基因工程載體

第四章基因工程載體

VesctorsforGeneticEngineering作為一個(gè)理想的載體，應(yīng)具備以下條件：

載體：這種能與目的基因結(jié)合，且有完整的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄功能的DNA大分子稱之為載體（vector）。

（1）能夠在宿主細(xì)胞中存在并繁殖，有功能良好的復(fù)制子和啟動(dòng)子，使插入基因復(fù)制和表達(dá)；（2）具有多個(gè)限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn)，且切點(diǎn)是單一的，這樣可將多個(gè)外源DNA片段插入其中；（3）具有容易檢測的篩選標(biāo)記；（4）載體DNA的分子量適當(dāng)，可容納較大的外源DNA片段，又可在受體細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增較多的拷貝；（5）在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高，這樣可以使重組體可以穩(wěn)定傳代而不易丟失。

第一節(jié)微生物基因工程載體

克隆載體（cloningvector）：主要是對目的基因克隆，建立DNA文庫和cDNA文庫，其上有復(fù)制子即可；表達(dá)載體（expressionvector）：能使目的基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的一類載體。這類載體既有復(fù)制子，更要有強(qiáng)啟動(dòng)子；穿梭載體（shuttlevector）：這類載體可以在原核細(xì)胞中復(fù)制，也可在真核細(xì)胞中擴(kuò)增和表達(dá)。一、質(zhì)粒載體

細(xì)菌質(zhì)粒(plasmid)載體是基因工程中最常用的載體,它必須包括三種組成部分：復(fù)制必須區(qū)，選擇標(biāo)記基因和限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)（克隆位點(diǎn)，MCS).

質(zhì)粒DNA分子具有三種構(gòu)型：

ClosedcircleDNA,ccDNA;supercoil;SC構(gòu)型

OpencircleDNA,OC構(gòu)型;LinerDNA,IDNA;L構(gòu)型.1.嚴(yán)緊型和松馳型質(zhì)粒嚴(yán)緊型質(zhì)粒：在宿主細(xì)胞中的拷貝數(shù)較少，一般只有1～3個(gè)松馳型質(zhì)粒：其拷貝數(shù)較多，一般20～60個(gè)，多的可達(dá)200～300個(gè)

2、轉(zhuǎn)移型和非轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒3.質(zhì)粒的不相容性和不親和群

轉(zhuǎn)移型，結(jié)合型（conjugativeplasmid）是指一些質(zhì)粒在不同的菌株中可以相互轉(zhuǎn)移。

非轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒(non-conjugativeplasmid)則只能在一種寄主中生存

質(zhì)粒的不相容性：一般地，不同質(zhì)粒不能共處在一個(gè)細(xì)胞中，這種特性稱質(zhì)粒的不相容性，當(dāng)它們處在一起時(shí)，便有生存競爭，結(jié)果一種質(zhì)粒繁殖，另一種逐漸被排斥，數(shù)目變少。不親和群：彼此不相容的質(zhì)粒組成一個(gè)不親合群。

（二）、質(zhì)粒的命名1、人工組建的質(zhì)粒人工組建的質(zhì)粒的第一個(gè)字母是質(zhì)粒英文名字（plasmid）的第一個(gè)字符p，用小寫。p后有2個(gè)字母是大寫，表示質(zhì)粒的作者和實(shí)驗(yàn)室名稱，再其后為質(zhì)粒的編號。例：pXYp109；pSC101等天然載體質(zhì)粒的第一個(gè)字母大寫，且質(zhì)粒符號用括號括起來。如（C01E1）。農(nóng)桿菌質(zhì)粒用p加Ti（Tumerinducing）或At（Agrobacterium

tumefacions）表示，如pTiC58。2、天然載體質(zhì)粒（三）、常用質(zhì)粒載體

1.pSC101

圖2.pBR322

（1）組成它由三部分組成：來自pSCl01的四環(huán)素抗性基因Tetr來自ColEl的衍生物pMBl的松弛復(fù)制起點(diǎn)ori來自RSF2124的氨芐青霉素抗性基因Ampr。

