張忠版食品生物化學-第5章蛋白質與核酸1

第一節(jié)、蛋白質的基本組成單位第二節(jié)、蛋白質的分子結構第三節(jié)、蛋白質的分類及性質第四節(jié)、核酸的化學組成第五節(jié)、核酸分子的結構第六節(jié)、核酸的理化性質和分離提純第五章蛋白質與核酸蛋白質是由天然氨基酸(Aminoacid)通過肽鍵(Peptidebond)連接而成的生物大分子。是一切生物體中普遍存在的生物大分子，是生物功能的主要載體。生物遺傳形狀（存在于信息大分子DNA中）是通過蛋白質來表現的。酶、調節(jié)蛋白、轉運蛋白、貯存蛋白等蛋白質種類繁多、各具一定的相對分子量（一般在一萬到一百萬，甚至高達數百萬）、復雜的分子結構和特定的生物功能。蛋白質第一節(jié)、蛋白質的基本組成單位一蛋白質的元素組成：

C、H、O、N及少量的S和磷硒以及金屬元素。

特點：N在各種蛋白質中的平均含量為16%，用定氮法可測定蛋白質含量：蛋白質含量(g)=蛋白質含氮量×6.25二、蛋白質的組成單位－pro的水解1、完全水解：用濃酸、堿將蛋白質完全水解為氨基酸。酸水解：無消旋作用，產物為L-氨基酸。堿水解：多數氨基酸被破壞，有消旋現象。2、部分水解：

一般用酶或稀酸在較溫和條件下，將蛋白質分子切斷，產物為分子大小不等的肽段和氨基酸。蛋白酶：(內切酶、內肽酶）胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶等。（一）氨基酸的命名和結構特點氨基酸（aminoacid,簡寫aa)：蛋白質的基本組成單位，是含氨基的羧酸。天然蛋白質由20種氨基酸組成。通常用通俗命名如甘氨酸、丙氨酸。構成蛋白質的氨基酸結構特點

（1）蛋白質水解得到的氨基酸都是a-氨基酸，氨基都連接在a碳原子上，可用通式表示，R成為氨基酸側鏈基團（2）不同氨基酸在于R不同，除了R為H的甘氨酸外，其他氨基酸a碳原子都有手性，具旋光異構存在D和L型，構成天然蛋白質的氨基酸均為L型。（二）氨基酸的分類蛋白質氨基酸：蛋白質中常見的20種氨基酸稀有的蛋白質氨基酸：蛋白質組成中，除上述20種常見氨基酸外，從少數蛋白質中還分離出一些稀有氨基酸，它們都是相應常見氨基酸的衍生物。如4-羥脯氨酸、5-羥賴氨酸等。非蛋白質氨基酸：生物體內呈游離或結合態(tài)的氨基酸。生物體內常見氨基酸的分類二十種常見蛋白質氨基酸的分類、結構及三字符號據營養(yǎng)學分類必需ＡＡ非必需ＡＡ據R基團化學結構分類脂肪族ＡA（中性、含羥基或巰基、酸性、堿性）芳香族ＡA(Phe、Tyr、Trp)雜環(huán)ＡＡ(His、Pro)據R基團極性分類極性R基團AA非極性R基團AA（８種）不帶電荷（７種）據氨基、羧基數分類一氨基一羧基ＡＡ一氨基二羧基ＡＡ(Glu、Asp)二氨基一羧基ＡＡ(Lys、His、Arg)

人的必需氨基酸Lys

Trp

Phe

Val

Met

Leu

Ile

Thr

Arg、His帶電荷：正電荷（３種）負電荷（２種）甘氨酸（Gly,G）丙氨酸（Ala,A）纈氨酸（Val,V）亮氨酸（Lue,L）異亮氨酸（Ile,I）中性脂肪族氨基酸含羥基或硫脂肪族氨基酸絲氨酸（Ser,S）蘇氨酸（Thr,T）半胱氨酸（Cys,C）甲硫氨酸（Met,M）酸性氨基酸及酰胺天冬氨酸（Asp,D）谷氨酸（Glu,E）天冬酰胺（Asn,N）谷氨酰胺（Gln,Q）堿性氨基酸

