開(kāi)題醫(yī)學(xué)研究生幻燈片

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蒞臨指導(dǎo)肺泡表面活性物質(zhì)研究生:鐘紅平

導(dǎo)師:教授主要內(nèi)容1.選題的目的2.選題的理論和實(shí)際意義7.目前進(jìn)展情況3.主要研究?jī)?nèi)容5.主要研究方法4.主要技術(shù)路線6.預(yù)期結(jié)果選題目的本課題以RDS大白鼠模型和健康大白鼠通過(guò)檢測(cè)KLF2轉(zhuǎn)錄因子和KLF2mRNA在大白鼠肺組織表達(dá)以及RDS大鼠甲狀腺素水平的變化的研究，確立甲狀腺素和KLF2對(duì)肺泡Ⅰ型細(xì)胞功能調(diào)控以及在RDS發(fā)病中所起的作用和機(jī)制，提出了在對(duì)肺表面活性物質(zhì)治療不敏感的NRDS中一種新型的治療選擇,為早期給NRDS患兒甲狀腺素替代治療提供理論依據(jù)。選題的理論和意義

新生兒呼吸窘迫綜合癥（NeonatalrespiratorydistresssyndromeNRDS)是新生兒早期死亡的重要原因，臨床特點(diǎn)為出生后不久即出現(xiàn)進(jìn)行性呼吸困難、青紫、呼氣性呻吟、吸氣性三凹征和呼吸衰竭。本病由于早產(chǎn)兒肺結(jié)構(gòu)不成熟、缺乏肺表面活性物質(zhì)(PS)引起。病理特征為肺泡壁至終末細(xì)支氣管壁上廣泛嗜伊紅透明膜形成并肺不張，若不治療,可發(fā)生進(jìn)行性低氧血癥和呼吸衰竭,甚至死亡【1】。NRDS不僅容易發(fā)生在早產(chǎn)兒，而且選擇性剖宮產(chǎn)足月新生兒也容易發(fā)生，目前對(duì)NRDS的治療主要是采用補(bǔ)充外源性的PS聯(lián)合機(jī)械通氣治療，外源性的PS價(jià)格非常昂貴。但值得注意的是約20％至30％NRDS的患兒對(duì)表面活性劑替代療法不敏感【2】，尤其是胎齡越小的早產(chǎn)兒由于肺泡結(jié)構(gòu)發(fā)育不成熟，對(duì)外源性表面活性劑無(wú)反應(yīng)，建立成功的治療方案往往因?qū)RDS的發(fā)生、發(fā)展的認(rèn)識(shí)而受到很大的限制。因此進(jìn)一步了解NRDS的發(fā)病機(jī)制和對(duì)外源性表面活性劑無(wú)反應(yīng)機(jī)理是十分重要的。目前對(duì)于NRDS的發(fā)病機(jī)制主要集中在肺泡Ⅱ細(xì)胞功能上，近年來(lái)對(duì)NRDS的認(rèn)識(shí)逐步發(fā)展到對(duì)肺泡整體細(xì)胞功能的調(diào)控上，尤其是肺泡Ⅰ型細(xì)胞的功能調(diào)控越來(lái)越受到重視。如何調(diào)控肺泡Ⅰ型細(xì)胞的功能是目前的研究熱點(diǎn)。肺泡I型上皮細(xì)胞的功能在NRDS的發(fā)病機(jī)制中起重要的作用。國(guó)內(nèi)外經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的研究證明【3-5】I型肺泡細(xì)胞負(fù)責(zé)進(jìn)行氣體交換，Ⅱ型肺泡細(xì)胞產(chǎn)生PS，降低肺表面張力。糖皮質(zhì)激素和他們的同源受體已經(jīng)很早被知道可以促進(jìn)Ⅱ型肺泡的成熟，來(lái)協(xié)調(diào)PS的產(chǎn)生。產(chǎn)前孕母糖皮質(zhì)激素的預(yù)防應(yīng)用和新生兒外源性的PS替代治療作用還是不能降低NRDS的發(fā)生和改善部分NRDS的癥狀，所以目前提出只有I型和II型肺泡細(xì)胞功能協(xié)調(diào)，相互調(diào)節(jié)平衡才能保證肺泡的擴(kuò)張和有效的氣體交換。但是對(duì)于I型肺泡通路控制的細(xì)胞介導(dǎo)的氣體交換卻知之甚少。