（2）特點(diǎn)（3）重組克隆的

“插入失活”篩選方法

具有多個(gè)單一的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。Tetr中有BamH1切點(diǎn)（G↓GATCC）和SalⅠ切點(diǎn)（G↓AATTC），Ampr中有PstⅠ切點(diǎn)（CTGCA↓G）。

利用ColEl的復(fù)制子，所以在細(xì)胞中是多拷貝的，可通過氯霉素使質(zhì)?？截悢?shù)進(jìn)一步擴(kuò)增。pBR322—→插入在Tetr中，基因型為Tets

、Ampr——→在含有氨卞青霉素培養(yǎng)基上可生長，在在含有四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長；pBR322—→插入在Ampr中，基因型為Tetr

、Amps、——→在含有氨卞青霉素培養(yǎng)基上不生長，在在含有四環(huán)素培養(yǎng)基可不生長；而在兩種抗生素培養(yǎng)基上都生長的是非重組型。這種在一個(gè)基因位點(diǎn)中插入外源DNA片段，從而使該基因活性喪失的現(xiàn)象叫插入失活。

AmprTet

rTet

rAmpsPstI....

....涂布有Tet的培養(yǎng)基涂布有Amp的培養(yǎng)基......重組體的篩選外源基因的插入：.3、pUC系列質(zhì)粒載體

（1）特點(diǎn)具有更小的分子量（2686bp）和更高的拷貝數(shù)。具有多克隆位點(diǎn)可用組化方法鑒別：可通過插入失活法進(jìn)行篩選含有一個(gè)來自于大腸桿菌的經(jīng)過加工的LacZ基因（LacZ′），它編碼β-半乳糖苷酶氨基端146個(gè)氨基酸，可以和β-半乳糖苷酶缺陷型的大腸桿菌實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ)，即α—互補(bǔ)，恢復(fù)分解乳糖的能力。X-gal也是β-半乳糖苷酶的一種底物，經(jīng)降解后可生成溴氯吲哚，使大腸桿菌菌落呈藍(lán)色。當(dāng)無β-半乳糖苷酶時(shí)，X-gal不被分解，菌落呈白色。當(dāng)外源基因插入到pUC質(zhì)粒的LacZ′基因內(nèi)部，則LacZ′基因受到破壞，便不能再和缺陷型受體菌中生成有活性的β-半乳糖苷酶，因此，菌落呈白色。反之，非重組體為藍(lán)色菌落。含Ampr抗性基因，可通過插入失活和顏色反應(yīng)進(jìn)行雙重篩選。lacZ’lacZ’N端C端缺陷型大腸桿菌完整的β-半乳糖苷酶（四）大腸桿菌中的表達(dá)載體表達(dá)載體應(yīng)含有：（1）強(qiáng)啟動(dòng)子（2）在啟動(dòng)子下游區(qū)和ATG上游區(qū)有一個(gè)好的SD序列。（3）在外源基因插入序列下游區(qū)要有一個(gè)強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄終止序列，保證外源基因有效轉(zhuǎn)錄和質(zhì)粒的穩(wěn)定性。二、噬菌體載體

（一）、λ噬菌體載體

1、λ噬菌體載體的特征

λ噬菌體顆粒中DNA為線狀雙鏈DNA分子，全長48502bp，兩端各有一段長度為12個(gè)核苷酸的互補(bǔ)單鏈（粘端），稱為cos位點(diǎn)。λ噬菌體有61個(gè)基因，其中有1/3的區(qū)域是其裂解性生長的非必需區(qū)，這一區(qū)段的缺失，或在此區(qū)段中插入外源DNA，并不影響噬菌體的增殖，這就是λ噬菌體可作為基因載體的依據(jù)。

GGGCGGCGACCTCCCGCCGCTGGATACG環(huán)化作用2、λ噬菌體的缺陷與改造

λ噬菌體的改造⑴基因組太大（49kb）；⑵酶切點(diǎn)太多，它有5個(gè)BamH1位點(diǎn)（G↓GATCC），6個(gè)BgⅠ位點(diǎn)（A↓GATCT），5個(gè)EcoRⅠ位點(diǎn)（G↓AATTC）。⑶

