酶工程課件-CH5-2 固定化酶的性質(zhì)

CH5-2固定化酶的性質(zhì)

1.固定化處理對酶性質(zhì)的影響

從溶液酶的游離狀態(tài)，到固定化酶的“局限”狀態(tài)，是一個(gè)很大的轉(zhuǎn)變。不僅酶分子本身，而且酶反應(yīng)的環(huán)境也有所不同。因而，固定化酶的性質(zhì)與溶液酶大相徑庭固定化酶的制備方法很多，酶在固定化過程中，對酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生的影響各不相同。我們假定酶固定化之后，在載體表面或多孔介質(zhì)內(nèi)的分布完全均勻，我們不考慮固定化處理過程中，技術(shù)操作的問題，我們可以將固定化帶來影響概括為如下三個(gè)方面：⑴構(gòu)象改變、立體屏蔽酶在固定化過程中，由于酶和載體之間相互作用，引起酶分子構(gòu)象發(fā)生某種扭曲，從而導(dǎo)致酶與底物的結(jié)合能力或催化底物轉(zhuǎn)化能力發(fā)生改變，在大多數(shù)情況下，固定化致使酶活性不同程度下降。而立體屏蔽是指固定化后，由于載體孔隙太小，或固定化的結(jié)合方式不對(如圖所示)使酶活性中心或調(diào)節(jié)部位造成某種空間障礙，使效應(yīng)物或底物與酶的鄰近或接觸受到限制。圖固定化酶的立體屏障效應(yīng)活性中心向里活性中心向外⑵分配效應(yīng)和擴(kuò)散限制這兩種效應(yīng)都和微環(huán)境密切相關(guān)。所謂微環(huán)境是指緊鄰固定化酶的環(huán)境區(qū)域，主要是載體的疏水親水及電荷性質(zhì)帶來的影響。分配效應(yīng)是由于載體性質(zhì)造成的酶的底物或其他效應(yīng)物在微觀環(huán)境和宏觀體系之間的不等性分配，從而影響酶促反應(yīng)速度的一種效應(yīng)。擴(kuò)散限制效應(yīng)是指底物、產(chǎn)物和其它效應(yīng)物在環(huán)境中的遷移運(yùn)轉(zhuǎn)速度受到的限制作用。有外擴(kuò)散限制和內(nèi)擴(kuò)散限制兩種類型。前者是指物質(zhì)從宏觀體系穿過包圍在固定化酶顆粒周圍近乎停滯的液膜層(又稱Nernsl層)達(dá)到顆粒表面時(shí)所受到的限制。內(nèi)擴(kuò)散限制是指上述物質(zhì)進(jìn)一步向顆粒內(nèi)部酶所在點(diǎn)擴(kuò)散所受到的限制。⑶微擾由于載體的親水、疏水作用和介質(zhì)的介電常數(shù)等性質(zhì)，直接影響酶的催化能力或酶對效應(yīng)物作出反應(yīng)的能力，這種效應(yīng)稱為微擾。目前還不能作定量描述。實(shí)際上構(gòu)象改變，立體屏蔽效應(yīng)，也還不能作定量描述。近年來，關(guān)于蛋白質(zhì)“可及表面”計(jì)算方法的進(jìn)展，似為這幾種效應(yīng)的定量討論，展示了一種前景。以上效應(yīng)將具體表現(xiàn)在酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、酶的穩(wěn)定性、酶促反應(yīng)影響因素、乃至酶的底物專一性等方面。CH5-2固定化酶的性質(zhì)

2.固定化的酶性質(zhì)⑴分配效應(yīng)對Km的影響這種影響通常用分配系數(shù)(ρ)來描述：ρ＝[Si]／[S](1)式中[Si]和[S]分別表示底物或其它效應(yīng)物在微環(huán)境中的局部濃度和宏觀體系中的總體(或平均)濃度。對最簡單的固定化酶系統(tǒng)而言，其動(dòng)力學(xué)性態(tài)，一般仍服從米氏方程。當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行充分?jǐn)嚢?，消除外擴(kuò)散限制影響時(shí)，只考慮分配效應(yīng)的影響，則反應(yīng)速度可表示如下：

Vmax[Si]v=(2)Km+[Si]