LimingPei等【2】在小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)SMRT的突變從而導(dǎo)致1型肺泡的早熟，出現(xiàn)一種新型的RDS，盡管對(duì)糖皮質(zhì)激素反應(yīng)不敏感，但是聯(lián)合應(yīng)用抗甲狀腺激素類藥物完全可以減少SMRT引起的NRDS，表明甲狀腺激素受體（hormonereceptorTR）在肺發(fā)育中的重要作用還沒(méi)有被認(rèn)識(shí)到。甲狀腺激素與甲狀腺激素受體作用形成TR-SMRI復(fù)合物，激活下游Krüppel樣鋅指轉(zhuǎn)錄因子(Krüppel-liketranscriptionfac-tors,KLFs)中的

KLF2因子，促進(jìn)肺泡Ⅰ型細(xì)胞的分化和成熟，沒(méi)有KLF2的小鼠會(huì)缺乏成熟1型肺泡，最終導(dǎo)致小鼠在生后很短時(shí)間內(nèi)死亡。死亡的RDS的幼崽和它們同窩出生仔畜相比，肺內(nèi)KLF2mRNA和蛋白水平較低，組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)RDS幼崽出現(xiàn)肺不張，并且有很少典型I型肺泡的扁平細(xì)胞，但是有豐富的立方形Ⅱ型樣細(xì)胞，免疫組織化學(xué)顯示在他們的肺中I型標(biāo)記物蛋白顯著減少，從SP-B，SP-C和PECAM-1染色判定Ⅱ型肺細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞并沒(méi)有受到影響，這些結(jié)果表明，KLF2在I型肺泡的分化和體內(nèi)正常的肺發(fā)育中是必不可少的。進(jìn)一步研究KLFs是Spl/Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子(Spl-likeandKrüppel-liketranscriptionfactors,Spl/KLFs)家族中的一個(gè)亞家族【6】。在哺乳動(dòng)物中,KLFs可調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、凋亡和分化等,它們對(duì)早期胚胎發(fā)育也至關(guān)重要。Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子2(Kruppel-likefactor2KLF2),是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，由于最初被發(fā)現(xiàn)主要在肺內(nèi)高表達(dá)，因此也被稱為肺Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子(LKLF)【7】對(duì)肺的發(fā)育起關(guān)鍵性作用。甲狀腺激素受體和KLF2是I型肺泡細(xì)胞分化、成熟的重要受體和因子，國(guó)內(nèi)外對(duì)此的研究剛剛開(kāi)始，還未涉及它們與NRDS的相互關(guān)系，甲狀腺激素水平和NRDS的相關(guān)性研究很少。主要研究?jī)?nèi)容（2）通過(guò)對(duì)移植模型中治療組與模型對(duì)照組腫瘤體積變化、腫瘤重量變化及正常組與模型對(duì)照組、各治療組之間胸腺指數(shù)與脾指數(shù)的變化，研究參雄抗癌丸的作用機(jī)制。

（3）本實(shí)驗(yàn)采用腫瘤組織HE常規(guī)染色，從形態(tài)學(xué)上觀察各組間腫瘤細(xì)胞密度，腫瘤壞死程度（1）動(dòng)物移植性腫瘤模型的成功制備（4）用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組的腫瘤細(xì)胞凋亡率；用免疫組化技術(shù)觀察該藥物對(duì)腫瘤組織VEGF及MVD表達(dá)的實(shí)驗(yàn)影響（5）

本項(xiàng)研究采用腹腔種植H22瘤株制造肝癌模型，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究參雄抗癌丸對(duì)荷瘤鼠VEGF及MVD表達(dá)的實(shí)驗(yàn)影響，從分子水平探討參雄抗癌丸對(duì)腫瘤的影響機(jī)制。從而為該藥提供技術(shù)支持，并為其產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和走向市場(chǎng)提供理論依據(jù)。主要技術(shù)路線選購(gòu)SPF級(jí)小鼠動(dòng)物造模及分組參雄抗癌丸高劑量組參雄抗癌丸中劑量組參雄抗癌丸低劑量組5-FU組模型對(duì)照組正常組給藥、標(biāo)本采集和處理檢測(cè)：1肉眼觀察2抑瘤率的測(cè)定3HE常規(guī)染色4細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期的測(cè)定5免疫組化檢測(cè)VEGF和MVD