賴氨酸（Lys,K）精氨酸（Arg,R）組氨酸（His,H）雜環(huán)氨基酸雜環(huán)氨基酸

組氨酸（His,H）脯氨酸（Pro,P）芳香族氨基酸

苯丙氨酸（Phe,F）酪氨酸（Tyr,Y）色氨酸（Trg,W）（三）氨基酸的理化性質1、物理性質溶解度：水中溶解度差別較大，不溶于有機溶劑。

光吸收性：可見光區(qū)無，紫外光區(qū)Phe\Thy\Trp有光吸收。旋光性：AA的物理常數，與結構、PH值有關。味感：不同味道(與構型有關)。兩性解離和等電點：AA在結晶形態(tài)或在水溶液中，并不是以游離的羧基或氨基形式存在，而是離解成兩性離子。在兩性離子中，氨基是以質子化(-NH3+)形式存在，羧基是以離解狀態(tài)(-COO-)存在。2、化學性質●氨基的化學反應:◆與茚三酮(ninhydrin)的反應定量反應◆與亞硝酸的反應VanSlyke定氮◆與2,4-二硝基氟苯(FDNB)的反應測序◆與甲醛的反應氨基滴定◆與酰化基的反應氨基保護基◆與二甲基氨基萘磺酰氯(DNS-Cl)的反應測序◆與熒光胺的反應微量檢測■與Edman試劑(苯異硫氫酸)和測序有色Edman試劑的反應●羧基的化學反應▲Strecker降解:

弱氧化劑(次氯酸鈉,N-bromosuccin

imide)作用下生成NH3和醛(RCHO)▲特殊條件下,還原成氨基醇、氨基醛▲與肼(hydrazine)的反應C端氨基酸分析●側鏈的化學反應▲羥基:酯化(生物體內的磷酸化)▲巰基:氧化還原參考文獻：ChemistryandBiochemistryoftheaminoacids,G.C.Barrett,ChapmanandHall,1985（1）氨基和羧基共同參與的反應成肽反應肽鍵又稱酰胺鍵，是多肽及蛋白子分子的主要化學鍵。在蛋白質中AA通過肽鍵相連形成寡肽多肽，以AA殘基存在。茚三酮(無色)+（2）與茚三酮的反應：Pro產生黃色物質，其它為藍紫色。a-AA和水合茚三酮加熱生成有色物質，AA的定性或定量測定加熱（弱酸）NH3CO2RCHO+還原性茚三酮+2NH3+還原性茚三酮還原性茚三酮3H20紫色化合物第二節(jié)、蛋白質的分子結構構型：指在立體異構體中取代原子或基團在空間的取向。構象：指這些取代基團在單鍵旋轉時可能形成的不同的立體異構體。蛋白質的構象：指蛋白質特有的空間結構。蛋白質結構有不同的組織層次：1952年丹麥人Linderstrom-Lang最早提出蛋白質的結構可以分成四個層次:primarystructure

一級結構：氨基酸序列secondarystructure

二級結構：α螺旋,β折疊tertiarystructure

三級結構：所有原子空間位置

quanternarystructure

四級結構：蛋白質多聚體1969年正式將一級結構定義為氨基酸序列和雙硫鍵的位置。介于二級結構和三級結構之間還存在超二級結構（二級結構的組合）和結構域（在空間上相對獨立）這兩個層次。

一、一級結構蛋白質分子的基本化學結構（共價結構）一級結構專指氨基酸序列提問：什么是蛋白質的一級結構，維持蛋白質一級結構的作用力是什么鍵？肽鍵和二硫鍵1、蛋白質的二級結構(SecondaryStructure)多肽鏈骨架中原子的局部空間排列，不涉及側鏈的構象，也就是該肽段主鏈骨架原子的相對空間位置。維持二級結構的力量為：氫鍵二、蛋白質的空間結構肽鏈的骨干是由（－NH－CHR－CO－）單位規(guī)則地、重復排列而成，稱之為共價主鏈(1)α-螺旋結構（α-Helix）(2)β-折疊結構（β-sheet）(3)β-轉角（β-turn）(4)無規(guī)卷曲(randomcoil)多肽鏈的二級結構主要有以下幾種方式∶

α—螺旋有左右手之分（1）α-螺旋結構特點∶

1)主鏈繞中心軸按右手螺旋方向盤旋，側鏈伸向螺旋外側。每3.6個氨基酸殘基前進一圈，每圈前進距離是0.54nm(螺距），每個氨基酸殘基占0.15nm。

2)每個氨基酸殘基的亞氨基與它前面第四個氨基酸殘基的羰基氧原子形成氫鍵，氫鍵與螺旋軸近似平行。（2）、β-折疊結構(β-片層結構)∶（3）、β-轉角∶蛋白質分子的主鏈在盤曲折疊運行中，往往發(fā)生180度的急轉彎，這種回折部位的構象，即所謂的β-轉角。

β-轉角是由4個連續(xù)的氨基酸殘基組成的，第一個氨基酸殘基的羰基氧原子與第四個氨基酸殘基的亞氨基連接來穩(wěn)定構象。α螺旋β折疊片β轉角無規(guī)卷曲（4）、無規(guī)卷曲∶它是多肽主鏈不規(guī)則、多向性地隨機盤曲所形成的構象。球蛋白分子中常見的一種主鏈構象。(1)、球狀蛋白質分子的三級結構