Vmax[S]ρ=(3)Km+[S]ρ

Vmax[S]Vmax[S]==(4)Km/ρ+[S]K’m+[S]

[K’m=Km/ρ](5)這表明分配系數(shù)的影響，是改變了Km。K’m是分配效應(yīng)影響下的表觀米氏常數(shù)。由式(1)和(5)，可以看出[Si]＜[S]，則ρ＜1，K’m＞Km，表明固定化作用降低酶對底物的親和力。通過載體和底物電荷性質(zhì)、離子強(qiáng)度和pH值對分配效應(yīng)的影響討論，可以得出一般性規(guī)律如下：①載體與底物帶相同電荷時(shí)，相斥，[Si]＜[S]，K’m＞Km。②當(dāng)載體帶正電荷時(shí)，局部H+濃度低于總體濃度，[Si]變大，K’變小，即酶活力一pH曲線向酸性方向偏移，亦即最適pH向酸性方向偏移；反之，離子載體將向堿性方向偏移，如圖所示。1.載體帶正電荷，最適pH向偏酸性偏移；2.游離酶的最適pH3.載體帶負(fù)電荷，最適pH向偏堿方向偏移；

V

③上述效應(yīng)，通過提高反應(yīng)系統(tǒng)的離子強(qiáng)度，可以減弱或消除。當(dāng)離子強(qiáng)度等于載體電荷基團(tuán)濃度一半時(shí)，K’m＝Km／2，當(dāng)離子強(qiáng)度遠(yuǎn)大于載體電荷基團(tuán)濃度時(shí)，K’m＝Km。④采用疏水性載體時(shí)，如底物為極性物質(zhì)或電荷性物質(zhì)，則[Si]小，K’m＞Km；如底物為疏水性物

CH5-2固定化酶的性質(zhì)

2.固定化的酶性質(zhì)⑵擴(kuò)散限制效應(yīng)酶固定化之后，由于擴(kuò)散限制，使得酶往往不能得到宏觀體系相同水平的底物，因而觀測到的實(shí)效反應(yīng)速度，常低于理論預(yù)測的水平。對于這種影響，通常引用實(shí)效系數(shù)ηO進(jìn)行定量討論。

v=ηOvp

ηO=v/vp（1）

式中v為實(shí)效反應(yīng)速度，vp為理論預(yù)期反應(yīng)速度，即由溶液酶的米—孟氏方程確定的速度。

Vmax[S]

Vmax[S]

由v=＝ηO

（2）Km+[S]

Km+[S]

如前所述，擴(kuò)散包括外擴(kuò)散和內(nèi)擴(kuò)散兩方面。外擴(kuò)散實(shí)際上包括分子擴(kuò)散和對流擴(kuò)散兩部分。在固定化酶反應(yīng)操作中，可以通過攪拌混和而消除或削弱其限制作用。動(dòng)力學(xué)分析指出，外擴(kuò)散限制效應(yīng)影響下，酶反應(yīng)實(shí)效速度一般低于酶促轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)規(guī)定的速度。因此，這種擴(kuò)散限制可以看作是一種抑制效應(yīng)，可稱為擴(kuò)散抑制。

內(nèi)擴(kuò)散限制對酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響，在某種程度上比外擴(kuò)散限制更突出，更重要。動(dòng)力學(xué)理論分析所得出的一些主要結(jié)論有以下三點(diǎn)，可以用定性的語言來描述。①底物和其它效應(yīng)物分子量對擴(kuò)散速率的影響分析表明，一般情況下，固定化酶作用于高分子量底物比低分子量底物的實(shí)效反應(yīng)速度下降程度比溶液酶更大。許多實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此理論分析是一致的。②載體結(jié)構(gòu)的影響分析表明，內(nèi)擴(kuò)散限制取決于載體的孔隙率、孔隙半徑、孔隙曲折程度。即：底物的內(nèi)擴(kuò)散系數(shù)與載體孔隙率成正比，與底物在宏觀體系中固有的擴(kuò)散系數(shù)成正比，與載體孔隙的曲折系數(shù)成反比，與載體膜厚度或載體顆粒半徑的平方成反比。實(shí)驗(yàn)支持了這一理論分析。③內(nèi)擴(kuò)散限制與酶反應(yīng)固有速度有關(guān)。即是說固有反應(yīng)速度vp大，酶反應(yīng)的底物轉(zhuǎn)移系數(shù)也大，當(dāng)[S]小于0.1Km時(shí)，ηO大，則固定化酶反應(yīng)速度也相對大。CH5-2固定化酶的性質(zhì)

