第8講-成體干細胞及組織工程學(xué)

成體干細胞及組織工程學(xué)臨床血液教研室1什么是成體干細胞？

（somaticstemcelloradultstemcells）指存在于分化組織中的未分化細胞，具有自我更新、構(gòu)建和補充相應(yīng)組織中各種類型細胞的潛能。成體干細胞存在于機體的各種組織器官中。2主要的成體干細胞：造血干細胞（hematopoieticstemcell,HSC）骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchymalstemcell,MSC）神經(jīng)干細胞（neuralstemcell,NSC）表皮干細胞（epidexmisstemcell,ESC）臍血干細胞（cordbloodstemcell）腫瘤干細胞（cancerstemcell）3CSCsandstemcellniche在腫瘤細胞中存在著小部分的腫瘤干細胞（cancerstemcells,CSCs），是腫瘤形成、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥的決定性原因和基礎(chǔ)。4成體干細胞來源：可能是胚胎細胞殘留于機體，并在干細胞微環(huán)境的作用下保持靜息狀態(tài)。存留的組織需要修復(fù)，便在特定微環(huán)境下被激活并分化成所需的細胞。5成體干細胞三大特征：自我更新種系定向分化能力：具有多能分化特性，能夠分化為特定組織的多種細胞類型，但分化潛能有限。在特定組織定居：大多數(shù)成體干細胞處于休眠狀態(tài)（G0期），病理因素或誘導(dǎo)后表現(xiàn)再生和更新能力，替代受損細胞或死亡細胞。

6胚胎干細胞與成體干細胞具有自我更新和分化形成任何類型細胞的能力，有形成完整個體的分化潛能?？煞只蔀槿?00多種細胞類型，進一步形成機體的所有組織、器官。胚胎干細胞——全能干細胞(totipotentstemcell)7多能干細胞能產(chǎn)生多種類型細胞的能力，但卻失去了發(fā)育成完整個體的能力，發(fā)育潛能受到一定的限制。單能干細胞只能向單一方向分化，產(chǎn)生一種類型的細胞。成體干細胞——多能干細胞(pluripotentstemcell)或單能干細胞(unipotentstemcell)8干細胞橫向分化（transdifferentiation）組織干細胞通過活化潛在的其他分化程序，改變了組織干細胞的特異性種系分化進程，可分化成其它組織細胞的能力。造血干細胞向非造血組織細胞分化、神經(jīng)干細胞向血液系統(tǒng)細胞分化9造血干細胞（HSC）胚胎期——定位于胎肝（Fetalliver,FL）成年哺乳動物——骨髓，外周血、臍帶血轉(zhuǎn)錄因子MLL（mixed-lineage-leukemiagene），RunX1，TEL/ETV6，SCL/Tal1，LMO2對胚胎期HSC分化發(fā)育有重要調(diào)節(jié)作用。

10HSC特性：HSC的更新與分化：采用不對稱的分裂方式：其中一個細胞仍然保持干細胞的一切生物特性，從而保持HSC數(shù)量相對穩(wěn)定，這就是干細胞自我更新。另一個則進一步增殖分化為各類血細胞、前體細胞和成熟血細胞，釋放到外周血中，執(zhí)行各自任務(wù)，直至衰老死亡，這一過程是不停地進行著的11多向分化潛能自我更新造血干細胞的分化：11造血干細胞微環(huán)境

血管周圍微環(huán)境、骨內(nèi)膜微環(huán)境：維持干細胞“干性”13造血干細胞的分離與鑒定人HSC表面標志物：CD34+、Lin-、c-kit+、sca-1+，Thy-1,IL-7Ra,Flt3,CD150。流式細胞分選技術(shù)，免疫磁珠分選。HSC的功能鑒定：致死劑量放射線照射動物，HSC移植可以重建骨髓的造血功能，長期（>16周）產(chǎn)生多系成熟血液細胞。

14骨髓間充質(zhì)干細胞(MSC)

主要從骨髓中分離，胎盤、脂肪組織、臍血和肝臟也存在MSC。人MSC標志物：CD73+、CD90+、CD105+、CD45-小鼠MSC標志物：Sca-1+、CD90+、CD45-