球狀蛋白質分子的二級結構不是活性分子的結構形式，需要在二級結構的基礎上再盤曲折疊形成三級結構。蛋白質分子的三級結構是指蛋白質分子在一、二級結構的基礎上，借助于各種非共價鍵在三維空間盤曲、折疊成具有特定走向的緊密、近似球狀的構象。蛋白質分子的三級結構包括全部主鏈、側鏈在內的所有原子的空間排部，但不包括肽鏈間的相互關系球狀構象給出最低的表面積和體積比，因而使蛋白質與環(huán)境的相互作用降到最小，最穩(wěn)定。2、蛋白質的三級結構(Tertiarystructure)3.蛋白質的三級結構一條多肽鏈內二級結構單元的彼此組合后的固定結構作用力—來自側鏈基團

球狀蛋白質分子三級結構的構象特征∶

(1)三級結構的構象近似球形。

(2)分子中的親水基團大多相對集中在球形分子的表面，疏水基團相對集中在分子內部。

(3)三級結構構象的穩(wěn)定性主要靠疏水的相互作用來維系。

(4)三級結構形成后，蛋白質分子的生物活性中心就形成了。在球形分子的表面往往有一個很深的裂隙，活性部位就在其中。

三級結構的典型例子是∶肌紅蛋白肌紅蛋白的三級結構維系蛋白質空間結構的化學鍵氫鍵(hydrogenbond)離子鍵(鹽鍵)(electrostaticinteractions)疏水相互作用(hydrophobicinteraction)范德華力(vander

waalsforce)二硫鍵(disulfidebond)A.三級結構中的作用力包括二硫鍵、氫鍵、離子鍵、疏水作用力、范德華力氫鍵(側鏈間形成)疏水作用“非極性基團被極性水分子排擠相互聚攏”作用力。范德華力（分子間作用力，受彼此距離影響）離子鍵（或鹽鍵）二硫鍵肽鍵二硫鍵離子鍵

氫鍵疏水鍵

范德華力

90kcal/mol3kcal/mol1kcal/mol1kcal/mol0.1kcal/mol這四種鍵能遠小于共價鍵，稱次級鍵次級鍵微弱但卻是維持蛋白質三級結構中主要的作用力,原因何在?數量巨大！鍵能（2）、纖維蛋白分子的結構在纖維蛋白分子中螺旋肽鏈一般為平行排列含大量的α-螺旋，β-折疊片，整個分子呈纖維狀角蛋白、絲心蛋白、膠原蛋白的結構都是如此。廣泛分布于脊椎和無脊椎動物體內，起支架和保護作用。三條右手α-螺旋一個原纖維大原纖維纖維角蛋白3、球狀蛋白質分子的四級結構

有些球狀蛋白質分子是由兩個或兩個以上的、具有獨立三級結構的肽鏈單位締合而成的，這種蛋白質通常稱為寡聚蛋白或多體蛋白（multimericprotein）。寡聚蛋白分子中的每一個三級結構單位稱為一個亞基(或亞單位subunit、單體monomer)。

所謂蛋白質分子的四級結構是指∶

就是指寡聚蛋白分子中亞基與亞基之間的立體排布及相互作用關系。亞基的數目和類型也是四級結構研究的內容。四級結構的穩(wěn)定靠非共價鍵聯系：主要包括疏水作用（主要），其次還有離子鍵、氫鍵、范德華力來維系。血紅蛋白的四級結構三、多肽、蛋白質結構與功能的關系（一）、多肽的一級結構與功能

生物體中存在多種活性肽，如：生長激素、加壓素、催產素等。1、核糖核酸酶的可逆變性（二）、蛋白質的一級結構決定高級結構牛核糖核酸酶的一級結構二硫鍵天然狀態(tài)，有催化活性尿素、β-巰基乙醇去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性2、蛋白質前體的激活

無活性的前提稱為“原”，如酶原、胰島素原（切除冗余及其它變化）前體蛋白（一級結構冗余，高級結構錯誤，因此無生物活性）活性蛋白（具有正確的一級結構和高級結構，因此具有生物活性）適合環(huán)境鐮刀狀貧血?。貉褐写罅砍霈F鐮刀紅細胞，患者因此缺氧窒息正常細胞鐮刀形細胞它是最早認識的一種分子病。它是由于遺傳基因突變導致血紅蛋白分子結構的突變。3、分子病這種由蛋白質分子發(fā)生變異所導致的疾病，稱為“分子病”正常型

---Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys---β鏈谷氨酸鐮刀型

---Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys

---β鏈

纈氨酸

谷Aa（極性）

纈Aa（非極性）由于纈氨酸上的非極性基團與相鄰非極性基團間在疏水力作用下相互靠攏，并引發(fā)所在鏈扭曲為束狀，整個蛋白質由球狀變?yōu)殓牭缎危c氧結合功能喪失，導致病人窒息甚至死亡。（三）、蛋白質空間結構與功能的關系

1、血紅蛋白的變構效應與運輸氧的功能變構現象p72

外因通過改變蛋白質構象引起蛋白質功能變化的現象。血紅蛋白(R)relaxedstate(T)tensestate

血中氧分子的運送：Lung氧分子HemoglobinMyoglobinMuscle靜脈動脈環(huán)境氧高時Hb

快速吸收氧分子環(huán)境氧低時Hb

迅速釋放氧分子釋放氧分子后Hb

變回

Tstate任何一個亞基接受氧分子后，會增進其它亞基吸附氧分子的能力2、蛋白質變性一些物理或化學因素會破壞蛋白質空間結構，導致蛋白質生物活性喪失，同時引起某些物理性質和化學性質的變化，如溶解度降低、發(fā)生沉淀等現象稱為蛋白質變性。天然蛋白質和變性蛋白在一級結構上相同，生物活性喪失。變性蛋白質分子恢復其天然構象，稱為復性。變性因素：加熱/加壓/射線/強酸/強堿/有機溶劑等第三節(jié)、蛋白質的分類及性質一、分類1、按組成分：單純蛋白、結合蛋白單純蛋白只含氨基酸。結合蛋白除蛋白部分外還含有非蛋白成分（輔基）（共價鍵結合），如免疫球蛋白/細胞色素C等。2、按形狀分：纖維狀蛋白、球狀蛋白纖維蛋白：多結構蛋白難溶于水構成支架，如膠原蛋白。球狀蛋白：多溶于水，酶/轉運蛋白/激素/免疫球蛋白等。二、蛋白質的理化性質（一）蛋白質的兩性解離與等電點蛋白質中可解離酸性基團∶

Glu的γ-COOHAsp的β-COOHTyr的酚羥基

Cys的-SH堿性基團∶

Lys的ε-NH2His的咪唑基

Arg的δ-胍基蛋白質分子的總解離蛋白質的等電點∶蛋白質溶液在特定的pH下，其分子所帶的正、負電荷相等，凈電荷為零，這一pH稱為(用PI表示)。蛋白質純化方法∶等電點沉淀法蛋白質電泳離子交換法蛋白質兩性解離與等電點特性的應用靜電排斥力的缺乏蛋白質之間的聚集等電點沉淀幾種常見電泳等電聚焦紙電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳O’Farrell的雙向電泳銀染結果考馬斯亮染色為藍色（二）膠體性質蛋白質水溶液為親水膠體。不能通過半透膜；分子周圍有雙電子層和水化層，有利于穩(wěn)定pr膠體系統(tǒng)。超濾透析切向流過濾模式去除機制-表面孔徑攔截進料液濾出液回流液

膜

產品

產品污染物蛋白質的膜分離技術透析（三）沉淀反應機理：1）利用pr兩性電離性質。

2）許多化學試劑可減少pr與水的親和力鹽析、醇、酸、重金屬離子、生物堿等

1、概念∶蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性是有條件的、相對的，若改變環(huán)境條件，破壞其水化膜和表面電荷，蛋白質親水膠體便失去穩(wěn)定性，發(fā)生絮凝沉淀的現象，就稱為蛋白質的沉淀作用。

蛋白質的沉淀可分為∶不變性沉淀∶用于分離活性的天然蛋白質產品（酶、抗體等）。變性沉淀∶用于生物制品中除去蛋白質。2、沉淀的方法∶

(1)等電點沉淀法

(2)鹽溶與鹽析（分級鹽析）鹽溶∶在鹽濃度很低時，蛋白質的溶解度隨著鹽濃度的增加而增加，這種現象稱為蛋白質的鹽溶。

鹽析∶在蛋白質溶液中加入高濃度的中性鹽后，它與蛋白質膠體粒子競爭水份，使蛋白質膠體粒子表面的水化層破壞而失去穩(wěn)定性，同時降低了蛋白質與水的親和力而使蛋白質沉淀的現象。不同的蛋白質的帶電性質、分子量不同，水膜厚度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不同。

等電點沉淀的蛋白質溶液中加入NaCl后沉淀溶解—鹽溶（Salting-in）鹽溶蛋白質分子在等電點時，容易互相吸引，聚合沉淀；加入鹽離子會破壞這些靜電相互作用，使分子散開而溶于水鹽析向蛋白質溶液中加入大量硫酸銨后蛋白質會沉淀析出——鹽析（Saltingout）蛋白質分子表面的疏水區(qū)域，聚集了許多水分子，鹽濃度高