3.固定化的酶催化條件⑴酶活力回收率

游離酶經(jīng)過固定化以后，酶活力往往下降。固定化酶所保留下來的酶活力與游離酶在固定化之前的酶活力之比，稱為該酶活力回收率，也叫固定化效率、殘存活力等。在不考慮擴(kuò)散限制影響的情況下，固定化酶的酶活力回收率可以通過實(shí)驗(yàn)測得由下式求得：

V’m.BimFim

％＝×100%Vm.B式中Fim為活力回收率(％)，B為固定化前所用的游離酶溶液體積；Bim為制得的固定化酶濕體積；Vm

為固定化前的酶的最大反應(yīng)速度；V’m

固定化酶測得的表觀最大反應(yīng)速度。關(guān)于固定化酶收率問題，有不同得報(bào)道，上述方法考慮了在固定化處理過程中，有未被固定化的酶蛋白、在固定化過程中失活的酶蛋白以及在固定化后Kcat的變化（降低或升高）；而另一種方法是：

V’m.BimFim

％＝×100%Vm

.（B－B’）

式中符號與上式相同，B’為固定化處理后，回收的未固定的酶蛋白的量。實(shí)際上這種方法，只考慮了在固定化處理過程中，固定化方法對酶蛋白構(gòu)型、活性中心等的影響，把未被固定化的酶蛋白作為回收考慮。

固定化酶的話力回收率因所采用的固定化方法而異。一般來說，F(xiàn)im

值按下列固定化方法順序遞減：吸附法＞凝膠包埋法＞微型膠囊包埋法＞交聯(lián)法例如，李增吉等(1993年)報(bào)道，用DEAE—纖維素直接吸附天冬氨酸酶，酶活力回收達(dá)90％；以聚乙烯基吡啶與聚甲基丙烯酸復(fù)合物包埋同一酶，當(dāng)加酶量為每1克復(fù)合物8.40mg和16.8mg時(shí)，酶活力回收分別可達(dá)87％和94％。姜涌明等(1993年)用殼聚糖作載體，戊二醛作交聯(lián)劑，分別對木瓜蛋白酶、AS1.398中性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶進(jìn)行固定化，在最佳條件下，固定化酶的活力回收率分別為47％、74％、50％和55％。⑵底物專一性變化對于作用于大分子底物的酶，當(dāng)其固定于水不溶性載體之后，往往由于空間障礙，而使酶對分子量大的底物的催化活性大大下降。例如，糖化酶用CM一纖維素經(jīng)化學(xué)法共價(jià)固定化后，對分子量為8000的直鏈淀粉的催化活性下降23％，而對分子量為500000的直鏈淀粉的催化活性下降85％一87％。⑶反應(yīng)的最適pH值變化許多實(shí)驗(yàn)證明，酶固定化后的反應(yīng)最適pH值會發(fā)生不同程度的變化。例如，天冬氨酸酶固定于疏水載體N—烷基瓊脂糖珠之后，酶的最適反應(yīng)pH與液酶相比，向堿性區(qū)移動(dòng)了0．4個(gè)pH單位，（為pH8．9馬林等，1991)。胰蛋白酶用戊二醛固定于脫乙酰殼聚糖載體后，最適pH范圍加寬，由液相酶的pH8.0變?yōu)閜H7.0—9.0(隋德新等，1991)。另外也有實(shí)驗(yàn)證明固定化酶最適pH移向酸側(cè)的。

⑷反應(yīng)最適溫度的變化固定化酶的最適反應(yīng)溫度，在很多情況下是高于游離酶的。同上實(shí)驗(yàn)的固定化天冬氨酸酶最適反應(yīng)溫度提高了5℃，為50℃；胰蛋白酶也提高了5℃，為60℃，而且即使在70℃仍有較高的活性。用CM—纖維素疊氮衍生物固定化的胰蛋白酶和糜蛋白酶的最適溫度則比游離酶高5～15℃。也有固定化酶的最適溫度不變的，例如殼聚糖固定化胃蛋白酶。CH5-2固定化酶的性質(zhì)