1516MSC在低血清培養(yǎng)基中具貼壁優(yōu)勢特性，定期換液除去不貼壁細胞，可純化及擴增MSC全骨髓法根據(jù)骨髓中各細胞成分比重的不同，分離單核細胞進行貼壁培養(yǎng)密度梯度離心法MSC的主要分離手段流式或磁珠分選后的細胞出現(xiàn)增殖緩慢，成本較高、技術(shù)難度較大，限制了這些方法的廣泛應(yīng)用流式細胞儀法、免疫磁珠法17向成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞等多種細胞分化MSC的分化骨髓中的多向分化干細胞（骨、軟骨、脂肪、肌細胞、心肌細胞、成纖維細胞、肝細胞）；容易獲得；體外擴增109倍仍不失多向分化潛能；外源基因容易插入；免疫原性較弱；常見的組織工程種子細胞18MSC的優(yōu)點肝干細胞的可能位置：位于Hering’s管區(qū)域內(nèi)，直接參與肝臟的生長和發(fā)育，同時也是肝細胞再生的重要細胞來源。HSC、臍帶血干細胞和MSC在一定培養(yǎng)條件下也可以向肝細胞分化。肝干細胞(hepaticstemcell)19角蛋白19(cytokeratin19,CK19)神經(jīng)細胞粘附分子(neuralcelladhesionmolecule，NCAM)上皮細胞粘附分子(EpCAM)claudin-3(CLDN-3)人肝干細胞特征性標志物20細胞因子：成纖維細胞生長因子2(FGF-2)、人activinA、肝細胞生長因子(HGF)、骨形成蛋白2(BMP2)化學(xué)誘導(dǎo)劑：DMSO、地塞米松(Dex)、丁酸鈉(NaB)、制瘤素(OSM)肝干細胞定向分化肝干細胞誘導(dǎo)分化因子21實例：2000年8月，日本筑波大學(xué)把鼠肝干細胞體外培養(yǎng)后，移植到肝功能衰竭的鼠肝中，40天后干細胞發(fā)育成新的肝組織，分泌出鼠肝特異清蛋白。肝干細胞定向分化221992年Reynolds和Weiss首先從成年小鼠的紋狀體和海馬中分離出NSC。1998年，Okano報道，成人腦室下區(qū)存在神經(jīng)干細胞。1999年，Johnasson證實，成年哺乳動物腦室管壁的室管膜細胞是神經(jīng)干細胞。1999年，Doetsch報道，成年哺乳動物腦內(nèi)室下區(qū)的星形膠質(zhì)細胞是神經(jīng)干細胞。神經(jīng)干細胞(NSC)NSC的可能位置23巢蛋白(nestin)：一個比較公認的神經(jīng)干細胞標志物。僅在胚胎早期神經(jīng)上皮表達，出生后停止表達。一旦神經(jīng)前體細胞分化即停止表達A2B5蛋白Vimentin膠質(zhì)細胞標志物(GFAP)等細胞表面抗原：CD133+/CD34-/CD45-；NSC的表面標志物24帕金森病(Parkinsondisease，PD)阿爾茲海默病(Alzheimerdisease，AD)亨廷頓病(Huntingtondisease，HD)25神經(jīng)干細胞的臨床應(yīng)用首都醫(yī)科大學(xué)附屬神經(jīng)外二科主任黃紅云等自2001年起在世界上率先開展流產(chǎn)胎（嬰）兒嗅鞘細胞(一種NSC)移植治療脊髓損傷。已經(jīng)治療近400例，部分完全性脊髓損傷患者恢復(fù)部分功能。26表皮干細胞(Skinstemcell,SSC)---SSC的來源或部位：

表皮干細胞：基底細胞毛囊干細胞：毛囊膨脹部位的真皮乳頭細胞團

27表皮干細胞---SSC特異生物標記：K4、K14角蛋白---SSC干性的體內(nèi)維持：整聯(lián)蛋白、鈣黏連蛋白將SSC與基底膜細胞強烈黏附，維持SSC在干細胞巢中附著，并維持其增殖與干性---SSC的分化：Wnt信號激活SSC增殖分化28表皮干細胞終生都在更新；體外培養(yǎng)表皮干細胞技術(shù)已經(jīng)非常成熟；治療的效果易于觀察，萬一發(fā)生不良反應(yīng)可方便地移去；表皮干細胞特點與優(yōu)勢291996，我國徐榮祥在燒傷創(chuàng)面上找到皮膚組織原位再生的原始細胞“角蛋白十九型皮膚干細胞”。并成功誘導(dǎo)其分化生成皮膚細胞，使受傷的皮膚得以迅速康復(fù)，實現(xiàn)人體器官原位再生，獲得美國專利。已經(jīng)成功應(yīng)用于遺傳性水皰病、大皰性表皮松懈癥的基因治療30組織工程（TissueEngineering）定義：應(yīng)用生命科學(xué)與工程學(xué)的原理與技術(shù)，在正確認識哺乳動物的正常及病理狀態(tài)下的組織結(jié)構(gòu)、功能關(guān)系的基礎(chǔ)上，研究、開發(fā)用于修復(fù)、維護、促進人體各種組織或器官損傷后的功能和形態(tài)的生物替代物的一門新興學(xué)科。31種子細胞支架材料和細胞外基質(zhì)細胞與材料的體外復(fù)合培養(yǎng)(細胞生長環(huán)境方式、應(yīng)力，材料改性等)體內(nèi)植入(材料生物相容度、降解與細胞功能的同步化、營養(yǎng)支持、血管生成等)檢測和管理臨床驗證產(chǎn)業(yè)化組織工程研究內(nèi)容32種子細胞：胚胎干細胞：存在倫理問題，來源不易。成體干細胞：易獲得，自身的成體干細胞沒有免疫原性。33體外途徑：從病人體內(nèi)獲取細胞，體外培養(yǎng)并導(dǎo)入目的基因后，重新輸入患者體內(nèi)。體內(nèi)途徑：直接將基因或攜帶目的基因的經(jīng)改造的病毒導(dǎo)入人體患病組織中。34干細胞定向分化的基因策略選擇安全、無毒、容易穿過細胞膜的基因載體，將治療基因?qū)爰毎麅?nèi)。理想載體的條件：易獲得高滴度的純品；能穩(wěn)定、高效地轉(zhuǎn)染體內(nèi)非增殖狀態(tài)的細胞；可以長期、穩(wěn)定地表達外源基因而不會引起細胞毒性、感染或免疫應(yīng)答；能特異地識別靶組織，在其中表達外源基因；35干細胞基因治療關(guān)鍵問題西班牙馬德里自治大學(xué)博爾納德教授和丹麥歐登塞大學(xué)醫(yī)院布瑞恩斯(CancerRes,2005):體外培育人體間充質(zhì)干細胞6-8周是安全的；超過4-5個月，這種干細胞會發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化；體外培養(yǎng)8個月、分裂了90-140代的人體間充質(zhì)干細胞移植至動物體內(nèi)后，發(fā)現(xiàn)“最老的”細胞發(fā)生了癌變。36轉(zhuǎn)基因干細胞安全性問題原因——端粒酶端粒酶有阻止端粒隨細胞分裂而逐漸縮短的作用，從而穩(wěn)定染色體的末端，在保持細胞“永生”性中起重要作用。干細胞的端粒酶基因活化，最終將其變成癌細胞。