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，撰寫(xiě)論文主要研究方法1.實(shí)驗(yàn)材料1)瘤株H22北京藥物研究所引進(jìn)，甘肅醫(yī)學(xué)科學(xué)院傳代保種。2）實(shí)驗(yàn)藥品參雄抗癌丸由甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院制成水蜜丸劑，每包2克；5-FU注射液3）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明小鼠，雌雄各半，體重18～20g,5～6w齡，由甘肅省中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供2.實(shí)驗(yàn)方法：（1）造模：從H22瘤株傳代小鼠的腹腔抽取乳白色的瘤液，用生理鹽水稀釋至瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)為2×106個(gè)/ml，胎盤(pán)藍(lán)染色證實(shí)活細(xì)胞數(shù)達(dá)到96%，將瘤細(xì)胞懸液注射到小鼠右前肢腋窩部皮下0.2ml／只，接種的瘤細(xì)胞數(shù)約為5×106個(gè)／只。均在無(wú)菌條件下進(jìn)行（2）動(dòng)物分組及給藥方法:接種次日，將除正常組外的80只小鼠隨機(jī)分為5組:A組為模型對(duì)照組，每日用蒸餾水灌胃；B組為陽(yáng)性對(duì)照組，每天5-FU10㎎/kg腹腔注射；C組為藥物高劑量組1560㎎/kg灌胃。D組為藥物中劑量組780㎎/kg灌胃。E組為藥物低劑量組390㎎/kg灌胃。每天一次，連續(xù)灌胃10天。(4)標(biāo)本采集及處理：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后第二天，將禁食12小時(shí)的所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脫頸處死取脾臟、胸腺和瘤組織。3.觀察指標(biāo)（2）計(jì)算相關(guān)免疫器官指數(shù)及抑瘤率分別按以下公式計(jì)算脾指數(shù)、胸腺指數(shù)和抑瘤率（單位：mg/l0g）胸腺指數(shù)=胸腺重量（mg）/體重(g)脾指數(shù)=脾臟重量（mg）/體重(g)（3）抑瘤率完整剝離腫瘤,用1/1000電子天平稱取瘤重。抑瘤率(%)=(1-T/C)×100%,(T/C:治療組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)。（4）病理形態(tài)學(xué)觀察瘤組織塊以4﹪甲醛固定，石蠟包埋，切片，經(jīng)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察瘤組織病理變化（1）造模后，觀察各組小鼠局部瘤組織情況，小鼠活動(dòng)、進(jìn)食、精神狀態(tài)等情況。（（5）細(xì)胞凋亡率的測(cè)定

根據(jù)試劑盒上的說(shuō)明書(shū)具體步驟進(jìn)行（6）標(biāo)本切取:停藥次日小鼠頸椎脫臼處死，完整剝離腫瘤，10﹪中性緩沖福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，石蠟切片厚5um。各組計(jì)量資料輸入計(jì)算機(jī)，采用SPSS16.0forwindows統(tǒng)計(jì)軟件包，以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(X士S)表示，各組間的比較采用單因素方差分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

參雄抗癌丸對(duì)荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)有抑制作用，治療后抑瘤率較模型組有顯著差異

參雄抗癌丸可提高腫瘤細(xì)胞的凋亡率，具有促進(jìn)或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用。參雄抗癌丸可抑制肝癌組織VEGF的表達(dá)水平，同時(shí)降低肝癌組織MVD。（各治療組的MVD和VEGF水平與病理模型組比較均有明顯的下降。）

預(yù)期結(jié)果目前進(jìn)展情況目前已完成文獻(xiàn)檢索經(jīng)費(fèi)預(yù)算1.材料購(gòu)置費(fèi)2000元2.試劑購(gòu)置費(fèi)3000元3.檢測(cè)勞務(wù)費(fèi)2500元4.文獻(xiàn)檢索費(fèi)200元5.論文打印及版面發(fā)表1500元6.論文答辯1500元

共計(jì)：10700元實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)為研究生科研經(jīng)費(fèi)研究進(jìn)度及具體時(shí)間安排2007年12月---2008年2月撰寫(xiě)開(kāi)題報(bào)告2008年3月---2008年5月