3.固定化的酶催化條件

⑸米氏常數(shù)變化酶被固定化后，米氏常數(shù)的變化前已推導(dǎo)，下表所列固定化酶的K’m值與游離酶的Km值之比值：酶載體固定化方法底物K’m/Km無花果酶肌酸激酶天冬酰胺酶木瓜蛋白酶

CM-纖維素CM-纖維素尼龍火棉膠

肽鍵結(jié)合法肽鍵結(jié)合法微囊吸附

苯甲酰精氨酸乙酯ATP、肌酸Asn苯甲酰精氨

0.9101021.8一般來說，酶在固定化以后，一般都表現(xiàn)為Km值增大，即K’m/Km大于l。

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3.固定化的酶催化條件

⑹最大反應(yīng)速度的變化固定化酶的最大反應(yīng)速度(V’m)與游離酶的Vm值大多基本相同，事實(shí)上，對于最大反應(yīng)速度的比較是很難進(jìn)行的，因?yàn)閂m與反應(yīng)體系中的加酶量有關(guān)，單純Vm的比較，也難以說明什么問題，最客觀的比較參數(shù)應(yīng)該是Kcat但到目前筆者尚未收到有關(guān)研究資料報(bào)道。CH5-2固定化酶的性質(zhì)

4.固定化酶的穩(wěn)定性

⑴固定化酶的熱穩(wěn)定性大多數(shù)酶經(jīng)固定化以后，熱穩(wěn)定性提高。例如，乳酸脫氫酶、脲酶、氨基?；浮⒁鹊鞍酌傅?，固定化后，熱穩(wěn)定性都比游離酶高；也有固定化之后耐熱性反而下降的例子。DEAE—纖維素離子交換吸附的轉(zhuǎn)化酶，40℃加熱30分鐘，其剩余活力為4％，而游離酶，在相同條件下其活力為100％。

⑵固定化酶對化學(xué)試劑的穩(wěn)定性大多數(shù)情況下，酶固定化之后，增強(qiáng)了對化學(xué)試劑的耐受力。例如氨基?；?，用DEAE—葡聚糖交換吸附法制成固定化酶后，在6mol．L—l尿素、2mol．L—l中，保存活力分別為146％和117％；而游離酶在相應(yīng)條件下，保存活力僅9％和49％。CMC偶聯(lián)的胰蛋白酶，在3mol．L—l

脲中的保存活力為120％，游離酶只60％。尿素、鹽酸脲這樣的蛋白質(zhì)變性劑，不僅沒有損失固定化酶的活性，反而提高酶活性的現(xiàn)象，據(jù)認(rèn)為可能與酶的柔順性增加有關(guān)。個(gè)別酶如葡萄糖淀粉酶，固定化以后，對某些抑制劑更為敏感。

⑶固定化酶對蛋白酶的穩(wěn)定性一般來說，酶固定化以后，增強(qiáng)了對蛋白酶的抵抗力。例如用尼龍或聚服膜包埋，或用聚丙烯酰胺包埋的天冬酰胺酶，對蛋白酶極為穩(wěn)定，而游離酶在同樣條件下，幾乎全部失活。據(jù)認(rèn)為，這可能與固定化酶的載體不允許大分子酶蛋白透過有關(guān)。

⑷固定化酶的操作穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性大多數(shù)酶固定化以后，操作穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性都明顯提高。這對工業(yè)生產(chǎn)是很重要的有利性質(zhì)。例如三酯酸纖維素包埋的轉(zhuǎn)化酶，在25℃操作530日，活力僅喪失一半。重氮化結(jié)合于多孔玻璃的葡萄糖異構(gòu)酶，60℃下的半壽期為14天。一般說來，操作穩(wěn)定性要有一個(gè)月以上的半壽期，才有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。貯藏穩(wěn)定性下降的例子也存在。游離核酸酶4℃下保存一周，活力不減；而共價(jià)固定化酶(載體苯乙烯馬來酐)則喪失50％的活力。CH5-2固定化酶的性質(zhì)

5.固定化酶穩(wěn)定性的途徑探討固定化過程增強(qiáng)酶穩(wěn)定性的機(jī)制，從中尋求提高固定化酶穩(wěn)定性途徑，是值得重視的課題，不少研究者已在這方面作了有益探索。初步歸納有以下幾點(diǎn)。

