子特點(diǎn)：數(shù)百種，分子量小，只有73-93個(gè)核苷酸組成，主要特點(diǎn)為含稀有核苷。一、RNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有較多的修飾成分A-U，G-C堿基對(duì)雙螺旋區(qū)為臂，其它區(qū)域?yàn)榄h(huán)。四臂四環(huán)。3'端都為CCA，用以接受氨基酸，叫葉柄；5'端都為pG

有十幾個(gè)恒定的核苷酸，對(duì)于維持其空間結(jié)構(gòu)和實(shí)現(xiàn)生物功能起重要作用tRNA分子A-U，G-C堿基對(duì)雙螺旋區(qū)為臂，其它區(qū)域?yàn)榄h(huán)。四臂四環(huán)。3'端都為CCA，用以接受氨基酸，叫葉柄；5'端都為pG

有較多的修飾成分tRNA分子反密碼環(huán)由7個(gè)核苷酸組成，有3個(gè)反密碼子可變環(huán)，由3-18核苷酸組成二氫尿嘧啶(D環(huán))tRNA分子TψC(ψ為假尿苷)3、tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)

倒L型：一端是—CCA，另一端是反密碼子環(huán)。二級(jí)結(jié)構(gòu)：三葉草形四環(huán)——二氫尿嘧啶環(huán)（D環(huán)）、反密碼環(huán)、額外環(huán)、TC環(huán)四臂——氨基酸臂、二氫尿嘧啶臂、反密碼臂、TC臂

結(jié)構(gòu)為行使功能提供基礎(chǔ)tRNA分子rRNA分子核糖體rRNA原核生物70S30S16S50S23S、5S真核生物80S40S18S60S28S、5S、5.8S占細(xì)胞內(nèi)總RNA的80％左右，由120-5000個(gè)核苷酸組成，但種類很少，只有3-4種。rRNA分子—結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與蛋白質(zhì)結(jié)合，組成大小亞基。具有酶功能，如核酶。合成蛋白質(zhì)的場(chǎng)所。二級(jí)結(jié)構(gòu)可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。也呈莖環(huán)結(jié)構(gòu)大腸桿菌5SrRNA

的二級(jí)結(jié)構(gòu)模型rRNA分子大腸桿菌5SrRNA

的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型rRNA分子mRNA分子含量少，單鏈分子大小不一，也能形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。mRNA是蛋白質(zhì)生物合成的模板。每一種蛋白質(zhì)都有對(duì)應(yīng)的mRNA，種類多。mRNA分子原核生物和真核生物的mRNA在結(jié)構(gòu)上有所不同：1)原核生物的mRNA是多順?lè)醋拥?，真核生物的mRNA是單順?lè)醋拥模?)原核mRNA5'端無(wú)帽子結(jié)構(gòu)，真核mRNA5'端有一段帽子結(jié)構(gòu)（m7GpppNmpNmp-）；3)原核mRNA3'端無(wú)PolyA，真核mRNA3'端有PolyA。

第五節(jié)核酸的理化性質(zhì)一物理性質(zhì)

DNA為白色纖維狀固體;RNA為白色粉末狀固體?

1、形態(tài)2、溶解性

微溶于水，不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般的有機(jī)溶劑；DNA在溶液中粘度大，RNA粘度小。核酸既含有酸性的磷酸基團(tuán)，又含有弱堿性的堿基，故可發(fā)生兩性解離。其解離狀態(tài)隨溶液的pH值而改變。3、兩性解離由于磷酸基團(tuán)的酸性很強(qiáng)，所以pI較低，整個(gè)分子相當(dāng)于多元酸。利用核酸的兩性解離可以通過(guò)調(diào)節(jié)核酸溶液的等電點(diǎn)來(lái)沉淀核酸，也可通過(guò)電泳分離純化核酸。嘌呤和嘧啶具有共軛雙鍵，能強(qiáng)烈吸收紫外光。在260nm處有最大吸收峰。對(duì)于純的DNA或RNA，可以通過(guò)測(cè)得A260來(lái)測(cè)定核酸的含量。純的DNA：A260/A280=1.8