37ECM——蛋白多糖、糖蛋白、膠原纖維ECM是細胞附著的基本框架和代謝場所，其形態(tài)和功能直接影響所構(gòu)成的組織形態(tài)和功能。理想的ECM應(yīng)具有以下特點①生物相容性好②有可吸收性③有可塑性④表面化學(xué)特性和表面微結(jié)構(gòu)利于細胞的粘附和生長⑤降解速率可根據(jù)不同細胞的組織再生速率而進行調(diào)整。38細胞外基質(zhì)的研究天然ECM：采用膠原制作人工皮膚和血管模型人工的ECM：聚乳酸、聚羥基乙酸、兩者的共聚物(PGA-PLA)、聚ρ-羥基丁酯(PHB)；聚乳酸-已內(nèi)酯的共聚物(PLC)、聚原酸酯、聚磷本酯、聚酸酐天然高分子與合成高分子的復(fù)合物，如膠原-PCA的復(fù)合物等有機材料與無機材料的復(fù)合物，如羥基磷灰石-甲殼素的復(fù)合物，羥基磷灰石-PLA的復(fù)合物等39細胞外基質(zhì)的研究——組織工程所應(yīng)用的材料制備干細胞，誘導(dǎo)定向分化；建立由細胞和可降解材料構(gòu)成的三維空間復(fù)合體；采用穩(wěn)定的培養(yǎng)系統(tǒng)，是工程組織維持長期的分化狀態(tài)。40組織工程(體外)實施的三大步驟組織相容性；材料降解與細胞功能發(fā)揮的同步化；代謝活動，營養(yǎng)來源，血管化過程及方式；與生長發(fā)育的關(guān)系，細胞的作用及轉(zhuǎn)歸，植入體的最終結(jié)局；體內(nèi)生物力學(xué)，免疫學(xué)；對藥物治療的反應(yīng)。41體內(nèi)植入研究42骨組織構(gòu)建構(gòu)建組織工程骨的方式有幾種①支架材料與成骨細胞；②支架材料與生長因子；③支架材料與成骨細胞加生長因子。一名7歲男孩沈某因車禍造成顱骨6×6厘米缺損；采用組織工程技術(shù)構(gòu)建的顱骨移植修復(fù)，經(jīng)4個月隨訪，這塊占顱骨總面積達1/6的組織工程化顱骨在人體內(nèi)穩(wěn)定存在，生長良好。43人工皮膚“Apligraf”已經(jīng)在美國面市；Organogenesis公司研制的與人類皮膚相同的Apligraf，是第一個獲得美國食品及藥物管理局(FDA)批準的人造組織。它最初用于治療腿部潰瘍，也可用于治療足部潰瘍和燒傷。44人工皮膚一種能夠使膝關(guān)節(jié)軟骨再生的產(chǎn)品已經(jīng)面市。已為一個男孩培養(yǎng)了一個胸廓，并在裸鼠身上制造出了人耳。45人工軟骨——人耳鼠2001.8.，德國杜塞尓多夫大學(xué)醫(yī)院施特勞尓教授等宣布：從心肌梗塞患者