⑴

用化學(xué)修飾增加與載體相反的電荷

例如用乙酰酐和琥珀酰酐作為酶的?；瘎?，酶經(jīng)?；笈c陰離子交換劑DEAE—纖維素結(jié)合。如此制備的固定化葡萄糖淀粉酶，55℃糖化可溶性淀粉，經(jīng)7.5小時(shí)，酶活力保留71％，而未經(jīng)?；墓潭ɑ福槐Ａ?7％的活力。

⑵

固定化酶與底物形成復(fù)合物

研究固定化多核苷酸磷酸化酶微環(huán)境對酶穩(wěn)定性的作用時(shí)，證明固定化酶與其反應(yīng)產(chǎn)物大分子核酸形成的復(fù)合物，對酶的穩(wěn)定性起很大的作用。

在實(shí)際工作中，經(jīng)常在固定化處理時(shí)，先將酶和底物結(jié)合，以酶－底物復(fù)合物的形式進(jìn)行，獲得的固定化酶的收率和穩(wěn)定性都有明顯改善。⑶添加隋性蛋白質(zhì)研究固定化葡萄糖氧化酶的穩(wěn)定性指出，在固定化過程中，以1：10(酶：Hb)的比例添加血紅蛋白，提高酶活性效果最為明顯，這可能是惰性蛋白質(zhì)提供了對酶更為有利的微環(huán)境之故。

⑷

增強(qiáng)載體凝膠多孔性和結(jié)構(gòu)有序性研究卡拉膠的結(jié)構(gòu)與其包埋的異構(gòu)酶熱穩(wěn)定性的關(guān)系時(shí)，發(fā)現(xiàn)含硫酸根多的卡拉膠，具有較好的孔隙性和結(jié)構(gòu)上的有序性。而這種有序性與酶對底物的親和力呈正相關(guān)。在制備固定化酶時(shí)，添加氨基葡萄糖，可提高膠的結(jié)構(gòu)有序性，同時(shí)得到了理想的酶穩(wěn)定性。

⑸

同時(shí)固定化能消除產(chǎn)物抑制的酶

葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖的產(chǎn)物之一為H202，易使該酶鈍化，若同時(shí)固定化葡萄糖氧化酶(GOD)和過氧化氫酶(Cat)，當(dāng)Cat／GOD為27時(shí)，固定化雙酶，使葡萄糖氧化酶半壽期延長了12倍。25℃連續(xù)使用36小時(shí)活力不變，半壽期達(dá)1155小時(shí)(約：，48天)。

CH5-3固定化酶反應(yīng)器

1.固定化酶反應(yīng)器類型

酶反應(yīng)器是以酶作為催化劑進(jìn)行反應(yīng)所需的設(shè)備。性能優(yōu)良的反應(yīng)器，可大大提高生產(chǎn)效率。酶反應(yīng)器的形式很多，根據(jù)進(jìn)料和出料方式，可概括為兩種類型：分批攪拌式反應(yīng)器(BR)與連續(xù)流式反應(yīng)器(CFR)。后者又有兩種基本形式：連續(xù)流攪拌桶(罐)反應(yīng)器(CST)、復(fù)合攪拌反應(yīng)器（CSR）、填充床反應(yīng)器(PR)和流化床反應(yīng)器（FBR）。CH5-3固定化酶反應(yīng)器

1.固定化酶反應(yīng)器類型

CH5-3固定化酶反應(yīng)器

1.固定化酶反應(yīng)器類型

⑴分批攪拌反應(yīng)器這類反應(yīng)器結(jié)構(gòu)簡單，不需特殊裝置，適于小規(guī)模試驗(yàn)。目前我國酶反應(yīng)器主要用這種形式的反應(yīng)器。用溶液酶或粗酶制劑催化時(shí)，酶一般不回收，待反應(yīng)轉(zhuǎn)化為一定程度后，直接加熱或用其它方法使酶失效除去。這種反應(yīng)器在工業(yè)生產(chǎn)中，很少采用固定化酶，因?yàn)樵诜磸?fù)過濾或離心回收過程中，容易造成酶失效損失。

⑵填充床反應(yīng)器這是當(dāng)前采用最多的一種反應(yīng)器形式。床內(nèi)通常