純的RNA：A260/A280=2.0二紫外吸收性質(zhì)

A260/A280值可以反映核酸的純度。

核酸變性后，在260nm處的吸收值上升，這叫增色效應(yīng)(hyperchromiceffect)。增色效應(yīng)常可用來(lái)衡量DNA變性的程度。三核酸的變性

核酸在某些物理或化學(xué)因素的作用下，其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而引起理化性質(zhì)的改變及生物活性的降低或喪失叫變性。引起變性的因素有：加熱、酸堿、尿素、甲醛等。1.增色效應(yīng)

DNA分子變性(DNAdenaturation)

●

D.S.DNAS.S.DNA

(加溫,極端pH,尿素,酰胺)

變性過(guò)程的表現(xiàn)

☆

S.S.DNA粘度降低☆

S.S.DNA

沉降速度加快

☆

S.S.DNA分子的A260nmUV

值上升

(

Hyperchromicity

)

熱變性中光吸收達(dá)到最大吸收（完全變性）一半（雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半）時(shí)的溫度稱為DNA的熔點(diǎn)或熔解溫度（Tm）。2.熔解溫度三核酸的變性熱變性曲線(熔解曲線)圖5-26Tm的示意圖在DNA發(fā)生熱變性的過(guò)程中，A260隨溫度的變化曲線。1.1851.01.37OD℃Concentration50g/mL

D.SDNAA260=1S.SDNAA260=1.37dNTPsA260=1.60

Tm

=OD增加值的中點(diǎn)溫度(一般為85-95℃)

Tm值與DNA的均一性、G-C含量、介質(zhì)離子強(qiáng)度、pH等因素有關(guān)。

三核酸的變性l

增色效應(yīng)的跳躍現(xiàn)象(JumpofHyperchromicity)高分子量的DNA分子在熱變性過(guò)程中,富含AT區(qū)域首先發(fā)生變性,然后逐步擴(kuò)展,表現(xiàn)增色效應(yīng)的跳躍現(xiàn)象,使變形過(guò)程加快.

richAT

richAT

●影響Tm值的因素

☆在A,T,C,G隨機(jī)分布的情況下

☆GC%含量相同的情況下GC%愈高→Tm值愈大GC%愈低→Tm值愈小

AT形成變性核心，變性加快，Tm值小堿基排列對(duì)Tm值具有明顯影響（除變性核心外）

5

CG3GCn5

GC3CGn5

TA3ATn5

AT3TAn堿基堆積面和堿基積壓程度的差異

例：常溫下，活體內(nèi)D.SDNA分子中富含AT的變性核心區(qū)（promoter,terminatorregion

）

常表現(xiàn)氫鍵的斷裂與形成的“DNA呼吸現(xiàn)象”37.6℃57℃

Tm＞＞＜＜?jí)A基排列對(duì)Tm值具有明顯影響☆大片段D.SDNA分子之間比較片段長(zhǎng)短對(duì)Tm值的影響較小,但與組成和排列相關(guān)☆小于100bp

的D.SDNA分子比較片段愈短，變性愈快，Tm值愈小☆變性液中含有尿素，酰胺等尿素，酰胺與堿基間形成氫鍵

改變堿基對(duì)間的氫鍵

Tm值可降至40℃左右

☆鹽濃度的影響

單鏈DNA主鏈的磷酸基團(tuán)負(fù)電荷的靜電斥力兩條單鏈DNA的分離

Na+在磷酸基團(tuán)周圍形成的電子云對(duì)靜電斥力產(chǎn)生屏蔽作用減弱靜電斥力Tm↑當(dāng)Na+濃度低屏蔽作用小斥力加強(qiáng)Tm↓TmODA260

靜電斥力

0.01M0.1M1.0MNa+當(dāng)Na+濃度高

屏蔽作用大斥力減弱熵值(△S)上升堿基溶解性降低疏水作用力增加四核酸的復(fù)