野生型只能接納一定長度的DNA。若相當(dāng)于λ噬菌體的75-105%，那么只能接納49kb×5%=2.45kb的DNA。

⑴切去非必須區(qū)段，在切去的同時(shí)，加載目的基因（2.5kb或更大）；⑵去處太多的酶位點(diǎn)，每種酶只留1-2個(gè)切口；⑶

增加標(biāo)記基因（remarkegene）。(4)

引入無義突變．λ噬菌體的缺陷：3.λ噬菌體的主要類型

（1）插入型載體

只有1～2種限制性核酸內(nèi)切酶的單一切割位點(diǎn)

免疫功能失活大腸桿菌β-半乳糖苷酶失活

（2）替換型載體

在其中央部位有一個(gè)可以被外源插入的DNA分子取代的DNA片段的克隆載體

。這是由于構(gòu)建此載體時(shí)，安排在中央可取代片段兩側(cè)的多克隆位點(diǎn)是反向重復(fù)序列，因此，當(dāng)外源DNA插入時(shí)，一對克隆位點(diǎn)之間的DNA片段便會(huì)被置換掉，從而有效提高了克隆外源DNA片段的能力。

（二）M13噬菌體載體

M13噬菌體屬絲狀噬菌體，其基因組為閉合環(huán)狀正鏈ssDNA，6407bp，其中90%的DNA都編碼蛋白質(zhì)，有10個(gè)基因，有兩個(gè)較長的間隔區(qū)，是外源基因插入的部位。

M13噬菌體產(chǎn)生單雙鏈DNA的機(jī)制。1、以（+）鏈DNA為摸板，合成互補(bǔ)（－）鏈，該雙鏈稱復(fù)制型DNA（RFDNA）。2、RFDNA在宿主細(xì)胞內(nèi)能快速增殖，可增加到每個(gè)細(xì)胞約200個(gè)拷貝。3、單鏈特異的DNA結(jié)合蛋白結(jié)合在（+）鏈上，從而阻斷了其互補(bǔ)鏈，即（－）鏈的合成，這樣，細(xì)胞就會(huì)不斷的合成（+）鏈DNA。4、游離出來的（+）鏈DNA先與基因V的編碼產(chǎn)物形成特異的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后轉(zhuǎn)移到寄主細(xì)胞膜，同時(shí)基因V的蛋白質(zhì)從（+）DNA鏈上脫落下來，余下的M13（+）鏈DNA則是從其感染的寄主細(xì)胞的細(xì)胞膜溢出的過程中，被外殼蛋白包裝成病毒顆粒的。

++-+-+-+-+-+-單鏈結(jié)合蛋白RF型DNA復(fù)制約200copy+++++以-鏈DNA為模板合成+鏈DNA三、噬菌粒載體（科斯質(zhì)粒cosmid

）1、構(gòu)建由質(zhì)粒和λ噬菌體的粘性末端構(gòu)建而成的。借用cos-（粘性尾巴）作字頭，質(zhì)粒的-mid作字尾，故稱Cosmid，也叫粘粒載體。

2、特點(diǎn)（1）有λ噬菌體的高效感染能力。⑵

有質(zhì)粒的高效復(fù)制特性。⑶有更廣泛寄主。⑷有較大的容量。３．主要用途：用于DNA序列分析四、酵母菌載體

①含有E.coli質(zhì)粒的復(fù)制起始序列，這樣在外源基因轉(zhuǎn)到酵母細(xì)胞前可先在大腸桿菌中擴(kuò)增。②含有酵母的篩選標(biāo)記，這樣當(dāng)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入相應(yīng)的酵母細(xì)胞后，可用來篩選重組體。③具有合適的供外源基因插入的限制酶切割位點(diǎn)。共同的特點(diǎn)：多數(shù)酵母中含有一種能獨(dú)立復(fù)制的環(huán)狀雙鏈DNA，稱為2μ質(zhì)粒，長約6.3kb，有單一的復(fù)制起始點(diǎn)和一個(gè)自主復(fù)制功能區(qū)域（ARS片段）。

