張忠版食品生物化學-第5章蛋白質(zhì)與核酸1

第一節(jié)、蛋白質(zhì)的基本組成單位第二節(jié)、蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)第三節(jié)、蛋白質(zhì)的分類及性質(zhì)第四節(jié)、核酸的化學組成第五節(jié)、核酸分子的結(jié)構(gòu)第六節(jié)、核酸的理化性質(zhì)和分離提純第五章蛋白質(zhì)與核酸蛋白質(zhì)是由天然氨基酸(Aminoacid)通過肽鍵(Peptidebond)連接而成的生物大分子。是一切生物體中普遍存在的生物大分子，是生物功能的主要載體。生物遺傳形狀（存在于信息大分子DNA中）是通過蛋白質(zhì)來表現(xiàn)的。酶、調(diào)節(jié)蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白、貯存蛋白等蛋白質(zhì)種類繁多、各具一定的相對分子量（一般在一萬到一百萬，甚至高達數(shù)百萬）、復雜的分子結(jié)構(gòu)和特定的生物功能。蛋白質(zhì)第一節(jié)、蛋白質(zhì)的基本組成單位一蛋白質(zhì)的元素組成：

C、H、O、N及少量的S和磷硒以及金屬元素。

特點：N在各種蛋白質(zhì)中的平均含量為16%，用定氮法可測定蛋白質(zhì)含量：蛋白質(zhì)含量(g)=蛋白質(zhì)含氮量×6.25二、蛋白質(zhì)的組成單位－pro的水解1、完全水解：用濃酸、堿將蛋白質(zhì)完全水解為氨基酸。酸水解：無消旋作用，產(chǎn)物為L-氨基酸。堿水解：多數(shù)氨基酸被破壞，有消旋現(xiàn)象。2、部分水解：

一般用酶或稀酸在較溫和條件下，將蛋白質(zhì)分子切斷，產(chǎn)物為分子大小不等的肽段和氨基酸。蛋白酶：(內(nèi)切酶、內(nèi)肽酶）胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶等。（一）氨基酸的命名和結(jié)構(gòu)特點氨基酸（aminoacid,簡寫aa)：蛋白質(zhì)的基本組成單位，是含氨基的羧酸。天然蛋白質(zhì)由20種氨基酸組成。通常用通俗命名如甘氨酸、丙氨酸。構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸結(jié)構(gòu)特點

（1）蛋白質(zhì)水解得到的氨基酸都是a-氨基酸，氨基都連接在a碳原子上，可用通式表示，R成為氨基酸側(cè)鏈基團（2）不同氨基酸在于R不同，除了R為H的甘氨酸外，其他氨基酸a碳原子都有手性，具旋光異構(gòu)存在D和L型，構(gòu)成天然蛋白質(zhì)的氨基酸均為L型。（二）氨基酸的分類蛋白質(zhì)氨基酸：蛋白質(zhì)中常見的20種氨基酸稀有的蛋白質(zhì)氨基酸：蛋白質(zhì)組成中，除上述20種常見氨基酸外，從少數(shù)蛋白質(zhì)中還分離出一些稀有氨基酸，它們都是相應常見氨基酸的衍生物。如4-羥脯氨酸、5-羥賴氨酸等。非蛋白質(zhì)氨基酸：生物體內(nèi)呈游離或結(jié)合態(tài)的氨基酸。生物體內(nèi)常見氨基酸的分類二十種常見蛋白質(zhì)氨基酸的分類、結(jié)構(gòu)及三字符號據(jù)營養(yǎng)學分類必需ＡＡ非必需ＡＡ據(jù)R基團化學結(jié)構(gòu)分類脂肪族ＡA（中性、含羥基或巰基、酸性、堿性）芳香族ＡA(Phe、Tyr、Trp)雜環(huán)ＡＡ(His、Pro)據(jù)R基團極性分類極性R基團AA非極性R基團AA（８種）不帶電荷（７種）據(jù)氨基、羧基數(shù)分類一氨基一羧基ＡＡ一氨基二羧基ＡＡ(Glu、Asp)二氨基一羧基ＡＡ(Lys、His、Arg)

