目的基因的連接轉化refresh

實驗三、PCR產(chǎn)物的電泳、回收目的基因的連接、轉化

實驗內容1.PCR產(chǎn)物的電泳、回收；2.PCR產(chǎn)物與T載體的連接3.感受態(tài)細胞的制備；4.連接產(chǎn)物的轉化；5.鋪制LB培養(yǎng)平版；6.涂菌培養(yǎng)過夜。

實驗回顧RNA提取RT-PCR目的DNA片段質粒TA載體連接重組質粒目的DNA轉化無質粒的E.Coli

死亡有質粒的E.Coli

存活PCR平板篩選一、PCR產(chǎn)物的電泳及回收1）PCR產(chǎn)物電泳：

15ul產(chǎn)物+3ul上樣液

1%瓊脂糖凝膠，100伏，30分鐘。8:10~~9:20預期PCR電泳結果結合片子講切膠的問題

(不要切引物）2）

PCR產(chǎn)物的回收（擠膠法）

（1）在UV燈下，用手術刀片將含DNA片段的瓊脂糖凝膠切下，放入封口膜中；

（2）將切下來的膠塊，標記好姓名，-20℃冰箱中。（3）放在封口膜內直接擠壓，用加樣器吸取擠壓后得到的液體。1、凍融法：1）

在UV燈下，用手術刀片將含DNA片段的瓊脂糖凝膠切下,-70oC冷凍至少15min。2）

在65oC水浴中使膠融化，加入等倍體積TE-飽合酚,劇烈振蕩30秒鐘，然后-70oC冷凍15min。3）

室溫融化后，12,000rpm離心5min，將上層水相移至另一管中，用2.5倍體積乙醇和0.1倍體積3mol/LNaAc(pH5.2)沉淀、漂洗和干燥DNA。

常見回收方法介紹2、擠膠法

（1）在UV燈下，用手術刀片將含DNA片段的瓊脂糖凝膠切下，放入小離心管中；

（2）將切下來的膠塊，-70oC冷凍15min；

（3）放在封口膜內直接擠壓，用加樣器吸取擠壓后得到的液體。3、回收試劑盒（商業(yè)化）。1）

當回收的片段是用于與載體的連接，準確判斷回收片段的DNA含量是非常重要的。將回收得到的片段進行電泳分析，通過與DNAMarker條帶的比較，可以粗略判斷回收片段的量，為連接反應估計加入多少目的基因片段提供參考，可增加連接效率。2）如何在膠上估計DNA的含量：

DNAmarker參比法。（50ng/5ul）

電泳樣本：Marker5ul、T載體1ul、回收片段。電泳后通過判斷電泳樣品的亮度，大致判斷連接片段和載體的比例?；厥蘸箬b定二、PCR產(chǎn)物與T載體的連接

T載體一般是從公司購買的，因此，載體DNA的含量和濃度是已知的。連接反應成敗的關鍵是估計目的DNA的量?？砂聪铝信浞竭M行連接反應：回收的DNA片段7lT載體1lT4DNA連接酶buffer1lT4DNAligase1l終體積10l

輕彈管底混合，離心機甩一下，置25oC水浴1~2h。連接產(chǎn)物可以直接用于轉化，也可以置-20oC保存?zhèn)溆?。（低溫連接效果比室溫好）9:20~~9:45TA克隆原理

1、TagDNA

聚合酶的一個功能：使PCR產(chǎn)物的3`端突出一個A。3`

AA3`5`5`3`

TT3`5`5`2、商業(yè)設計的T載體：在3`端多出一個T。3、兩者的粘性末端可以互補配對。應用時避免反復凍融，防止T的斷裂丟失。如果與T載體連接后主要以自身環(huán)化為主，要考慮T可能已經(jīng)丟失。其他說明：1）

連接反應的關鍵是目的基因片段與載體的比例，一般片段與載體比例為2:1或3:1（摩爾比），根據(jù)片段大小決定比例。2）平端連接平端連接通常需要先將載體的5端磷酸去掉，然后再進行連接，這樣可以防止載體的自身環(huán)化。當載體的5端磷酸去掉后，片段與載體的連接就會留下一個缺口，連接酶由于載體5端缺乏磷酸而無法形成磷酸二酯鍵，轉化入細胞后，細胞內的酶會將缺乏的磷酸基團加上，再形成磷酸二酯鍵。

三、感受態(tài)細胞的制備9:45~10：45

感受態(tài)細胞制備原理

培養(yǎng)至對數(shù)生長期的大腸桿菌在低滲CaCl2

存在的情況下，細菌變得膨脹而易于外源基因的導入。另外，鈣離子溶液處理的細胞對外源DNA的攝取能力增強。說明：1）感受態(tài)細胞的膜已經(jīng)很脆，應該超低溫保存。

如果反復凍融會使細胞活力受影響，而且細胞膜的變化可能復原，由感受態(tài)細胞狀態(tài)回轉到普通細胞狀態(tài)，失去接受外源DNA的能力。2）無菌操作。在火焰附近操作，火焰附近是無菌區(qū)。各種器具均需消毒。無菌超凈工作臺

感受態(tài)細胞的制備1）將大腸桿菌在LB瓊脂培養(yǎng)基上劃線，置37oC12-16小時。2）

次日從瓊脂平板上取一單菌落，于2mlLB培養(yǎng)基中，37oC，225rpm速度震蕩培養(yǎng)12-16小時。3）

取1ml上述培養(yǎng)物接種于100mlLB培養(yǎng)基中，37oC，225rpm的速度震蕩培養(yǎng)直至OD值為0.5左右(約3小時)。

（上述1－3步驟已經(jīng)由實驗室完成）水浴搖床5）棄上清，除凈剩余液體，然后加入100ul

冰冷的100mmol/LCaCl2致敏液懸浮細胞，冰浴5分鐘。6）6000rpm，離心5分鐘，回收細胞，棄上清，加入100ul冰冷100mmol/LCaCl2溶液，懸浮細胞。7）4oC可保存1-2周；長期保存，可加甘油至終濃度為15%，置-70oC備用。（無菌操作）4）

取1ml菌液冰浴5min，然后6000rpm，離心5min，收集菌體。LB培養(yǎng)基瓊脂平板的制備蛋白胨：10g酵母提取物：5gNaCl：10g瓊脂：15g蒸餾水：800ml終體積：1L高壓滅菌20分鐘。學生操作：冷卻至50oC，加入抗生素。

鋪瓊脂平板10:45~~11:00下午實驗內容：1、連接產(chǎn)物的轉化2、平板篩選4、連接產(chǎn)物的轉化

1）將200l感受態(tài)細胞置冰上融化，然后加入3lDMSO,混合后，加入10l連接反應液(含重組質粒),

溫和混勻，置冰上10分鐘。

(目的：防止細胞被脹破。)

2）42oC，45秒，然后迅速放回冰中1-2分鐘。13:00~~14:3010l連接反應液一般可以進行2-3次轉化

3）加入1mlLB培養(yǎng)液，37oC，225rpm搖蕩培養(yǎng)30分鐘。4）6,000rpm，離心10秒鐘，倒掉上清，用剩余的約200lLB培養(yǎng)液重懸菌體。5）將殘存菌液輕輕混勻，鋪于含有氨基芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)板上涂勻，室溫放置5-10min，倒置于37℃孵箱中培養(yǎng)14-16小時。轉化后的平皿面朝下放置：防止水蒸氣形成的水滴影響細菌單菌落的形成。轉化菌的藍白篩選基本原理：載體中LacZ基因可編碼b-半乳糖苷酶，后者可分解培養(yǎng)物中的X-gal，使其呈