根據(jù)質(zhì)粒的復(fù)制方式不同將它們分為：整合型、復(fù)制型、附加型和穩(wěn)定型等類型。

整合型：含有酵母的篩選標(biāo)記ura3，但不具有酵母的復(fù)制起始點(diǎn)該質(zhì)粒DNA以單拷貝形式穩(wěn)定遺傳，缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)化率較低（1～10轉(zhuǎn)化子/μgDNA）

復(fù)制型：是酵母DNA片段插入到大腸桿菌質(zhì)粒中構(gòu)成的，插入片段含有酵母的篩選標(biāo)記ura3和2uDNA片段，一般以低拷貝數(shù)維持在酵母染色體之外。復(fù)制型載體對酶母的轉(zhuǎn)化率極高（102～103轉(zhuǎn)化子/μgDNA），但是轉(zhuǎn)化子不穩(wěn)定，容易丟失。

附加型：是在pBR322中插入酵母篩選標(biāo)記和2uDNA的ARS序列構(gòu)建成的。這種質(zhì)粒以附加體的形式存在于真核細(xì)胞中。附加型型載體對酵母具有很高的轉(zhuǎn)化活性（102～103轉(zhuǎn)化子/μgDNA），且與復(fù)制型相比，穩(wěn)定性高，拷貝數(shù)也較高（25～100分子/細(xì)胞）。

穩(wěn)定型：在附加型載體中再插入酵母著絲粒的一個(gè)DNA片段（CEN）。

第二節(jié)

植物基因工程載體

一、根癌農(nóng)桿菌及Ti質(zhì)粒

（一）、根癌農(nóng)桿菌與冠癭瘤

根癌農(nóng)桿菌屬根瘤菌科農(nóng)桿菌屬，通過傷口可感染雙子葉植物，并在創(chuàng)傷部位使組織惡性增生而形成植物腫瘤，叫冠癭瘤（crowngalltumor）。冠癭堿類植物激素章魚堿胭脂堿農(nóng)桿堿（二）、Ti質(zhì)粒及T-DNA的結(jié)構(gòu)與功能

1、T-DNA區(qū)Ti質(zhì)粒是農(nóng)桿菌非染色體的環(huán)狀雙鏈DNA分子，分子量為90×106～150×106道爾頓，有16~240kb。致病菌株37℃培養(yǎng)治愈菌株（Ti質(zhì)粒被消除）治愈菌株

與致病菌株接合致病菌株（重新獲得Ti質(zhì)粒）胭脂堿型質(zhì)粒T區(qū)大小約23kb，單一序列插入植物核DNA。章魚堿型左區(qū)(TL-DNA)：長約13kb，通常為單拷貝，有誘發(fā)和維持腫瘤的作用。右區(qū)(TR-DNA)：長約7kb，多拷貝的含有參與冠癭堿生物合成的蛋白酶的編碼基因。圖章魚堿pTiAch5和胭脂堿pTiC58質(zhì)粒的遺傳圖共同區(qū)：T區(qū)有控制腫瘤形態(tài)和編碼冠癭堿合成酶基因，實(shí)際上shi基因與生長素合成有關(guān)。roi基因與細(xì)胞分裂素合成有關(guān)，Ocs是章魚堿合成酶基因，Agr是編碼農(nóng)桿堿合成酶基因，章魚堿型與胭脂堿型的T區(qū)中上述基因分布不完全一致，但90％是相同的稱共同區(qū)。3個(gè)同源區(qū)段，含有6個(gè)基因位點(diǎn)，是冠癭瘤形成所必需的，統(tǒng)稱“致癌基因”(oncogene，onc)。