人的必需氨基酸Lys

Trp

Phe

Val

Met

Leu

Ile

Thr

Arg、His帶電荷：正電荷（３種）負電荷（２種）甘氨酸（Gly,G）丙氨酸（Ala,A）纈氨酸（Val,V）亮氨酸（Lue,L）異亮氨酸（Ile,I）中性脂肪族氨基酸含羥基或硫脂肪族氨基酸絲氨酸（Ser,S）蘇氨酸（Thr,T）半胱氨酸（Cys,C）甲硫氨酸（Met,M）酸性氨基酸及酰胺天冬氨酸（Asp,D）谷氨酸（Glu,E）天冬酰胺（Asn,N）谷氨酰胺（Gln,Q）堿性氨基酸

賴氨酸（Lys,K）精氨酸（Arg,R）組氨酸（His,H）雜環(huán)氨基酸雜環(huán)氨基酸

組氨酸（His,H）脯氨酸（Pro,P）芳香族氨基酸

苯丙氨酸（Phe,F）酪氨酸（Tyr,Y）色氨酸（Trg,W）（三）氨基酸的理化性質(zhì)1、物理性質(zhì)溶解度：水中溶解度差別較大，不溶于有機溶劑。

光吸收性：可見光區(qū)無，紫外光區(qū)Phe\Thy\Trp有光吸收。旋光性：AA的物理常數(shù)，與結(jié)構(gòu)、PH值有關(guān)。味感：不同味道(與構(gòu)型有關(guān))。兩性解離和等電點：AA在結(jié)晶形態(tài)或在水溶液中，并不是以游離的羧基或氨基形式存在，而是離解成兩性離子。在兩性離子中，氨基是以質(zhì)子化(-NH3+)形式存在，羧基是以離解狀態(tài)(-COO-)存在。2、化學性質(zhì)●氨基的化學反應:◆與茚三酮(ninhydrin)的反應定量反應◆與亞硝酸的反應VanSlyke定氮◆與2,4-二硝基氟苯(FDNB)的反應測序◆與甲醛的反應氨基滴定◆與?；姆磻被Ｗo基◆與二甲基氨基萘磺酰氯(DNS-Cl)的反應測序◆與熒光胺的反應微量檢測■與Edman試劑(苯異硫氫酸)和測序有色Edman試劑的反應●羧基的化學反應▲Strecker降解:

弱氧化劑(次氯酸鈉,N-bromosuccin

imide)作用下生成NH3和醛(RCHO)▲特殊條件下,還原成氨基醇、氨基醛▲與肼(hydrazine)的反應C端氨基酸分析●側(cè)鏈的化學反應▲羥基:酯化(生物體內(nèi)的磷酸化)▲巰基:氧化還原參考文獻：ChemistryandBiochemistryoftheaminoacids,G.C.Barrett,ChapmanandHall,1985（1）氨基和羧基共同參與的反應成肽反應肽鍵又稱酰胺鍵，是多肽及蛋白子分子的主要化學鍵。在蛋白質(zhì)中AA通過肽鍵相連形成寡肽多肽，以AA殘基存在。茚三酮(無色)+（2）與茚三酮的反應：Pro產(chǎn)生黃色物質(zhì)，其它為藍紫色。a-AA和水合茚三酮加熱生成有色物質(zhì)，AA的定性或定量測定加熱（弱酸）NH3CO2RCHO+還原性茚三酮+2NH3+還原性茚三酮還原性茚三酮3H20紫色化合物第二節(jié)、蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)構(gòu)型：指在立體異構(gòu)體中取代原子或基團在空間的取向。構(gòu)象：指這些取代基團在單鍵旋轉(zhuǎn)時可能形成的不同的立體異構(gòu)體。蛋白質(zhì)的構(gòu)象：指蛋白質(zhì)特有的空間結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有不同的組織層次：1952年丹麥人Linderstrom-Lang最早提出蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可以分成四個層次:primarystructure

一級結(jié)構(gòu)：氨基酸序列secondarystructure

二級結(jié)構(gòu)：α螺旋,β折疊tertiarystructure

三級結(jié)構(gòu)：所有原子空間位置

quanternarystructure

四級結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)多聚體1969年正式將一級結(jié)構(gòu)定義為氨基酸序列和雙硫鍵的位置。介于二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)之間還存在超二級結(jié)構(gòu)（二級結(jié)構(gòu)的組合）和結(jié)構(gòu)域（在空間上相對獨立）這兩個層次。

一、一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子的基本化學結(jié)構(gòu)（共價結(jié)構(gòu)）一級結(jié)構(gòu)專指氨基酸序列提問：什么是蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，維持蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的作用力是什么鍵？肽鍵和二硫鍵1、蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)(SecondaryStructure)多肽鏈骨架中原子的局部空間排列，不涉及側(cè)鏈的構(gòu)象，也就是該肽段主鏈骨架原子的相對空間位置。維持二級結(jié)構(gòu)的力量為：氫鍵二、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)肽鏈的骨干是由（－NH－CHR－CO－）單位規(guī)則地、重復排列而成，稱之為共價主鏈(1)α-螺旋結(jié)構(gòu)（α-Helix）(2)β-折疊結(jié)構(gòu)（β-sheet）(3)β-轉(zhuǎn)角（β-turn）(4)無規(guī)卷曲(randomcoil)多肽鏈的二級結(jié)構(gòu)主要有以下幾種方式∶

α—螺旋有左右手之分（1）α-螺旋結(jié)構(gòu)特點∶

1)主鏈繞中心軸按右手螺旋方向盤旋，側(cè)鏈伸向螺旋外側(cè)。每3.6個氨基酸殘基前進一圈，每圈前進距離是0.54nm(螺距），每個氨基酸殘基占0.15nm。

2)每個氨基酸殘基的亞氨基與它前面第四個氨基酸殘基的羰基氧原子形成氫鍵，氫鍵與螺旋軸近似平行。（2）、β-折疊結(jié)構(gòu)(β-片層結(jié)構(gòu))∶（3）、β-轉(zhuǎn)角∶蛋白質(zhì)分子的主鏈在盤曲折疊運行中，往往發(fā)生180度的急轉(zhuǎn)彎，這種回折部位的構(gòu)象，即所謂的β-轉(zhuǎn)角。

β-轉(zhuǎn)角是由4個連續(xù)的氨基酸殘基組成的，第一個氨基酸殘基的羰基氧原子與第四個氨基酸殘基的亞氨基連接來穩(wěn)定構(gòu)象。α螺旋β折疊片β轉(zhuǎn)角無規(guī)卷曲（4）、無規(guī)卷曲∶它是多肽主鏈不規(guī)則、多向性地隨機盤曲所形成的構(gòu)象。球蛋白分子中常見的一種主鏈構(gòu)象。(1)、球狀蛋白質(zhì)分子的三級結(jié)構(gòu)

球狀蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)不是活性分子的結(jié)構(gòu)形式，需要在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上再盤曲折疊形成三級結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)分子的三級結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)分子在一、二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，借助于各種非共價鍵在三維空間盤曲、折疊成具有特定走向的緊密、近似球狀的構(gòu)象。蛋白質(zhì)分子的三級結(jié)構(gòu)包括全部主鏈、側(cè)鏈在內(nèi)的所有原子的空間排部，但不包括肽鏈間的相互關(guān)系球狀構(gòu)象給出最低的表面積和體積比，因而使蛋白質(zhì)與環(huán)境的相互作用降到最小，最穩(wěn)定。2、蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)(Tertiarystructure)3.蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)一條多肽鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)單元的彼此組合后的固定結(jié)構(gòu)作用力—來自側(cè)鏈基團

球狀蛋白質(zhì)分子三級結(jié)構(gòu)的構(gòu)象特征∶

(1)三級結(jié)構(gòu)的構(gòu)象近似球形。

(2)分子中的親水基團大多相對集中在球形分子的表面，疏水基團相對集中在分子內(nèi)部。

(3)三級結(jié)構(gòu)構(gòu)象的穩(wěn)定性主要靠疏水的相互作用來維系。

(4)三級結(jié)構(gòu)形成后，蛋白質(zhì)分子的生物活性中心就形成了。在球形分子的表面往往有一個很深的裂隙，活性部位就在其中。

三級結(jié)構(gòu)的典型例子是∶肌紅蛋白肌紅蛋白的三級結(jié)構(gòu)維系蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的化學鍵氫鍵(hydrogenbond)離子鍵(鹽鍵)(electrostaticinteractions)疏水相互作用(hydrophobicinteraction)范德華力(vander

waalsforce)二硫鍵(disulfidebond)A.三級結(jié)構(gòu)中的作用力包括二硫鍵、氫鍵、離子鍵、疏水作用力、范德華力氫鍵(側(cè)鏈間形成)疏水作用“非極性基團被極性水分子排擠相互聚攏”作用力。范德華力（分子間作用力，受彼此距離影響）離子鍵（或鹽鍵）二硫鍵肽鍵二硫鍵離子鍵