非同源序列則編碼冠癭堿合成酶，在胭脂堿型中叫Nos，章魚堿型酶叫Ocs。

共同區(qū)已知T-DNA的兩側(cè)是被一對保守的25bp的重復(fù)序列包圍著，而且在一系列不同的植物腫瘤DNA中發(fā)現(xiàn)，T-DNA的兩邊端點(diǎn)是位于這種同向重復(fù)序列的當(dāng)中或附近，這種同向重復(fù)序列實(shí)際上就是T-DNA的邊緣區(qū)。右側(cè)邊緣區(qū)又叫RB序列，左側(cè)邊緣區(qū)又叫LB序列。2、毒性Vir

區(qū)，VirA、B、D和G為致瘤性，它們的突變型為非致病性。VirA、C、D編碼專一核酸內(nèi)切酶蛋白，與VirB共同作用，與T-DNA遷移直接有關(guān)。VirC部分決定寄主范圍VirE與菌體感染過程有關(guān)Vir區(qū)大約35kb，包含6個(gè)互補(bǔ)群，A、B、C、D、E、G。

3、代謝區(qū)Tra，T-DNA轉(zhuǎn)移功能；Agr，農(nóng)桿堿代謝；Inc，不同類型質(zhì)粒代謝相容性；Occ和Noc，章魚堿和胭脂堿分解代謝。（三）農(nóng)桿菌對寄主的侵染和T-DNA的轉(zhuǎn)移

1、侵染過程2、T-DNA的轉(zhuǎn)移（1）創(chuàng)傷植物細(xì)胞釋放出可激活Ti質(zhì)粒Vir基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的蛋白因子；（2）VirA和VirD蛋白因子進(jìn)一步激活其它的Vir基因進(jìn)行表達(dá)；（3）先在Ti質(zhì)粒右側(cè)邊緣區(qū)產(chǎn)生出頭一個(gè)單鏈缺口；（4）接著在Ti質(zhì)粒左側(cè)邊緣區(qū)產(chǎn)生出另一個(gè)單鏈缺口，結(jié)果釋放出的單鏈T-DNA分子便定向地轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞，并隨機(jī)整合到寄主染色體基因組上；（5）Ti質(zhì)粒中移走的單鏈T-DNA區(qū)，通過DNA復(fù)制得到修復(fù)。（四）Ti質(zhì)粒作為植物基因工程的載體

1、可行性2、存在缺陷（1）轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞很難形成完整植株。（2）質(zhì)粒上分布著多個(gè)酶切位點(diǎn)，而不是單一切點(diǎn)，酶切后不易成環(huán)，給插入目的基因帶來困難。（3）Ti質(zhì)粒只能在農(nóng)桿菌中復(fù)制、繁殖而擴(kuò)增，可農(nóng)桿菌對Ti的轉(zhuǎn)化率太低，只有10—9～10—7左右。（1）將細(xì)菌轉(zhuǎn)座子Tn7插入胭脂堿合成酶基因（Nos）位置上，該Ti質(zhì)粒仍能實(shí)現(xiàn)T-DNA轉(zhuǎn)移。

（2）用Cat與Nos和Ocs基因啟動(dòng)子拼接后，重組進(jìn)入Ti質(zhì)粒，Ti質(zhì)粒感染植物，植物細(xì)胞中檢測到了Cat基因的酶的存在。

（五）Ti質(zhì)粒的改造

1、去除致瘤基因Onc

由于影響植株再生的直接原因是T-DNA中的Onc基因的致瘤作用，因此，切除其致瘤基因，使成為無毒的質(zhì)粒，記為Onc—，這個(gè)過程叫“卸甲”、

“繳械”或“解除武裝”，構(gòu)建的Onc—載體叫“卸甲載體”。例：pGV38502、共整合質(zhì)粒

（1）首先構(gòu)建中間載體，如將大腸桿菌pBR322質(zhì)粒帶上一段與Ti質(zhì)粒T區(qū)同源的一個(gè)片段，它在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中均能復(fù)制；（2）然后將目的基因插入該片段的適當(dāng)位置，這樣使目的基因兩端帶上了與Ti質(zhì)粒T-DNA同源的DNA序列；（3）然后再將該質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)化或接合引入含有Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌中。（4）引入的衍生質(zhì)粒和原細(xì)胞中Ti質(zhì)粒具同源性，因而可產(chǎn)生無性配對重組，通過交換，可將目的基因轉(zhuǎn)到Ti質(zhì)粒上，使之產(chǎn)生真正的具有外源基因的Ti質(zhì)粒，稱共整合質(zhì)粒。