氫鍵疏水鍵

范德華力

90kcal/mol3kcal/mol1kcal/mol1kcal/mol0.1kcal/mol這四種鍵能遠小于共價鍵，稱次級鍵次級鍵微弱但卻是維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)中主要的作用力,原因何在?數(shù)量巨大！鍵能（2）、纖維蛋白分子的結(jié)構(gòu)在纖維蛋白分子中螺旋肽鏈一般為平行排列含大量的α-螺旋，β-折疊片，整個分子呈纖維狀角蛋白、絲心蛋白、膠原蛋白的結(jié)構(gòu)都是如此。廣泛分布于脊椎和無脊椎動物體內(nèi)，起支架和保護作用。三條右手α-螺旋一個原纖維大原纖維纖維角蛋白3、球狀蛋白質(zhì)分子的四級結(jié)構(gòu)

有些球狀蛋白質(zhì)分子是由兩個或兩個以上的、具有獨立三級結(jié)構(gòu)的肽鏈單位締合而成的，這種蛋白質(zhì)通常稱為寡聚蛋白或多體蛋白（multimericprotein）。寡聚蛋白分子中的每一個三級結(jié)構(gòu)單位稱為一個亞基(或亞單位subunit、單體monomer)。

所謂蛋白質(zhì)分子的四級結(jié)構(gòu)是指∶

就是指寡聚蛋白分子中亞基與亞基之間的立體排布及相互作用關(guān)系。亞基的數(shù)目和類型也是四級結(jié)構(gòu)研究的內(nèi)容。四級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定靠非共價鍵聯(lián)系：主要包括疏水作用（主要），其次還有離子鍵、氫鍵、范德華力來維系。血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)三、多肽、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（一）、多肽的一級結(jié)構(gòu)與功能

生物體中存在多種活性肽，如：生長激素、加壓素、催產(chǎn)素等。1、核糖核酸酶的可逆變性（二）、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)牛核糖核酸酶的一級結(jié)構(gòu)二硫鍵天然狀態(tài)，有催化活性尿素、β-巰基乙醇去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性2、蛋白質(zhì)前體的激活

無活性的前提稱為“原”，如酶原、胰島素原（切除冗余及其它變化）前體蛋白（一級結(jié)構(gòu)冗余，高級結(jié)構(gòu)錯誤，因此無生物活性）活性蛋白（具有正確的一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)，因此具有生物活性）適合環(huán)境鐮刀狀貧血?。貉褐写罅砍霈F(xiàn)鐮刀紅細胞，患者因此缺氧窒息正常細胞鐮刀形細胞它是最早認識的一種分子病。它是由于遺傳基因突變導致血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)的突變。3、分子病這種由蛋白質(zhì)分子發(fā)生變異所導致的疾病，稱為“分子病”正常型

---Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys---β鏈谷氨酸鐮刀型

---Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys

---β鏈

纈氨酸

谷Aa（極性）

纈Aa（非極性）由于纈氨酸上的非極性基團與相鄰非極性基團間在疏水力作用下相互靠攏，并引發(fā)所在鏈扭曲為束狀，整個蛋白質(zhì)由球狀變?yōu)殓牭缎?，與氧結(jié)合功能喪失，導致病人窒息甚至死亡。（三）、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

1、血紅蛋白的變構(gòu)效應與運輸氧的功能變構(gòu)現(xiàn)象p72

外因通過改變蛋白質(zhì)構(gòu)象引起蛋白質(zhì)功能變化的現(xiàn)象。血紅蛋白(R)relaxedstate(T)tensestate

血中氧分子的運送：Lung氧分子HemoglobinMyoglobinMuscle靜脈動脈環(huán)境氧高時Hb

快速吸收氧分子環(huán)境氧低時Hb

迅速釋放氧分子釋放氧分子后Hb

變回

Tstate任何一個亞基接受氧分子后，會增進其它亞基吸附氧分子的能力2、蛋白質(zhì)變性一些物理或化學因素會破壞蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，導致蛋白質(zhì)生物活性喪失，同時引起某些物理性質(zhì)和化學性質(zhì)的變化，如溶解度降低、發(fā)生沉淀等現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)變性。天然蛋白質(zhì)和變性蛋白在一級結(jié)構(gòu)上相同，生物活性喪失。變性蛋白質(zhì)分子恢復其天然構(gòu)象，稱為復性。變性因素：加熱/加壓/射線/強酸/強堿/有機溶劑等第三節(jié)、蛋白質(zhì)的分類及性質(zhì)一、分類1、按組成分：單純蛋白、結(jié)合蛋白單純蛋白只含氨基酸。結(jié)合蛋白除蛋白部分外還含有非蛋白成分（輔基）（共價鍵結(jié)合），如免疫球蛋白/細胞色素C等。2、按形狀分：纖維狀蛋白、球狀蛋白纖維蛋白：多結(jié)構(gòu)蛋白難溶于水構(gòu)成支架，如膠原蛋白。球狀蛋白：多溶于水，酶/轉(zhuǎn)運蛋白/激素/免疫球蛋白等。二、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)（一）蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點蛋白質(zhì)中可解離酸性基團∶

Glu的γ-COOHAsp的β-COOHTyr的酚羥基

Cys的-SH堿性基團∶

Lys的ε-NH2His的咪唑基

Arg的δ-胍基蛋白質(zhì)分子的總解離蛋白質(zhì)的等電點∶蛋白質(zhì)溶液在特定的pH下，其分子所帶的正、負電荷相等，凈電荷為零，這一pH稱為(用PI表示)。蛋白質(zhì)純化方法∶等電點沉淀法蛋白質(zhì)電泳離子交換法蛋白質(zhì)兩性解離與等電點特性的應用靜電排斥力的缺乏蛋白質(zhì)之間的聚集等電點沉淀幾種常見電泳等電聚焦紙電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳O’Farrell的雙向電泳銀染結(jié)果考馬斯亮染色為藍色（二）膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)水溶液為親水膠體。不能通過半透膜；分子周圍有雙電子層和水化層，有利于穩(wěn)定pr膠體系統(tǒng)。超濾透析切向流過濾模式去除機制-表面孔徑攔截進料液濾出液回流液

膜

產(chǎn)品

產(chǎn)品污染物蛋白質(zhì)的膜分離技術(shù)透析（三）沉淀反應機理：1）利用pr兩性電離性質(zhì)。

2）許多化學試劑可減少pr與水的親和力鹽析、醇、酸、重金屬離子、生物堿等

1、概念∶蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性是有條件的、相對的，若改變環(huán)境條件，破壞其水化膜和表面電荷，蛋白質(zhì)親水膠體便失去穩(wěn)定性，發(fā)生絮凝沉淀的現(xiàn)象，就稱為蛋白質(zhì)的沉淀作用。

蛋白質(zhì)的沉淀可分為∶不變性沉淀∶用于分離活性的天然蛋白質(zhì)產(chǎn)品（酶、抗體等）。變性沉淀∶用于生物制品中除去蛋白質(zhì)。2、沉淀的方法∶

(1)等電點沉淀法

(2)鹽溶與鹽析（分級鹽析）鹽溶∶在鹽濃度很低時，蛋白質(zhì)的溶解度隨著鹽濃度的增加而增加，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的鹽溶。

鹽析∶在蛋白質(zhì)溶液中加入高濃度的中性鹽后，它與蛋白質(zhì)膠體粒子競爭水份，使蛋白質(zhì)膠體粒子表面的水化層破壞而失去穩(wěn)定性，同時降低了蛋白質(zhì)與水的親和力而使蛋白質(zhì)沉淀的現(xiàn)象。不同的蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、分子量不同，水膜厚度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不同。

等電點沉淀的蛋白質(zhì)溶液中加入NaCl后沉淀溶解—鹽溶（Salting-in）鹽溶蛋白質(zhì)分子在等電點時，容易互相吸引，聚合沉淀；加入鹽離子會破壞這些靜電相互作用，使分子散開而溶于水鹽析向蛋白質(zhì)溶液中加入大量硫酸銨后蛋白質(zhì)會沉淀析出——鹽析（Saltingout）蛋白質(zhì)分子表面的疏水區(qū)域，聚集了許多水分子，鹽濃度高