3、雙元載體

“雙元載體”，也稱反式載體，是指由兩個(gè)分別含T-DNA和Vir相容性Ti質(zhì)粒構(gòu)成的雙質(zhì)粒系統(tǒng)。

含有為T-DNA轉(zhuǎn)移所必須的Vir區(qū)的質(zhì)粒，另一個(gè)則是含有T-DNA區(qū)段的寄主范圍廣泛的DNA轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒，后一種質(zhì)粒較小，可在大腸桿菌中復(fù)制，因而易操作，可用來插入外源基因。4、載體盒

所謂“載體盒”(Vectorcassette)是將植物的標(biāo)志基因、多插入位點(diǎn)、細(xì)菌標(biāo)志基因和質(zhì)粒的復(fù)制啟動(dòng)子位點(diǎn)等集于一身的質(zhì)粒系統(tǒng)，象一個(gè)集裝箱似的集合在一起。

二、Ri質(zhì)粒載體

三、CaMV(花椰菜花葉病毒)載體系統(tǒng)

Ri質(zhì)粒其結(jié)構(gòu)和功能與Ti十分相似。與Ti質(zhì)粒相比的優(yōu)點(diǎn)：可以構(gòu)建完整的Onc+載體?；ㄒ嘶ㄈ~病毒(caulimovirus，簡稱CaMV)實(shí)際上是一個(gè)病毒群，已知有12個(gè)種，每個(gè)種的寄主范圍都很窄，不感染豆類和單子葉植株，它的主要寄主是蕓苔屬。

CaMVDNA有兩個(gè)特別之點(diǎn)，一是在專一位點(diǎn)有不連續(xù)性，DNA鏈上有一處到三處不連續(xù)；另一點(diǎn)是在電鏡下觀察到DNA大部分有盤繞結(jié)構(gòu)，看上去似超螺旋。1、互補(bǔ)載體系統(tǒng)

2、混合載體系統(tǒng)

缺陷性CaMV+輔助病毒分子

將CaMVDNA克隆到了Ti質(zhì)粒上，通過農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞，可產(chǎn)生典型的病毒感染癥狀。

3、CaMV35S啟動(dòng)子融合基因載體系統(tǒng)

SalI

Kmr

SalISalITi質(zhì)粒T-DNA區(qū)SalI

Kmr

SalI混合載體構(gòu)建過程SalISalISalI四、脂質(zhì)體(1iposomes)載體

（一）、脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

脂質(zhì)體是磷脂在水中形成的一種由脂雙分子層圍成的囊狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)是一種分子排列有序的近晶型液晶。脂質(zhì)體的主要成分是磷脂，如磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸，磷脂酰乙醇胺等。

圖（二）脂質(zhì)體與細(xì)胞的相互作用

制備方法：有超聲波法、機(jī)械振蕩法、透析法、融合法以及逆向蒸發(fā)法等。

脂質(zhì)體作為載體的機(jī)理與細(xì)菌球質(zhì)體的作用是相似的，它能將DNA包埋在里邊，在PEG誘導(dǎo)下，通過細(xì)胞的吞噬或融合作用將內(nèi)含物轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，最終與受體核DNA結(jié)合。脂質(zhì)體與細(xì)胞的相互作用主要有以下幾種形式：

1.內(nèi)吞作用2.融合作用3.交換作用

優(yōu)點(diǎn)：使包裝在里邊的物質(zhì)（質(zhì)?；駾NA）能避開核酸酶的降解，對受體無毒性，易被吸收，運(yùn)送率高，轉(zhuǎn)化率高。更重要的是脂質(zhì)體制備比常用的質(zhì)粒